マウスの神経因性疼痛の改良温存神経損傷手術モデル

要約

この修正手術は、マウスまたはラットの温存神経損傷モデルのための簡略化された方法であり、一般的な腓骨神経と腓骨神経の両方を損傷するために1回の結紮と1回の切断のみが必要です。

要約

Spared nerve injury (SNI) は、末梢神経損傷の主要な症状を模倣した動物モデルで、マウスとラットの神経因性疼痛の分子的および細胞的メカニズムを研究しています。現在、SNIモデルには2種類あり、本研究ではSNIと定義する総腓骨神経と脛骨神経を無傷の腓骨神経で切断して結紮するものと、本研究ではSNItと定義する総腓骨神経と腓腹神経を無傷で切断して結紮するモデルがあります。腓腹神経は純粋に感覚神経であるのに対し、脛骨神経には運動線維と感覚線維の両方が含まれているため、SNItモデルはSNIsモデルよりも運動障害がはるかに少ないです。従来のSNItマウスモデルでは、総腓骨神経と腓腹神経を別々に切断して結紮します。ここでは、修正されたSNIt手術法が説明されています 一般的な腓骨神経と腓腹神経の両方を損傷します 1回の結紮と1回の切断で 短い処置時間で、これにより実行が容易になり、坐骨神経または脛骨神経を伸ばす潜在的なリスクが軽減され、従来のSNItモデルと同様の機械的過敏症が生じます。

概要

手術や外傷後の神経損傷による神経障害性疼痛は、生活の質を損なう大きな経済的負担を伴います。脊髄神経結紮術(SNL)¹、坐骨神経の慢性狭窄損傷(CCI)²、部分的な坐骨神経結紮術(pSNL)³、坐骨神経取引(SNT)⁴、予備神経損傷(SNI)^5,6,7,8を含む多くの神経損傷モデルが、ラットとマウスの末梢神経損傷の主要な症状を模倣するために開発され、分子的および細胞的メカニズムを研究しました。神経因性疼痛 6,7,8,9,10.ただし、各手術モデルには利点と制限があるため、手術モデル¹⁰の探索と開発には特に注意を払う必要があります。

げっ歯類のSNIモデルは、機械的刺激に対して長期的な過敏症を引き起こします。ただし、2つの異なるSNIモデルがあるため、やや混乱します。最初のSNIモデルはウルフの研究室で開発され、総腓骨神経と脛骨神経が損傷し、腓腹神経が無傷のまま残されました^5,6。2番目のSNIモデルはバスバウムの研究室で開発され、総腓骨神経と腓腹神経が損傷し、脛骨神経は無傷のまま残されました^7,8。最初のウルフのモデルは、ここでは腓腹神経が無傷のままであるためSNIと定義され、バスバウムのモデルは脛骨神経が無傷のままであるため、ここではSNItと定義されています。腓腹神経は純粋に感覚神経であるのに対し、脛骨神経には運動線維と感覚線維の両方が含まれているため、SNItモデルはSNIsモデルよりも運動障害がはるかに少ないです。ただし、SNIsモデルとは異なり、SNItモデルのマウスは熱過敏症を発症しませんが、両方のモデルで機械的過敏症を発症します。SNItモデルは比較的簡単な手順ですが、腓腹神経と総腓骨神経を別々に結紮する必要があり、坐骨神経または脛骨神経を伸ばす潜在的なリスクがあります6,7,8,9。

総腓骨神経、脛骨神経、および腓腹神経は坐骨神経の3つの枝であり、腓腹筋の上端で明確に識別できます(図1):脛骨神経は腓腹筋の下にあり、総腓骨神経(頭側)と腓腹神経(尾側)は腓腹筋¹¹の上にあります.その解剖学的特徴に基づいて、一般的な腓骨神経と腓腹神経を結紮する改良マウスSNIt手術手順が開発されました。また、神経結紮と神経切断が1つだけであるため、処置時間が短縮されます。

プロトコル

動物実験は、UCSFのInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認され、NIHの実験動物の世話と使用に関するガイドに従って実施されました。この研究では、体重20〜30 gの成体C57BL / 6マウスを使用しました。フォン・フレイの評価は、午後1時から午後3時の間に行われました。

1.麻酔とマウスの準備

1. マウスをO₂ に2%イソフルランを充填したプラスチックチャンバーに、1.0 L / minの流速でマウスを置き、完全に麻酔します。
2. 脱脂綿のアプリケーターを使用して眼科用軟膏で目を覆います。
3. マウスの鼻を柔軟なノーズコーンに入れ、外科的処置全体を通して2%のイソフルランが流れます。
4. マウスを右横の位置に置きます。膝を曲げた状態で左足を上に保ち、粘着テープで固定します。
5. 太ももと膝周りの毛を電動シェーバーと脱毛クリームで取り除きます。2%クロルヘキシジンと70%アルコールで皮膚を消毒します。
6. 手術前に十分な麻酔深度を確保するには、ピンセットを標準装備して後肢や尻尾のつまみ刺激に対する反応がないことをテストしてください。マウスに熱サポートを提供します。
   注: 局所麻酔薬と NSAID は SNIt¹² 後の神経因性疼痛行動を大幅に減少させるため、SNIt モデルの実行前後に局所麻酔薬または NSAID は使用されませんでした。

2. 修正SN手術

1. 水平線の最初の1/3から始まり、垂直線から約30°の角度で膝を横切る水平線の最初の30cmの切開部をメスで切ります(図2A)。
2. 皮膚切開部を分離した後、大腿二頭筋(BFM)の下に2本の白い線が視覚化でき、内側(頭側)の太い線を大腿骨、外側(尾側)の細い線を坐骨神経として見ることができます(図2B)。
3. 湾曲したマイクロ鉗子とマイクロハサミで尾側の白い線に沿ってBFMを鈍く解剖し、坐骨神経を露出させます。鈍的解剖中の血管損傷を避けてください。偶発的な血管の損傷が発生した場合は、滅菌綿棒を使用して血液を吸収し、適切な圧力を加えて出血を止めます。
4. 腓腹筋の上端にある坐骨神経から3つの枝を区別します。脛骨神経は腓腹筋の下を通る最大の直径を持つ神経であり、腓腹神経(外側、最小直径)と総腓骨神経(内側)は腓腹筋の上を走っています(図2C および 図3A)。
5. BFMの解剖方法と開き方に応じて、総腓骨神経を脛骨神経の外側(図2C)または内側(図3A)として視覚化します。
6. 湾曲マイクロ鉗子を使用して、総腓骨神経と腓腹神経を隣接する組織から分離します。
7. 総腓骨神経と腓骨神経を 6-0 縫合糸で結紮します。これは、両方の神経が腓腹筋の上を走っていますが、脛骨神経は腓腹筋の下を通過します (図 2D および 図 3B、C)。タイトな結紮糸に続く手足の収縮を観察します。従来の方法では、一般的な腓骨神経と腓腹神経を別々に結紮します。
8. 結紮から2〜4mm以内の遠位部分で神経をマイクロハサミで切断します。手術全体を通して脛骨神経が触れられていないことを確認してください。従来の方法では、結紮から2〜4 mm以内の遠位部分で総腓骨神経と腓腹神経を切断し、2 mmの切片を別々に取り除きます。
9. 6-0シルク縫合糸で筋肉層を閉じ、創傷クリップで皮膚切開を閉じます。
10. 手術後、麻酔から完全に回復するまでマウスを動物室に戻します。無傷の切開、通常の食物摂取、水分摂取、全身の状態、定期的な動き、グルーミングについて毎日チェックしてください。手術後7〜14日で創傷クリップを取り外します。

3. フォン・フレイの機械的閾値の評価

1. マウスを試験室の環境と試験材料に6日間順応させて、von-Frey評価を実施します。マウスを高い金網グリッド上の透明なプラスチックシリンダーに1時間慣れさせます。各シリンダーの間に白い紙を置き、各実験動物からの視覚的な手がかりを防ぎます。
2. この期間中、2日ごとに順応を行い、最後の順応後の後足の中央足底下にあるフォンフレイモノフィラメントのベースラインを測定します。
3. ブラインドテスターでフォン・フレイ評価を実行します。アップダウンパラダイム¹³を使用して、フォンフレイフィラメントで後足の中央足底を刺激します。フォンフレイフィラメントを足底面に垂直に塗布し、力を加えてわずかにカールさせます。
4. 突然の足の引きこもり、突然ひるむ、または突然の足を舐めるなどの肯定的な反応を確認します。前の刺激の影響を避けるために、5秒間隔で次の刺激を行使します。
5. 平均3回のセッションを行うことで、足ごとの機械的な閾値を確認します。
6. アップダウン法で決定された50%の後肢離脱閾値に基づいて、0.16gフィラメントによるパーセント応答法を使用して、差をさらに評価します。
7. 反応に関係なく、後足の足底中央部に適用された 0.16 g フィラメントの 10 回の刺激後の陽性反応の割合を記録します。
8. von Frey 評価は、手術前 1 日目と、手術後 1、3、5、7、14 日目に実施します。

4. 統計分析

1. 正規分布の連続データを平均の平均±平均の標準誤差 (SEM) として報告します。2テールt検定または二元配置反復測度ANOVAを使用して連続データを分析します。統計分析ソフトウェアを使用して、 p < 0.05 のレベルで統計的有意性を持つすべてのデータを処理します。

結果

修正された方法と従来の方法の間の処置時間の比較。
皮膚の切断開始から皮膚の閉鎖終了までの処置時間は、修正アプローチで5匹、従来アプローチで5匹のマウスでそれぞれ記録されました。統計的に有意な結果を得るために、最小限の動物を使用しました。SNItを実行するための従来のアプローチ^7,14の制御...

ディスカッション

一般的な腓骨神経と腓腹神経^を別々に結紮する従来のマウスSNIt法6,7,8,9と比較して、修正されたSNItモデルには3つの利点があります:(1)坐骨神経または脛骨神経を収縮または伸ばすリスクが少ない。(2)総腓骨神経と腓腹神経を一緒に結紮することにより、遠位神経断端が近?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 suture	Henry Schein	9007482	Nerve ligation and close the muscular layer
Iris Scissors	Integra Miltex	12460598	Cut muscle and fascia
Mayo dissecting scissors	Fisherbrand	895120	Cut skin incision
Micro forcep	Fisherbrand	16100110	Blunt dissection biceps femoris muscle
Micro Scissors	Excelta	17467496	Cut nerve
Microdissection Forceps	Fisherbrand	16100123	Separate the common peroneal and the sural nerves from the neighboring tissues
Needle Holder	Fisherbrand	8966	Hold 6-0 needle
Prism software	Graph Pad	version 8.0	Statistical analysis software
Wound clips	Roboz Surgical	NC1878744	Close skin incision