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要約

このプロトコルは、サンプル収集、代謝産物抽出、液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析データ取得の概要、3Dモデル生成、および最後にデータ視覚化を含む、トリパノソマチド感染中の代謝産物分布の3Dモデルを生成する手順を説明する。

要約

病原体指向性および疾患指向性は、病原体によって選択的にコロニー形成または損傷を受けた組織位置を指し、局在性疾患症状をもたらす。ヒト感染性トリパノソマチド寄生虫には、シャーガス病の原因物質である トリパノソーマクルジ が含まれる。 トリパノソーマブルーセイ、 睡眠病の原因物質;リーシュマニア種、リー シュマニア 症の原因物質。共同で、彼らは世界中の2000万人に影響を与えます。これらの寄生虫は、心臓、食道、 T. cruzi の結腸、脂肪組織、膵臓、皮膚、 T. brucei の循環系および中枢神経系、皮膚指向性 リーシュマニア 株の皮膚、および内視向性 リーシュマニア 株の肝臓、脾臓、骨髄。したがって、トリパノソマチド病の病因を理解するためには、空間的視点が不可欠です。化学地図作成は、微生物学的および免疫学的パラメータと比較して、液体クロマトグラフィー - 質量分析 によって 生成された小分子の存在量の3D視覚化を生成する。このプロトコルは、体系的な組織サンプリングと代謝産物抽出から始まり、液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析データ取得、代謝産物分布の3Dマップの生成に続いて、トリパノソマチド感染中の病原性プロセスを研究するために化学地図作成をどのように適用できるかを示しています。この方法は、 T. cruzi、T. brucei 、または Leishmania による組織コロニー形成のための栄養所要量、感染部位での免疫代謝、局所組織代謝摂動と臨床疾患症状との関係など、複数の研究課題に使用でき、トリパノソーマチド病の病因を包括的に把握することができます。

概要

トリパノソマチド寄生虫は、リーシュマニア種、アフリカトリパノソーマ(トリパノソーマブルーセイ)、およびアメリカのトリパノソーマ(トリパノソーマクルジ)からなる。リーシュマニア原生動物は、自己治癒と自己限定的な局所的な皮膚リーシュマニア症、口、鼻、喉の粘膜組織が損傷する皮膚粘膜リーシュマニア症、発熱や肝脾腫を引き起こす内臓器官への寄生虫指向性を伴う内臓リーシュマニア症1,2が含まれます。T. bruceiは、主にアフリカ諸国で報告されている睡眠病としても知られるヒトアフリカトリパノソーマ症(HAT)を引き起こします3。臨床徴候および症状には、肝脾腫、発熱、頭痛、筋骨格痛、リンパ節症、および寄生虫が血流およびリンパ管に局在する血液リンパ段階における貧血が含まれる。これに続いて髄膜脳炎期が続き、寄生虫は中枢神経系に局在し、睡眠障害、行動変化、そして最終的には致命的な昏睡を引き起こします4。T. cruziは、アメリカ大陸に固有のシャーガス病を引き起こします。感染した個体は、初期の急性期、通常は無症候性、広範な寄生虫指向性を経験する。感染者の約10%〜30%は、巨食道、巨結腸、および心血管合併症を特徴とする数十年の感染後に慢性期の症状を経験する5,6。

メタボロミクスは、一次または二次代謝由来の生物学的化合物および薬物または食品由来分子などの外部由来化合物を含む小分子種(50〜1,500Da)を研究する。宿主-病原体相互作用の文脈において、メタボロミクスは、宿主に対する病原体の影響にアクセスする上で極めて重要な宿主代謝産物環境に対する感染の影響を探求することができる。また、宿主の栄養学的および免疫学的環境への病原体の適応を評価することもできる7,8,9。質量分析(MS)および核磁気共鳴(NMR)分光法は、代謝産物の同定、定量、および特性評価に使用される一般的なメタボロミクスツールです。この「オミックス」アプローチは、バイオマーカーの発見や医薬品開発にも適用できます10,11。

トリパノソマチド寄生虫の特定の組織指向性を考えると、空間メタボロミクス分析は、それらが引き起こす疾患の病因に関する重要な洞察を可能にすることができる。代謝産物の空間分布をマッピングすると、マウス心臓組織における慢性トリパノソーマ・クルジ感染およびマウス胃腸管における急性および長期のトリパノソーマ・クルジ感染によって局所的に影響を受ける代謝産物が明らかになった6,12,13。 具体的には、3D化学地図作成は、慢性的にトリパノソーマクルジ感染マウスの心臓組織における寄生虫の持続性と代謝変化との間の切断を実証した。代謝は心臓の下部および頂端セグメントで最も乱れ、シャーガス病症状(心臓頂端動脈瘤)の部位と一致した。特定の心臓部位での感染によって摂動され、疾患の重症度に相関する代謝産物ファミリーには、アシルカルニチンおよびグリセロホスホコリンが含まれる12,13,14。胃腸管では、持続的な代謝変化がシャーガス病症状の部位(食道および結腸)と一致した。対照的に、代謝は、小腸などのシャーガス病症状に関連しない部位で再正規化される。胃腸管における感染によって局所的に摂動される代謝産物には、アシルカルニチン、グリセロホスホコリン、キヌレニン、トリプトファン、およびコール酸が含まれる。さらに、これらの解析により、シャーガス病に対する耐性の新しい代謝機構の同定が可能になりました6。これらの方法を皮膚リーシュマニア症の研究に適用すると、病変部位における有意な代謝摂動が明らかになったが、病変に隣接する巨視的に健康な組織における特異的代謝変化も明らかになった。例えば、グルタミンは病変部位で枯渇したが、m/z(質量電荷比)200-299、400-499、500-599、および600-699のグリセロホスホコリンは病変部位で有意に増加した。PC(O-34:1)は病変隣接部位でのみ増加した15。

この原稿の目的は、トリパノソマチド寄生虫感染モデル(図1)に適用される代謝産物分布の3Dモデル(「化学地図作成」)を生成するために必要なステップを実証することです。このアプローチは、メタボロミクスとメタボロミクスのデータ処理、特にメタボロミクスデータを3Dモデルに簡単にプロットするための「iliソフトウェア」の開発におけるいくつかの重要な進歩に基づいています16。

プロトコル

記載されているすべての動物実験は、オクラホマ大学またはカリフォルニア大学サンディエゴ校の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。感染性物質を取り扱うすべてのステップは、バイオセーフティキャビネット(クラスII、タイプA2)内で、現地の規制に従って実施されました。

1. 組織採取

  1. 適切なトリパノソマチド感染動物モデル、一般にマウスまたはハムスターに感染する。
    注:トリパノソーマチド感染のためのマウスモデルのかなり多様があります, 生成される所望の症状に応じて, 疾患の進行の速度, 疾患の重症度, 等.ユーザーは自分の都合の良いときに選択できます。
    1. 皮膚リーシュマニア症感染モデルの場合、足蹠の皮下または耳の皮内15に感染する。
    2. 内臓リーシュマニア症感染モデルの場合、静脈内感染1,17。
    3. シャーガス病および睡眠病感染モデルの場合、腹腔内に感染する6,12,18,19。寄生虫株および計画された時点に基づいて使用する寄生虫用量を決定する。
  2. セクション化の位置を計画します。
    1. セクションあたり最低10mgの組織を含むセクションを生成することを計画します。30〜50mgを使用するのが最善です。
    2. シャーガス病感染モデルの場合、心臓および胃腸セグメントを体系的に収集することを計画します。
    3. 皮膚リーシュマニア症感染モデルの場合、病変組織および病変隣接サンプルを採取する。
    4. 内臓リーシュマニア症感染モデルの場合、脾臓および複数の肝葉を採取することを計画してください。脂肪組織などの追加の組織部位もまた、収集することが関心事であり得る。
      注意: 感染した動物からのサンプルは、施設で承認された適切なバイオセーフティプロトコルの下で取り扱わなければなりません。これには、一般に、個人用保護具(PPE)の要件と、チューブの開放とバイオセーフティキャビネット内のサンプルの収集(クラスII、タイプA2)のみが含まれます。
  3. 均質化のためにチューブにラベルを付け、計量します。
    1. 利用可能な均質化システムに適したチューブタイプを使用してください。ティッシュライザーの場合は、2 mLの微量遠心チューブを使用してください。
    2. 施設IACUCによって承認されたイソフルラン過剰摂取またはIACUC承認プロトコルに従って、所望の感染時点でマウスを安楽死させる。
    3. 組織を計画どおりに体系的に切除し、チューブごとに1つの切片を有する。
    4. サンプル間のサンプル収集装置は、抽出溶媒(このプロトコルでは50%メタノール)で洗浄することを忘れないでください。
  4. チューブの蓋を開けたままにして、すぐに液体窒素中の凍結サンプルをスナップします。
    警告: 窒素が膨張するにつれてチューブが爆発するのを防ぐために、チューブに入った液体窒素が完全に蒸発するまで、チューブを閉じないでください。皮膚が液体窒素と接触しないように適切な手順を踏んでください(チューブを保持するにはクライオ手袋と鉗子を使用してください)。安全フェイスシールドを着用してください。
  5. 目的のサンプルがすべて収集されるまで、チューブをドライアイスに保管します。
  6. 一時停止ポイント:抽出の準備が整うまで、サンプルを-80°Cで保管します。
  7. チューブの重量を計量して、組織サンプルの重量を決定します。スプレッドシートに記録します。
    1. 計量プロセス中にサンプルを凍結したままにする: チューブをドライアイスの上に置き、迅速に計量し、すぐにドライアイスに戻します。計量中にサンプルを解凍させないでください。

2. 代謝産物抽出

注:LC-MSグレードの液体および試薬のみを使用する必要があります。この方法は、参考文献20から適応された。

  1. 専用のガラス製品を使用して、すべての抽出溶媒(LC-MSグレードH2O、LC-MSグレードメタノール、4μMのスルファクロルピリダジンでスパイク、LC-MSグレードのジクロロメタン:メタノールに2μMのスルファクロルピリダジンをスパイク)を1Lガラス瓶に調製します。
    注:調製される体積は、サンプル50mgあたり500μLの水、サンプル50mgあたり4μMのスルファクロルピリダジンでスパイクされた500μLのメタノール、および1,000μLのプレチルドジクロロメタンを考慮して、サンプル重量に基づいて計算する必要があります:メタノールは、サンプル50mgあたり2μMのスルファクロルピリダジンでスパイクされ、ピペッティングの不正確さを可能にするために計算された体積を10%増加させます。抽出溶媒を4°Cで少なくとも一晩保存し、予備冷却する。
  2. 下記のステップに従って組織サンプルの水ベースの均質化を行う。
    1. ビーズディスペンサーを使用して、組織サンプルを含む2mL微量遠心チューブのそれぞれに1つの5mmステンレス鋼ビーズ( 材料表を参照)を追加します。チューブを氷の上に置いてください。
    2. LC-MSグレードのH2Oを含むブランクチューブを1本作成し、すべてのステップを経て抽出ブランクとして機能します。サンプル抽出からの平均H2O量を使用します。凍結組織サンプルに冷却LC-MSグレードH2Oを加える。
      1. ステップ1.7で計算されたサンプル重量を使用して、500μLの水/50mgのサンプルを加えて、水量を組織重量に正規化します。
        警告: バイオハザードサンプルを取り扱う場合は、機関が承認した適切なバイオセーフティプロトコルに引き続き従ってください。これには、一般に、個人用保護具(PPE)の要件と、バイオセーフティキャビネット(クラスII、タイプA2)内のみのチューブを開く必要があります。
    3. 組織ホモジナイザーを使用して、サンプルを 25 Hz の速度で 3 分間均質化します ( 材料表を参照)。
      1. 処理中に試薬がこぼれないように、チューブをしっかりと閉じてください。
    4. DNA抽出、qPCR、タンパク質ベースの分析、またはその他の分析(必要な場合)のために、ホモジナイゼーション容量の約1/10を収集します。DNA抽出実験を別の日に行う場合は、マイクロ遠心チューブまたは96ウェルプレート(回収量に応じて)に-80°Cで最大6ヶ月間保存します。より長い保存期間は可能かもしれませんが、テストされていません。
      1. Reference13に記載されているように、組織からの哺乳動物DNA抽出のための任意の標準的な市販キット(材料表を参照)を使用してDNA抽出を行う。DNA収量を定量し、抽出したDNAを-20°Cで保存する。 qPCRに許容されるDNA量と質は、3年後まで観察されています。
        注:この工程は、代謝産物抽出からの翌日に凍結ホモジネートに対して行うことができる。
      2. 参考文献13に記載されているように、抽出したDNAの180ngを用いてqPCRを行う。
        注:これは、前日に採取したDNAに対して、-20°Cで凍結して行うことができる。
        1. T. cruzi感染に関する研究の場合、寄生虫レベル21を定量するためにASTCGGCTGATCGTTTTCGAおよびAATTCCTCCAAGCAGCGGATAおよび宿主DNAレベルに正規化するための以下のプライマー:TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCAおよびCAGCAAGCATCTATGCACTTAGACCCC22(材料表を参照)。
          注: 推奨される qPCR サイクルは次のとおりです: 95 °C で 10 分間変性します。95 °C で 30 秒間、58 °C で 60 秒間、最後に 72 °C で 60 秒間 40 サイクルを実行します。利用可能なサーモサイクラーに対して適宜融解曲線解析を行う。ΔΔCt法23 を用いてデータを処理して、サンプリング部位間の相対寄生虫負荷を得る。絶対定量は、サンプル由来のΔΔCt値を、既知の量の寄生虫から生成され、感染していない組織サンプルにスパイクし、ステップ2.2〜2.2.4.1のように抽出された標準曲線と比較することによって得ることができる。
      3. 保存されたホモジネートに関する参考文献13に記載されているように、多重化サイトカインキットまたは標準的な市販のELISAキット(材料表を参照)を使用して、免疫応答のタンパク質ベースの特性評価を実行します。
    5. 代謝産物抽出のために500 μLのホモジナイズ容量の少なくとも半分を保存します。
  3. 水性代謝産物抽出を行う。
    注:溶媒の選択は、目的の代謝産物の化学的特性に基づいて適合させることができる。
    1. 4 μM のスルファクロルピリダジンでスパイクした氷冷 LC-MS グレードのメタノールをホモジネートに加え、水中の 2 μM のスルファクロルピリダジンで終濃度 50% のメタノールを達成します。
      警告: メタノールは可燃性で危険です。ヒュームフードやバイオセーフティキャビネット内での取り扱いなど、適切な安全手順を使用してください。
    2. 組織ホモジナイザーでサンプルを 25 Hz の速度で 3 分間ホモジナイズします。サンプルを 16,000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。
    3. 等量の上清を96ウェルプレートに集める。すべてのサンプルで結合されたメタノール+水の最小容量に一致する体積を選択します。これが水性画分である。
      1. -80°Cで残ったホモジネート水溶液の上澄み液をバックアップとして取っておく。
    4. 上清を回収しながら固体残渣を氷上に保管する。
    5. 水性抽出上清を乾燥するまで乾燥させる(〜3時間または一晩)。最高速度を使用し、加熱しないでください。
    6. 乾燥させた96ウェルプレートを-80°Cで凍結する。
  4. 有機代謝産物抽出を行う。
    注:溶媒の選択は、目的の代謝産物の化学的特性に基づいて適合させることができる。
    1. プレチルドジクロロメタンのサンプル50mgあたり1,000μL:2μMのスルファクロルピリダジンでスパイクしたメタノールをステップ2.3.4からの固体残渣に加える。
      警告: 溶剤を取り扱うときは、ヒュームフード内での流量の良い取り扱いなど、適切な安全手順を踏んでください。
    2. 組織ホモジナイザーでサンプルを 25 Hz の速度で 5 分間均質化します。サンプルを 16,000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。
    3. 等量の上清を96ウェルプレートに集める。ジクロロメタンの最小容量に一致する体積(メタノール、すべてのサンプルにわたって)を選択します。これが有機画分である。
    4. ペレットをバックアップとして-80°Cで保管する。残りの有機抽出液をバックアップとして-80°Cで保存する。有機抽出物をヒュームフードで一晩空気乾燥させる。
    5. 乾燥させた96ウェルプレートを-80°Cで凍結する。

3. LC-MSデータ取得

  1. 水性および有機抽出物をそれぞれ60μLの50%メタノール+2μMのスルファジメトキシンに再懸濁し、組み合わせる。10分間超音波処理する。その後、10分間遠心分離し、上清をきれいな96ウェルプレートに移した。ゾーンフリープレートシールでシールし、LCオートサンプラーにプレートを置きます。
    警告: 溶剤を取り扱うときは、ヒュームフード内での流量の良い取り扱いなど、適切な安全手順を踏んでください。
  2. 適切な移動相をLCシステムに接続します( 材料表を参照)。
    注:ポジティブモード逆相LCの場合、著者らは、移動相AとしてLC-MSグレードH2O + 0.1%ギ酸を推奨し、移動相BとしてLC-MSグレードアセトニトリル+ 0.1%ギ酸を0.5mL/minおよび7.5分のLC勾配で推奨する。推奨されるグラデーションステップは、参考文献6に記載されているとおりです:0-1分、2%B;1〜2.5分、98%Bへの線形増加;2.5-4.5分、98%Bで保持する。4.5-5.5分、2%Bへの線形減少;5.5-7.5分、2%Bで保持する。
  3. 計測器が汚れていないことを確認します。正と負の両方のモードでMSを較正します。
  4. 機器に適したMS性能評価を実行します。
  5. MS 実行シーケンスを作成します。
    1. 希釈シリーズで 2 つのブランク、2 つの標準 (6 ミックス)、および 5 つのプール品質管理 (QC) から始めて、2 μL の注入量から開始し、注入量を段階的に 30 μL に増やします。
    2. サンプルの順序をランダム化します。
    3. 12 サンプルごとに、ブランクを実行してから、プールされた QC を実行します。
  6. C8 LCカラム(粒径1.7 μm、細孔径100 Å、長さ50 x 2.1 mm×内径)を接続し、漏れや過度の背圧を監視します。機器の標準操作手順に従って問題を修正します。
  7. MS 実行シーケンスを開始し、データに依存する LC-MS/MS データを収集します。
    メモ:Q-Exactive Plus MS機器の場合、加熱エレクトロスプレーイオン化およびデータ依存MS2集録(トップ5)をポジティブモードで使用し、MS1の場合は70,000、MS2の場合は17,500の分解能、MS1の場合は1E6、MS2の場合は2E5のAGCターゲット、MS1とMS2の両方で最大ITは100 ms、MS1の場合は100-1500 m/z までのスキャン範囲を使用します。 1 m/z の MS2 絶縁ウィンドウ。シースガスを35、補助ガスを10、掃引ガスを0、スプレー電圧を3.8kV、キャピラリー温度を320°C、SレンズRFレベルを50、補助ガス温度を350°Cに設定します。
    1. データ品質の確認:初期ブランク(主要なピークがないことを確認する)、標準(予想されるピークと対称ピーク形状の存在を確認する)、およびQC(予想されるピーク、ピーク形状、および予想されるピーク強度の存在を確認する)を確認します。
    2. 実行シーケンス中に MS の実行を定期的に監視します。
  8. 実行が完了したら、データにインジェクションの欠落やその他のエラーがないか確認します。
  9. LC カラムは、製造元の推奨に従って保管してください。サンプルを取り出し、-80°Cで保存する。
  10. 生データをデータリポジトリにアップロードします。
    注: MassIVE (massive.ucsd.edu) は、代謝産物アノテーションの分子ネットワークへのダウンストリームリンクを有効にするために推奨されます24,25。

4. LC-MSデータ処理

  1. MSConvert26 を使用して、生ファイルをオープン形式 (.mzXML または .mzML) に変換します。
    1. 生データと mzXML または mzML データをデータリポジトリにアップロードします。
  2. 特徴テーブルを生成します。これを行うには複数のツールがあります(MZmine、MS-DIAL、openMS、XCMSなど27,28,29,30)。
    注:MZmineは無料でオープンソースであり、MSconvert後にmzXMLファイルを直接インポートでき、データを処理してパラメータ選択の影響を監視するためのグラフィカルユーザーインターフェイスオプションを備え、分子ネットワークのためにGNPSに直接エクスポートできるため、推奨されます24。
    メモ: ツールのマニュアルに従って、使用可能な計測器に適したパラメータを使用してください。その他の詳細については、参考文献31も記載されています。
    1. フィーチャ テーブルを.csv形式でエクスポートします。

5.3D モデル生成

  1. 手描きの3Dモデルde novoは、下記の手順に従ってスケーリングします。
    1. 目的の臓器の写真を撮ります。
    2. 下記のように、SketchUp ソフトウェア ( 材料表を参照) で以下を実行します。
      1. ソフトウェアが開いたときに表示される男性のデフォルトの画像を削除します。
      2. [ ファイル>インポート] をクリックして、目的の臓器の画像をインポートします。
      3. ラインツールをクリックし、フリーハンドオプションを選択します。鉛筆ツールを使用して、目的の臓器の輪郭をトレースして描画します。始点までずっと引いて線を閉じます。線が正常に閉じられると、描画された領域は自動的に陰影付きで表示されます。
      4. プッシュ/プルツールを選択し、シェーディング領域をプルアップして、図面を 2D から 3D に変換します。
      5. 臓器画像を削除する: 消しゴム ボタンを選択し、画像を右クリックして [消去]を選択します。
      6. ファイルを .dae 形式でエクスポートします: ファイル> 3D モデル>エクスポートします。
    3. 下記の手順に従って、モデルのリアリズムを向上させます。
      1. モデルを MeshLab ソフトウェアにインポートする( 材料表を参照):MeshLab を開き、「 ファイル」>「メッシュをインポート」を選択します。前の手順で生成された .dae モデルを選択します。 プレオープンオプション メニューがポップアップ表示されます。[ OK] を選択します。
      2. トップメニューの「ワイヤフレーム」を選択します。次に、「再メッシュ、単純化、再構築>フィルタ」を選択し、サブディビジョンサーフェス>「中間点」を選択します。すべての値をデフォルトのままにし、[適用] を 2 回選択します。モデルのワイヤフレームビューを視覚的に検査して、細かくグリッド化されていることを確認します。ポップアップメニューを閉じます。
      3. モデルを .stl 形式でエクスポートする: [ファイル] > [メッシュのエクスポート方法] を選択し、[ファイルの種類] ドロップダウン メニューで [STL ファイル形式] (*.stl) を選択します。「保存」をクリックします。次のポップアップメニューで「OK」を選択します。
      4. メッシュミキサーソフトウェアを開きます(材料表を参照)。インポート(+)ボタンをクリックします。前の手順で生成された .stl ファイルを選択します。「スカルプト>ブラシ」>「ドラッグ」ツールと「スカルプトブラシ」>「膨張」ツールを使用して、丸め>必要があるモデルの表面を引き出します。
      5. モデルが目的の外観になったら、.stl形式で保存します: ファイル>エクスポート。ファイルに必要に応じて名前を付け、[名前を付けて保存] ドロップダウン メニューで [STL バイナリ形式] (*.stl) を選択します。「 保存」をクリックします。ポップアップメニューが表示されたら、[ 続行]をクリックします。

6. 'iliプロット生成

  1. サンプリング サイトに対応する 3D モデル内の位置の座標を取得します。
    1. MeshLab ソフトウェアのステップ 5.1.3.5 の 3D モデルを開きます: ファイル>メッシュのインポート。ステップ 5.1.3.5 で生成されたモデルを選択します。[オープン後の処理]ポップアップウィンドウで[OK]をクリックします。
    2. 各サンプリング スポットの X、Y、Z 座標を取得するには、[ピックポイント] ツールを選択し、3D モデル サーフェス全体で一定の間隔で右クリックします。必要な座標がすべて選択されたら、[フォーム]ポップアップウィンドウの一番上の[保存]ボタンをクリックします。
      注: これにより、座標が .pp ファイル形式でエクスポートされます。このファイルは表計算ソフトで開くことができます。
    3. 表計算ソフトの場合: ステップ 6.1.2 で生成された .pp ファイルを開きます。「区切り 文字で区切られた列へのデータ>テキスト」を使用してデータ表示>調整します。[ 次へ]をクリックし、[ スペース]を選択して [完了]をクリックします。
    4. スプレッドシートのセルに数値のみが残るように書式を変更するには、「ホーム」>「検索」&「置換を選択」>選択します。[検索対象] ボックスに「y=」と入力します。[置換対象] ボックスは空のままにします。[すべて置換]をクリックし、[OK]をクリックします。x=" と z=" と " /> について繰り返します。これで、ステップ 6.2 の値の準備が整いました。
  2. 'ili 機能テーブルを作成します。この方法は、参考文献16から適応された。
    1. 表計算ソフトで、フィーチャーテーブルを作成します。行は各位置に対応し、列はデータに対応します。
      メモ: 最初の列は位置名 (サンプル名) でなければならず、その後にステップ 6.1.2 で取得したサンプリングスポットの x、y、z 座標 (列ヘッダー x、y、z) が続く必要があります。5 番目の列のタイトルは "radius" にする必要があります。
    2. 適切なメタデータと代謝産物の特徴の豊富さをスプレッドシートの後続の列に貼り付けます。
    3. 列「半径」に、モデル上で視覚化するサンプリングスポットの希望サイズを入力します。半径の値を経験的に決定する: デフォルトとして 1 を入力し、手順 6.3 で半径または座標を調整する必要があるかどうかを評価します。ファイルを.csv形式 (ファイル>名前を付けて保存) で保存し、ドロップダウン メニューで CSV (コンマ区切り) (*.csv) を選択します。必要に応じてファイルに名前を付けます。「 保存」をクリックします。
  3. 'ili(によって開発されたソフトウェア)でデータを開きます。
    1. 'iliのウェブサイト(ili.embl.de)を開きます。 「サーフェス」(Surface) を選択します。作成した3Dモデルをブラウザウィンドウにドラッグアンドドロップします。作成したフィーチャーテーブルを同じブラウザウィンドウにドラッグアンドドロップします。
    2. 右下隅の凡例を使用して、目的のデータ列を 3D モデルに投影します。手順 6.2.1 で選択したスポットと半径がサンプリング サイトと一致していることを確認します。必要に応じて、フィーチャテーブルの値を調整するか、MeshLab で追加の座標を選択します (手順 6.1.2 を参照)。
      メモ: ビジュアライゼーションは、「スポット」 >「境界線の不透明度」 を選択し、スライダーを最大値に設定することによっても改善できます。
    3. 各データ列を連続して選択して、3D モデル上のこの代謝産物フィーチャの分布を評価します。
      注: このアプローチは、外部の統計分析ツールで決定されたように、p <が 0.05 のものや、感染したサンプルと感染していないサンプルの間で特定のフォールド変化があるものなど、関心のある特定の代謝産物の特徴のみを視覚化するためにも使用できます。視覚化する特徴は、ランダムフォレストなどの機械学習アプローチを通じて'iliの外側に選択することもできます。
  4. 以下の手順に従って、線形/ログデータの視覚化を実行します。
    1. ページの右上にある「マッピング」タブを使用して、「スケール」ドロップダウンメニューの「線形」または「対数」を選択します。
    2. 複数のフィーチャを視覚化する場合は、すべてのプロットに同じスケールを設定します。
      注: Web サイトでは、表示する各データ列の最小値と最大値が自動的に選択されます。
    3. スケールを手動で設定するには、「 自動最小/最大」 オプションの選択を解除し、目的のスケーリングを入力します。すべてのデータが同じ縮尺で表示されるようになりました。
  5. データのカラースケール(グレースケール、青 - 白 - 赤など)を変更します。
    1. カラーマップドロップダウンメニューを使用して、 マッピング メニューでカラースケールを目的の 配色 に変更します。選択した配色が色覚異常に優しいことを確認します。
  6. 3D モデルの色または背景色を変更するには、3D メニューの 「カラー 」オプションと 「背景」 オプションを使用します。
  7. 3D 軸を非表示にするには、3D メニュー の下にある「原点を表示」 ボックスの選択を解除します。
  8. スクリーンショット、スニッピングツール、またはショートカットキーCrtl + S(WindowsまたはLinuxの場合はCrtl + S、 figure-protocol-13662OS Xの場合は+ S)を使用して画像を保存します。

結果

得られる代謝産物特徴の数は、分析された組織タイプおよびデータ処理パラメータに依存する。例えば、このプロトコルは、T. cruzi感染のマウスモデルにおける胃腸管代謝物に対するT. cruzi感染の空間的影響を分析するために使用されている。 以前の研究では、雄のC3H/HeJに1,000 CL + luc T. cruzi寄生虫を腹腔内に注射した32,6。動物を感染後12または89日目に安楽死させ、胃腸管の13の連続したセグメントの化学地図作成分析を、このプロトコールに記載されるように実施した。この分析により、5,502 個のフィーチャのフィーチャ テーブルが作成され、このプロトコルで説明されている手順を使用して 3D に視覚化されました。このアプローチにより、寄生虫負荷の高い部位(キヌレニン、図2B対寄生虫負荷、図2A)、組織領域間で分布が異なる代謝産物(グルタミン、図2C)、および小腸および大腸で同等のレベルで見られる代謝産物の特徴(LPE 16:0 図2D)の個々の動物の代謝産物の特徴を視覚化することができます。 ).キヌレニンが可視化のために選択されたのは、炎症との既知の関係およびキヌレニン由来代謝産物がT. cruzi負荷を調節する能力に関する以前の出版物のためである33。ランダムフォレストベースの機械学習モデルは、キヌレニンレベルと感染状態との関連を以前に明らかにしていました6。グルタミンは、インビトロでのグルタミン利用能とT. cruzi薬物感受性との関係を実証する以前の出版物に基づく可視化のために選択された34。微分分布はロジスティック回帰を用いて確認し、p<0.05とした。LPE 16:0は、組織部位全体で同等のレベルで見出された代謝産物の特徴を発見するために、データの目視検査の後に選択された。

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図1:プロトコルの概要 イラストは BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-1519
図2:化学地図作成分析 雄のC3H/HeJマウスに、1,000個のCL+luc T. cruzi 寄生虫を腹腔内に注射した32。動物を感染後12または89日目に安楽死させ、胃腸管を採取し、体系的に切片化した(ステップ1)6。ステップ2のように代謝産物を抽出し、LC-MS/MSで解析し.3D SketchUpソフトウェアを用いてモデル生成を行い(ステップ5)、ステップ6と同様にデータを3Dでプロットした。(a)特定のマウスにおける寄生虫分布、感染後12日目。(b)同じマウスにおけるキヌレニン代謝産物分布、感染後12日目。(c)感染マウス全体にわたる平均グルタミン分布、感染後89日目。(D) 2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(LPE 16:0)と注釈が付けられた m/z 454.292保持時間2.929分の同等のレベルを、小腸および結腸のAおよびBと同じマウスで投与した。サンプルおよびデータは6で生成された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

トリパノソマチド感染症を理解することは、新規医薬品の開発および治療アプローチを導くために不可欠である。この化学地図作成法は、代謝とトリパノソマチド病因との関係に関する実用的な洞察を提供し、この翻訳ニーズに対処する独自の態勢を整えています。

バックグラウンド汚染を軽減するために、代謝産物抽出およびMS分析中にLC-MSグレードの溶媒のみが推奨されます。一般にパラフィンフィルムおよび/または他のプラスチックに由来するポリマー汚染3536、37、38は、可能な限り避けなければならない。特にパラフィルムは絶対に使用しないでください。LC-MSデータの品質は、サンプル調製および代謝産物抽出に使用される材料に依存するため、これらの側面は非常に重要です。データ品質は、'iliプロットを生成する前に保証する必要があります。さらに、これらの包括的な空間メタボロミクスマップを生成するには、これらのマップのギャップを避けるために、隣接するすべての組織サンプルの収集と、収集されたすべてのサンプルからの代謝産物抽出が必要です。したがって、収集手順、代謝産物抽出およびLC-MS分析のロジスティクス、およびコストを考慮し、それに応じて計画する必要があります。

このプロトコルは、複数の方法でユーザーのニーズを満たすように変更できます。例えば、代謝産物抽出時に使用される溶媒の極性と溶解度は、検出される代謝産物に影響します39。標的としない化学地図作成分析で検出された代謝産物の特徴の多様性を最大限に高めるには、複数の抽出ステップと溶媒を組み合わせることをお勧めします。例えば、ジクロロメタン、メタノール、水を抽出溶媒として利用するのは、非極性分子や極性分子の正確な検出が可能だからです20,40。しかし、これらの溶媒はすべてのMS実験に普遍的に適しているわけではなく、研究者はプロジェクトの目標に基づいて抽出溶媒を選択する必要があります。同様に、逆相クロマトグラフィーを順相クロマトグラフィーに置き換えるなど、異なる LC-MS/MS 条件を使用できます。代替カラムは、C8 クロマトグラフィーの代わりに逆相データ収集にも使用できますが、経験的には、C8 クロマトグラフィーは組織脂質に対してより堅牢であり、目詰まり頻度が低くなります。概念的には、これらのプロトコルは、ガスクロマトグラフィー−質量分析などの他の質量分析方法にも適用することができる。

別のアプローチは、質量分析イメージングである。実際、質量分析イメージングアプローチとは異なり、液体クロマトグラフィー-質量分析は本質的に空間情報を保存しません10。化学地図作成は、プロジェクトの概念化時、サンプルメタデータ、およびデータ処理ステップでサンプリング場所を含めることによって、このギャップを埋めます。この化学地図作成アプローチの強みは、質量分析イメージングとは異なり、アプリケーションの大部分が注釈のためだけに正確な質量に依存する質量分析イメージングとは異なり、信頼性の高い注釈(Metabolomics Standards Initiativeレベル1またはレベル2の注釈信頼度41)を提供できることです。質量分析イメージングは、時には単一細胞レベル(例えば、42,43)まで、きめ細かい空間マッピングを可能にする。対照的に、化学地図作成アプローチは、高度に専門化された全動物凍結切断スキルを必要とせずに、代謝産物分布の大規模な臓器間マッピングを可能にする。化学地図作成は、開発中の多くの空間トランスクリプトームアプローチ(例えば、44)に補完的な証拠を提供し、「表現型に最も近いオミクス層」に焦点を当てるという利点がある45。寄生虫負荷定量の代替方法には、試料採取時の生物発光の測定6が含まれる。微細なセグメントを収集して、共焦点または電子顕微鏡で局所的な寄生虫の負担と組織損傷を評価することもできます。このプロトコールおよび先行刊行物13でサイトカイン定量に使用される水ホモジネートは、組織損傷のタンパク質ベースのマーカーを定量するためにも使用することができる。

また、得られたLC-MSデータをプロットするのに適した3Dモデルを取得するには、複数の方法があります。ここで提案されている方法に加えて、モデルはさまざまなオンラインベンダーから事前に購入できます。利用規約が意図した使用法と一致していることを確認してください (特に公開に関する)。大型臓器のモデルは、スキャナの指示に従って3Dスキャナを使用してde novoを生成することができます。化学地図作成用の3Dモデルを生成および視覚化するためのMATLABなどの代替手段は存在しますが46、それらは主に'ili16の開発前に実装されていました。MATLABは、多くの分野にわたる多種多様なアプリケーションを提供するデータ分析およびプログラミングツールスイートです。ただし、MATLAB はフリーでもオープンソースでもなく、特に MATLAB が質量分析データを処理するために開発されていないことを考慮すると、MATLAB インターフェイスに精通している必要があります。この提案された方法の代替案、すなわち、SketchUp、Meshlab、および'iliは、自由にアクセスでき、ユーザーフレンドリーであり、化学地図作成の目的でMATLABと同様の機能を提供する。

この方法は、サンプル調製および代謝産物抽出に関して堅牢である。トラブルシューティングは、ほとんどの場合、LC-MSデータ集録ステップで必要です。これはこの記事の範囲外です。読者は、LC-MSデータ収集のトラブルシューティングに関する優れた出版物(20,47を含む)に導かれます。同様に、代謝産物アノテーションの複雑さは、3Dモデル生成に焦点を当てたこの方法の範囲を超えています。このトピックに関する有用な参考文献には、24,25,48,49が含まれます。

この方法は疾患の病因を効果的に探求するが、このアプローチには限界があり、その一部はあらゆるメタボロミクス実験に共通している。そのような制限の1つは、LC-MS機能50のアノテーション率が低いことであり、これは参照スペクトルライブラリの可用性と品質に左右されます。さらなる制限は、RNAlaterなどのRNA保存試薬とLC-MS/MS分析との不適合性のために、このプロトコルがmRNAを保存しないことです。しかし、タンパク質の品質は下流の分析には十分であり、したがってmRNAベースの分析を置き換えることができます。

感染の病因に対する化学地図作成アプローチは、細菌性、ウイルス性、または寄生虫性感染症が臓器系でどのように発症し、限局性疾患を引き起こすかを直接反映します。これらの地域サブサンプルを分析し、3Dモデルを生成することで、最終的に代謝産物が3次元空間にわたってどのように機能するかがわかり、分子生物学のこれまで認識されていなかったこれらの空間次元に光が当てられます。このプロトコールを用いて、例えば、代謝産物局在化を、トリパノソーマ・クルジ寄生虫負荷と比較した。その結果、病原体と宿主組織との関係が明らかになり、シャーガス病症状の進行の代謝ダイナミクスも実証されました6。化学地図作成法は、人間が構築した環境相互作用51,52,53、人間の皮膚や肺54などの臓器系の化学的構成44、植物の代謝と環境相互作用55など、さまざまなトピックにも適用されています。将来の応用には、局所的な疾患耐性および回復力、またはトリパノソマチド感染を超えたモデルにおける局所代謝産物レベル、病原体指向性、および疾患指向性の関係を評価することが含まれる可能性がある。このアプローチはまた、現在の薬物動態プロトコルを拡大し、局所組織薬物レベルと薬物代謝と全体的な代謝状況、組織損傷、および病原体クリアランスとの関係を評価するために、幅広い適用性を有するべきである。全体として、化学地図作成は、疾患の病因、ヒトの健康、ヒトと環境の相互作用、および微生物の動態を含むアプリケーションを使用して、様々なサンプルタイプにおける代謝産物分布のユニークな探査を可能にする。

開示事項

報告する利益相反はありません。

謝辞

Laura-Isobel McCall博士は、Burroughs Wellcome FundからInvestigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Awardを受賞しています。著者らはさらに、NIH賞番号R21AI148886、NIH賞番号P20GM103648のオクラホマ呼吸器感染症センター(OCRID)からのパイロット助成金、およびオクラホマ大学からのスタートアップ資金(LIMへの支援)に感謝したいと考えている。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも資金提供者の公式見解を表すものではありません。著者はまた、このプロトコルで使用されるツールの開発者に感謝したいと思います。該当する場合は、関連するすべての出版物が引用されています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Eppendorf tubesNANAany brand, as available
1 L bottle, pyrexNANAany brand, as available
1 L graduated cylinder, pyrexNANAany brand, as available
2 mL SafeLock Eppendorf tubesVWR20901-540use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased)NANAas appropriate for system under investigation
5 mm stainless steel beadQiagen69989
96 well plateFisher3252449
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primerNANAany brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
analytical balanceNANAany brand, as available
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primerNANAany brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacityNANAany brand, as available
biosafety cabinetNANAclass II, type A2; any brand, as available
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG
ACCCC primer		NANAany brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
cameraNANAany brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol
chemiluminescent-capable imaging systemNANAany system, as available
cotton ballsNANAany brand, as available
cryoglovesVWR97008-208replace with any brand, as available
dissection scissorsNANAany brand, as available
dry iceNANAany brand, as available
extra-length forcepsNANAany brand, as available
flammable-grade refrigeratorNANAany brand, as available
freezer storage boxes for microcentrifuge tubesNANAany brand, as available
fume hoodNANAany brand, as available
high-resolution mass spectrometerNANAany brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030)
ice bucketNANAany brand, as available
ili softwareili.embl.deNA
isofluraneCovetrus29405
large tupperwareNANAany brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball
LC-MS grade acetonitrileFisher OptimaA955-4
LC-MS grade dicholoromethaneFisher OptimaD151-4
LC-MS grade formic acidFisher OptimaA11750
LC-MS grade methanolFisher OptimaA456-4
LC-MS grade waterFisher OptimaW64
liquid chromatography columnPhenomenex00B-4499-ANmay be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridgePhenomenexAJ0-8784may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge holderPhenomenexAJ0-9000may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid nitrogenNANAany brand, as available
luciferinGoldbioLUCK-1G
MeshLab softwarehttps://www.meshlab.net/NA
Meshmixer softwarehttps://www.meshmixer.com/NA
MS calibrantNANAappropriate one for available instrument
MS data processing softwareNANAmultiple options available; authors recommend MZmine
MSConvert softwarehttp://proteowizard.sourceforge.net/NA
NanodropThermoFisherND-ONE-Wother nanodrop models are also suitable
p1000 pipet tipsNANAuse the appropriate brand to fit available pipettors
p1000 pipettorNANAany brand, as available
p20 pipette tipsNANAuse the appropriate brand to fit available pipettors
p20 pipettorNANAany brand, as available
p200 pipette tipsNANAuse the appropriate brand to fit available pipettors
p200 pipettorNANAany brand, as available
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield)NANAany brand, as available
Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex)Quansys biosciences110949MScan replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps)ZymoD4069replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available
real-time thermocyclerNANAany brand, as available
salt shaker or tea infuserNANAany brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin
SketchUp softwarehttps://www.sketchup.com/NA
specimen forcepsNANAany brand, as available
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacityNANAany brand, as available
spreadsheet softwarehttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excelNAcan replace with other spreadsheet management software, as applicable
sulfachloropyridazineSigmaS9882-100G
sulfadimethoxineSigmaS7007-10G
Sybr green qPCR reaction mixFisherA25780can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired
TCCCTCTCATCAGTTCTAT
GGCCCA primer		NANAany brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
tissue homogenizerNANAany brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982
tissue samplesNANAfrom appropriate infection model
TissueLyser single-bead dispenserQiagen69965
UHPLCNANAany brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV)
ultra-low temperature freezer (-80)NANAany brand, as available
ultrasonic bathNANAany system, as available
wet iceNANAany brand, as available
zone-free sealing filmVWR 490007-390

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