メラノーマ転移の新規メディエーターの同定のための堅牢な発見プラットフォーム

要約

この記事では、メラノーマ転移の新規候補メディエーターを試験するために使用される技術のワークフローとその作用機序について説明します。

要約

転移は複雑なプロセスであり、 インビトロ アッセイによって不完全にしかモデル化されない障壁を克服するために細胞を必要とする。メラノーマ転移における新規プレーヤーを同定するための、堅牢で再現性のある in vivo モデルおよび標準化された方法を使用して、体系的なワークフローが確立されました。このアプローチにより、特定の実験段階でのデータ推論が可能になり、転移における遺伝子の役割を正確に特徴付けることができます。モデルは、遺伝子組み換えメラノーマ細胞を心臓内、皮内、または皮下注射を介してマウスに導入し、続いて連続 インビボ イメージングでモニタリングすることによって確立される。予め確立されたエンドポイントに到達すると、原発性腫瘍および/または転移を有する器官が採取され、様々な分析のために処理される。腫瘍細胞を選別し、単一細胞RNAシーケンシングを含むいくつかの「オミックス」プラットフォームのいずれかに供することができる。臓器は、転移の全体的な負担を定量化し、その特定の解剖学的位置をマッピングするために、イメージングおよび免疫組織病理学的分析を受ける。生着、モニタリング、組織採取、処理、および分析のための標準化されたプロトコルを含むこの最適化されたパイプラインは、患者由来の短期培養物および様々な固形がんタイプの確立されたヒトおよびマウス細胞株に採用することができる。

概要

転移性黒色腫に関連する高い死亡率と、世界中で黒色腫の発生率の増加¹(2025年までに推定7.86%増加)が相まって、新しい治療アプローチが求められています。標的発見の進歩は、非常に複雑なプロセスである転移の再現可能なモデルにかかっています。転移性カスケードのステップ全体を通して、メラノーマ細胞は、免疫系の回避および遠隔組織のコロニー形成を達成するために無数の障壁を克服しなければならない²。メラノーマ細胞の回復力と適応性は、その高い遺伝子変異負荷³および神経堤起源を含む多数の要因から生じ、重要な表現型可塑性^3,4,5を付与する。各ステップにおいて、転写プログラムは、転移メラノーマ細胞が、免疫系⁶、細胞外環境^7,8、およびそれらが接触する物理的障壁⁹の細胞アーキテクチャを含む微小環境とのクロストークからの手がかりに基づいて、ある状態から別の状態に切り替えることを可能にする。例えば、メラノーマ細胞は、....

プロトコル

注:以下のプロトコルに関連する動物手順は、ニューヨーク大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。すべての手続きは、国際実験動物ケア評価認定協会(AAALAC)によって承認された施設で行われます。 図1は 、一般的な実験的アプローチを示しています。

1. 患者由来メラノーマ短期培養物(STC)

1. 1mLの完全RPMI(10%ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1x MEM非必須アミノ酸溶液、およびペニシリン(100IU/mL)/ストレプトマイシン(100μg/mL)を添加したRPMI 1640)を含む60mmペトリ皿に組織を置く。
   注:腫瘍細胞の比率を高めるには、必要に応じて、滅菌手術器具を使用して、顕微鏡下で、ペトリ皿内の腫瘍を取り囲む組織を解剖および除去する。
2. 滅菌したカミソリの刃を使って新鮮な組織を1〜2mmの立方体に細かく切ります。4 mLの完全RPMIおよびピペットを10 mL血清学的ピペットでプレートの内容物を5〜10回上下に加える。
3. 細胞懸濁液を15mLポリプロピレン円錐管に移し、細胞をスピンダウン(180×g、4°Cで5分間)する。上清を吸引し、細胞ペレットを1mLの新鮮な培地に再懸濁し、懸濁液を25cm2組織培養フラスコ....

結果

以下の図は、記載されたワークフローがメラノーマ転移の新規ドライバーの同定にどのように適用されたかを示す。 図2 は、 in vivo メラノーマ転移におけるフコシルトランスフェラーゼFUT8のサイレンシングの効果が研究された公表された研究の結果をまとめた^{ものである26}。簡単に言えば、ヒト患者のグリコミックデータ(レクチンアレイによっ.......

ディスカッション

このテクニカルレポートの目的は、メラノーマ転移における潜在的なアクターの調査のための標準化されたトップツーボトムのワークフローを提供することです。 in vivo 実験はコストと時間がかかる可能性があるため、効率を最大化し、得られる情報の価値を高める戦略が最優先事項です。

同じ実験内で調査結果をクロスバリデーションするために、全体を通し?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 Scapel Blade	WPI	500242	For surgical procedures
#3 Scapel Handle	WPI	500236	For surgical procedures
1 mL Tuberculin syringe, slip tip	BD	309626	Injections
10 mL syringe, slip tip	BD	301029	Perfusion
10% Formalin Sodium Buffered	EK Industries	4499-20L	For perfusion/tissue fixative
15 mL Conical	Corning	430052	Cell culture
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes	Falcon	352196	Cell culture
200 Proof Ethanol	Deacon Labs	04-355-223	Histology
22G – 22mm needle	BD	305156	Perfusion
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	J464G	Suture
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde	EMS	15733-10	For perfusion/tissue fixative
40µm	Corning	431750	Tissue processing
5-0 Absorbable Suture	Ethicon	6542000	Closure
50 mL Conical	Corning	430828	Cell culture
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes	Falcon	352070	Cell culture
7-0 Silk suture	FST	18020-70	Ligature
70µm	Corning	431751	Tissue processing
Anti-fade mounting media	Vector Labs	H-1000-10	Immunofluorescence
Approximator applying Forceps, 10cm	WPI	14189	For microsurgical procedures
Avance	Bruker	3 HD	NMR Console
Biospec 7030	Bruker	7030	Micro MRI
BSA	Bioreg	A941	NuMA Staining
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm	WPI	WP5025501	For microsurgical procedures
Coplin Staining Jar	Bel-Art	F44208-1000	Histology
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Immunofluorescence
dCas9-KRAB	Addgene	110820	Genetic manipulation
DNase I	NEB	M0303L	Tissue processing
DPBS	Corning	21-030-CM	Tissue processing
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade	GEM	62-0167	Tissue processing
Extracellular Matrix Substrate	Corning	354234	Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative
FBS	Cytiva	SH30910.03	Cell culture
Fiji Image J	Fiji Image J	Software	Immunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer	Thermo Fisher	A16104	NuMA Staining
Goat Serum	Gibco	PCN5000	Immunofluorescence
HBSS	Corning	21-020-CV	Tissue processing
Hematoxylin	Richard-Allan Scientific	7231	Histology
Illumina III	PerkinElmer	CLS136334	BLI Instrument
Insulin syringe 28G - 8mm needle	BD	329424	Injections
Insulin syringe 31G - 6mm needle	BD	326730	Injections
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated	WPI	504478	For perfusion and surgical procedures
Isoflurane USP	Covetrus	11695067772	Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip	WPI	WP6570	For microsurgical procedures
Ketamine HCl 100mg/mL	Mylan Ind.	1049007	Anesthesia
lentiCRISPRv2	Addgene	98290	Genetic manipulation
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649	Invitrogen	L32472	Vascular endothelial cells marker
MEM non-essential amino acids X 100	Corning	25-025-CI	Cell culture
Metzenbaum Scissors	WPI	503269	For surgical procedures
Microinjection Unit	KOPF	5000	Intracardiac injections
NaCl	Fisher	S25877	NuMA Staining
Needle 30G x 25mm	BD	305128	Intracardiac Injection
Needle 33G x 15mm	Hamilton	7747-01	Intracarotid Injection
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws	WPI	14137-G	For microsurgical procedures
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	Murine model
NU/J mice	The Jackson Laboratory	002019	Murine model
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human	Abcam	97585	NuMA Staining
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL	Gibco	15140122	Cell culture
Percoll	GE	0891-01	density separation solution
PI Classic Surgical Gloves	Cardinal Health	2D72PT75X	Surgery
pLKO Tet-On	Addgene	21915	Genetic manipulation
Povidone-Iodine 10% Solution	Medline	MDS093943	Surgery
Proparacaine Drops 0.5%	Akorn Pharma	AX0501	Opthalmic local anesthetic
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment	Dechra	83592	Anesthesia
Razor Blade Double Edge Blades	EMS	72000	Shaving and Vibrotome Brain Slicing
Reflex 9mm EZ Clip	Braintree	EZC- KIT	Wound closure
RPMI 1640	Corning	10-040-CM	Cell culture
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades	WPI	501235	For microsurgical procedures
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome	Leica	VT1200	Brain Slice Immunofluorescence
Single Channel Anesthesia Vaporizer System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Anesthesia
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower	EZ Systems	TT4000	CO2 Euthanasia
Sterile Fenestrated Disposable Drape	Medline	NON21002	Surgery
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves	Medline	DYNJP2715	Surgery
T25 Flask	Corning	430639	Cell culture
Tris	Corning	46-031-CM	NuMA Staining
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML	Immunofluorescence
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform	WPI	WP505210	For microsurgical procedures
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg	WPI	15911	For microsurgical procedures
Visiopharm	Visiopharm	Visiopharm	NuMA Staining Quantification Software
Xylasine 100mg/mL	Akorn Pharma	59399-111-50	Anesthesia
Xylene	Fisher	X3P-1GAL	Histology