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要約

このプロトコルは、マウス上頸部および星状神経節の解剖、細胞解離、凍結保存、核単離、ハッシュタグバーコーディングなど、単一核シーケンシングのための詳細で低入力のサンプル調製について説明しています。

要約

心臓自律神経系は、心拍数や心収縮などの心機能を制御する上で重要であり、交感神経と副交感神経の枝に分かれています。通常、恒常性を維持するためにこれら2つの枝の間にはバランスがあります。しかし、心筋梗塞、心不全、高血圧などの心臓病状態は、心臓神経支配に関与する細胞のリモデリングを誘導する可能性があり、これは有害な臨床転帰と関連している。

心臓自律神経系の組織学的構造と機能に関する膨大な量のデータがあるが、健康と疾患におけるその分子生物学的構造は、依然として多くの面で謎めいている。単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)などの新しい技術は、単一細胞分解能での組織の遺伝的特性評価に有望です。しかしながら、ニューロンのサイズが比較的大きいことは、これらの技術の標準化された使用を妨げる可能性がある。ここで、このプロトコルは、液滴ベースの単一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)を利用し、健康および疾患における心臓交感神経ニューロンの生物学的アーキテクチャを特徴付ける方法である。段階的なアプローチは、成体マウスから解剖された両側上頸部(SCG)および星状神経節(StG)のsnRNA-seqを行うことが実証される。

この方法により、長期間のサンプル保存が可能となり、短期間に複数の個人/実験からのサンプルを一度に採取できない場合でも、適切なRNA品質を維持できます。ハッシュタグオリゴ(HTO)で核をバーコードすることで、シーケンシング後の個別の神経節サンプルの多重化解除とトレースバックが可能になります。その後の解析により、交感神経節のニューロン、衛星グリア、および内皮細胞の核捕捉が成功し、snRNA-seqによって検証された。要約すると、このプロトコルは、交感神経外因性心核のsnRNA-seqに対する段階的なアプローチを提供し、他の器官および組織の神経支配の研究においてより広範な適用の可能性を有する方法である。

概要

自律神経系(ANS)は、環境条件や病態への適応を含む身体の恒常性を維持する末梢神経系の重要な部分です1。これは、心臓血管系、呼吸器系、消化器系、および内分泌系などの全身の複数の臓器系の調節に関与しています。ANSは交感神経と副交感神経の枝に分かれています。交感神経系の脊髄枝は、交感神経鎖の神経節においてシナプスし、傍椎体の位置で両側に位置する。両側頸部および胸部神経節、特にStGは、心臓交感神経支配に関与する重要な構成要素である。心臓虚血などの疾患状態では、ニューロンリモデリングが起こり得、交感神経オーバードライブ2をもたらす。ニューロンリモデリングは、ヒトおよびいくつかの他の動物種における複数の組織学的研究において実証されている3、4、5、6。心臓交感神経節における心臓虚血誘発ニューロンリモデリングの詳細な生物学的特徴付けは現在欠如しており、心臓交感神経系(SNS)内の特殊なニューロン細胞型またはサブタイプの基本的な生物学的特徴は、健康および疾患においてまだ完全には決定されていない7。

scRNA-seqなどの新しい技術は、単一細胞レベルでの小組織の遺伝的特徴付けのためのゲートウェイを開いた8,9。しかしながら、ニューロンのサイズが比較的大きいことは、ヒトにおけるこれらの単一細胞技術の最適化された使用を妨げる可能性がある10。さらに、単一細胞シーケンシングでは、シーケンシングプロセスにおける高い損失のために十分な細胞数を回復するために、高スループットの細胞が必要です。これは、1 回のセッションで捕捉するのが難しく、シーケンシングに十分な単一細胞を導入するために複数のサンプルを必要とする小さな組織を研究する場合、困難になる場合があります。最近開発された液滴ベースのsnRNA-seq技術(すなわち、10倍クロムプラットフォーム)は、単一核間の生物学的差異の研究を可能にする11,12。snRNA-seqは、エマルジョン中のゲルビーズ(GEM)では捕捉できない可能性のある大型細胞(>30μm)に対してscRNA-seqよりも優位に立つだけでなく、広範な解離および/または長期保存との適合性も向上しています13,14,15。

不均一性、神経細胞の数、および心臓SNSにおいて富化された他の細胞は、健康および疾患状態におけるANSの特性評価にとって重要な側面である。さらに、各交感神経節による臓器特異的または領域特異的な神経支配は、SNSの複雑さに寄与する。さらに、交感神経連鎖の子宮頸部、星状、および胸部神経節は、心臓の異なる領域を神経支配することが示されている16。そのため、個々の神経節に由来する神経節細胞の単一核解析を行い、その生物学的構造を研究する必要がある。

液滴ベースのsnRNA-seqは、プレートベースのシーケンシングプラットフォームよりも低コストで、一度に複数のサンプルからの数千の細胞のプールのトランスクリプトーム全体の発現プロファイリングを可能にします。このアプローチにより、液滴ベースのsnRNA-seqは、SCGおよびStG内の細胞の細胞表現型分類および新しい亜集団同定により適しており、特に、このプロトコルは、交感神経外因性心核の同定、単離、および単一核RNAシーケンシングのための簡潔な段階的アプローチを提供し、他の関連器官および組織を神経支配する神経節の特性評価の研究において幅広い応用の可能性を秘めた方法を提供する。 健康と病気。

プロトコル

このプロトコルは、マウス子宮頸部および/または子宮頸部胸部(星状)神経節のsnRNA-seqに必要なすべてのステップを記述する。雌雄のC57BL/6Jマウス(15週齢、性別毎にn=2)を用いた。さらに1匹のWnt1-Cre;mT/mGマウスを用いて、解剖目的で神経節を視覚化した17,18。この追加のマウスは、B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/JマウスとB6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/Jマウスの交配によって生成されました。すべての動物実験は、NIHが発行し、ライデン大学の動物倫理委員会によって承認された実験動物の世話と使用のためのガイド(ライセンス番号AVD1160020185325、ライデン、オランダ)に従って実施されました。プロトコルで使用されるすべての材料、機器、ソフトウェア、および動物の詳細については、材料表を参照してください。

1. 準備

メモ: すべての手順は、細胞培養フローキャビネットで実行されます。

  1. 鉗子とはさみを70%エタノールに20分間浸してきれいにします。
  2. B-27プラス(1x)、L-グルタミン(2mM)、および1%抗生物質-抗真菌剤を添加した神経基礎培地からなる神経節培地を調製する。神経節培地を室温で予温する。
  3. 消化液を調製する:0.25%トリプシン-EDTA(1:1)および1,400U/mLコラゲナーゼ2型を神経節培地に溶解した。
  4. 核単離のために、新鮮で冷たい(4°C)細胞洗浄緩衝液(0.4%ウシ血清アルブミン[BSA])および溶解緩衝液(10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mMMgCl2、および0.1%ノニオン界面活性剤、ヌクレアーゼフリー水中の40U/mL RNAse)を調製する。
  5. 核洗浄バッファー(2.0% BSAおよび0.2U/μL RNase Inhibitorを含む1xリン酸緩衝生理食塩水[PBS])を調製します。
  6. ST染色バッファー(ST-SB)(ヌクレアーゼフリー水で10 mM Tris-HCl、146 mM NaCl、21 mM MgCl 2、1 mM CaCl2、2% BSA、0.02% Tween-20)を調製する。

2. 成体マウス上頸部神経節(SCG)の解剖

  1. マウスを安楽死させ、氷の上に保ちます。
    注:現在の研究では、合計4匹のC57BL6/JマウスがCO2 窒息によって安楽死させられた。あるいは、イソフルランは、他の研究目的のために大量の血液を採取する必要がある場合に、放血に続いて使用することができる。
  2. マウスをピンで解剖ボードに固定し、毛皮の分散を最小限に抑えるために70%エタノールで使用してください(シェービングは必要ありません)。
  3. 実体顕微鏡下で、はさみで正中線を切って頸部領域の皮膚を開き、顎下腺を脇に動かし、胸骨筋を除去して総頸動脈とその分岐部を露出させ、位置を特定する(図1A、B、矢印参照)。
  4. 左右の頸動脈分岐部とそれに付着した組織を解剖する。各解剖した組織片を、冷たいPBSを含む別々の3.5cmのペトリ皿に移す。
  5. 頸動脈分岐部に取り付けられているSCGを探します。シャーレ内の動脈および他の付着組織を除去することによって、SCGをさらに洗浄する(図1E)。

3. 成体マウス星状神経節(StG)の解剖

  1. StGを解剖するには、腹部に正中線を切断し、続いて横隔膜と腹側胸壁を開きます。
  2. 心臓と肺を取り除き、背側胸郭を露出させます。第1の肋骨のレベルで筋大腸ロンガス(MCL)の前外側の左右のStGを探します(図1C、D、破線で示されています)。
  3. 左右両方のStGを鉗子で解剖し、冷たいPBSを含む3.5cmのペトリ皿に別々に移します(図1F)。
    ​

4. マウス神経節細胞の単離と凍結保存

ステップ 4 ~ 6 を図 2 にまとめます。

  1. 個々のSCGおよびStGをすべて慎重に移し、鉗子で1.5mLの微量遠心チューブを分離します。
    注:神経節はプラスチック製のピペットチップの壁に付着しやすいため、ピペットチップを使用しないでください。
  2. 各微量遠心チューブに500 μLの0.25%トリプシン-EDTA溶液を加え、37°Cの振とう水浴中で40分間インキュベートする。
    注:この工程は、コラゲナーゼ2型溶液中でのその後の消化および細胞放出を促進することを目的としている。
  3. 各サンプルについて5 mLの神経節培地を含む15 mLチューブを調製する。神経節が微量遠心チューブの底に落ち着くのを許します。神経節細胞をほとんど含まない上清を収集し、その上清を調製した15mLチューブに移し、各チューブに標識する。あるいは、ある程度の時間を節約するために、解離した細胞がごくわずかしか検出できないように、トリプシン-EDTA上清を収集せずに吸引する。
    注:少量のトリプシン-EDTA溶液(〜10〜30μL)を微量遠心チューブに残して、神経節の除去を避けることができます。このステップでのピペッティングは、神経節を損傷し、その後の神経節細胞の低出力につながる可能性があるため、避けてください。
  4. 各微量遠心チューブに500μLのコラゲナーゼ2型溶液を加え、37°Cの振とう水浴中で35〜40分間インキュベートする。35分後に神経節を再中断してみてください。神経節がまだ無傷であり、解離しない場合は、インキュベーション時間を延長するか、必要に応じてコラゲナーゼ2型溶液の濃度を増加させる。
    注:孵化時間は神経節の大きさによって異なる場合があります。
  5. コラゲナーゼ溶液に神経節を再懸濁するには、上下にピペッティングするか、組織凝集塊が検出されなくなるまでピペッティングします。
  6. 細胞懸濁液を、同じ神経節からの神経節培養培地およびトリプシン−EDTA懸濁液を含む以前に使用した15mLチューブに移す。細胞懸濁液をスイングバケットローター遠心分離機で10分間スピンダウンし、室温で300× g である。細胞上清を慎重に廃棄する。
    注:神経節細胞は単一の神経節から解離しているため、細胞ペレットは小さすぎて目で検出できないことがあります。少量の上清をチューブ内に残して、細胞ペレットの偶発的な除去を避けることができます。
  7. 神経節細胞を270 μLのウシ胎児血清(FBS、低エンドトキシン)に再懸濁し、各細胞-FBS懸濁液を1mLのクライオビアルに移す。
  8. 細胞を計数するには、5 μLの神経節細胞懸濁液を5 μLの0.4%トリパンブルー色素と混合し、混合物を血球計数器にロードする。顕微鏡下で総細胞数と生細胞数をカウントする。
    注:この解離プロトコルでは、細胞生存率(生細胞数/総細胞数=生存率%)は通常90%を超えています。単一の神経節(SCGまたはStGのいずれか)の生細胞数は、神経節が12〜16週齢のマウスから単離された場合、通常9,000〜60,000細胞の範囲内に収まる。
  9. クライオバイアル中の各細胞-FBS懸濁液に30μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加え、よく混合し、クライオバイアルを室温に保たれた細胞凍結容器に移す。クライオビア装填容器を-80°Cで一晩保存し、翌日にクライオビアを液体窒素に移し、シークエンシング前に長時間保存した。

5. 核の分離

注:4匹のマウスから単離した左右のSCG(計8サンプル)を、以下の核単離およびシークエンシング調製において例として使用した。手順全体を通してすべてを氷の上に保ちます。小さな核ペレットは見えないため、手順全体を通して上清の除去を容易にするために、スイングバケツを備えた遠心分離機を強くお勧めします。

  1. ストレーナー(30 μm)を上に付けた15 mLチューブを準備し、1 mLの神経節培地でストレーナーを予備すすいでください。
  2. 液体窒素からクライオバイアルを取り出し、直ちに37°Cの水浴中で解凍する。 氷の小さなペレットがクライオバイアルに残ったら、クライオバイアルを水浴から取り出します。
  3. 手で注意深く振盪しながら各クライオビアに1mLの神経節培地を滴下して神経節細胞を回収する。 オプション: 細胞回収率を評価するには、ステップ 4.8 で説明するように、回収後に細胞懸濁液を混合し、生細胞計数のために 5 μL の細胞懸濁液を取り出します。
  4. 各神経節細胞懸濁液を別々のストレーナー(ステップ5.1で調製)にロードし、各ストレーナーを4〜5mLの神経節培地ですすいでください。
  5. 緊張した細胞懸濁液を300 × gで5分間遠心分離し、上清を慎重に除去し、細胞を50 μLの細胞洗浄バッファーに再懸濁する。
  6. 細胞懸濁液を低結合DNA/RNA 0.5 mL微量遠心管に移す。
  7. 細胞懸濁液を500× g で4°Cで5分間遠心分離する。
  8. 細胞ペレットが脱落しないように、チューブの底に触れずに45μLの上清を除去します。
  9. 45 μLのチルド溶解バッファーを加え、200 μLのピペットチップを使用して優しくピペットを上下させます。
  10. 細胞を氷上で8分間インキュベートする。
  11. 各チューブに50 μLの冷たい核洗浄バッファーを加える。 混ぜないでください。
  12. 核懸濁液を600× g で4°Cで5分間遠心分離する。
  13. 核ペレットを破壊せずに95μLの上清を除去する。
  14. 45 μLの冷却核洗浄バッファーをペレットに加える。 オプション:5 μLの核懸濁液を採取し、5 μLの0.4%トリパンブルーと混合してカウントし、血球計数器で顕微鏡下で核の品質を確認します。
  15. 核懸濁液を600 × g で4°Cで5分間遠心分離する。
  16. 核ペレットが外れないように、チューブの底に触れずに上清を取り除きます。

6. ハッシュタグオリゴ(HTO)と多重化による中核バーコード

注:HTO染色ステップは、Gaublommeらによる皮質組織における以前の適用に従って、非常に少量の(神経節)核の核標識のために修正および最適化された15。

  1. 50 μLのST-SBバッファーを核ペレットに加え、核が完全に再懸濁されるまで8~10回ピペットで静かにピペットする。
  2. ST-SB/核ミックス50 μLあたり5 μLのFcブロッキング試薬を加え、氷上で10分間インキュベートします。
  3. ST-SB/nuclei mixのチューブあたり1 μL(0.5 μg)の単一核ハッシュタグ抗体を加え、氷上で30分間インキュベートします。
    注:インキュベーション時間が短いほど、代表的な結果に示されているように、ハッシュタグラベリングの効率が低下します。
  4. 各チューブに100 μLのST-SBを加える。 混ぜないでください。
  5. 核懸濁液を4°Cで5分間、600× g で遠心分離する。
  6. 核ペレットを破壊せずに145μLの上清を除去する。
  7. 手順 6.4 と 6.5 を繰り返します。核ペレットが外れないように、チューブの底に触れずに上清をできるだけ取り除きます。
  8. 核ペレットを50μLのST-SBに再懸濁し、核を穏やかに混合する。
  9. 5 μLの核懸濁液を採取し、5 μLの0.4%トリパンブルーと混合して顕微鏡下で核を計数する。トリパンブルーと混合し、血球計数器に装填した核の代表的な画像については 、図3A を参照されたい。
  10. 核懸濁液を4°Cで600× g で5分間遠心分離する。
  11. ST-SBに核を再懸濁し、対応する核数に従って各サンプルについて1,000~3,000核/μLの目標核濃度を達成する。
  12. サンプルをプールして、必要な数のセルを達成します。
    注:例えば、この実験では、8つのサンプルを均等にプールして合計25,000個の核を達成し、その後すぐに10倍のゲノミクスクロムおよびsnRNA-seqに進む。核数は、通常、神経節が12〜16週齢のマウスから単離された場合、6,000〜40,000細胞の範囲内に収まる。ロードされた全核の約半分のみが液滴ベースのsnRNA-seqによって捕捉され得る。例えば、25,000核混合物を調製して、さらなるライブラリー調製およびシーケンシングに必要とされる10,000核を確実に捕捉した。

結果

単一核cDNAライブラリー調製およびsnRNA-seqの品質管理解析
代表的な結果は、25,000読み取り/核遺伝子発現ライブラリと5,000読み取り/核ハッシュタグライブラリを備えた単一のプール内の10,000個の捕捉された核のシーケンシング結果を記述します。 図3B は、バイオアナライザーで確認した1本鎖 cDNA、遺伝子発現(GEX)ライブラリー、及びHTOライブラリー...

ディスカッション

ここでは、i)成体マウス上頸部および星状交感神経節の解剖、ii)神経節細胞の単離および凍結保存、iii)核単離、およびiv)多重化目的のためのHTO標識およびsnRNA-seqによる核バーコードに焦点を当てた詳細なプロトコルが記載されている。

このプロトコールにより、交感神経節細胞は、一般的に使用されるトリプシンおよびコラゲナーゼを用いて個々の神経節を解離させる?...

開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

Susan L. Kloet(オランダ、ライデン、LUMC、人間遺伝学部)の実験設計と有益な議論への彼女の助けに感謝します。我々は、Emile J. de Meijer(オランダ、ライデン、LUMC、ヒト遺伝学部)に対し、単一核RNA単離およびシーケンシングのためのライブラリー調製の支援に感謝する。この研究はオランダ科学研究機構(NWO)[016.196.346 to M.R.M.J.]の支援を受けています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals and reagents
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
0.4% trypan blue dyeBio-Rad1450021
Antibiotic-AntimycoticGibco15240096
B-27GibcoA3582801
Collagenase type 2WorthingtonLS004176use 1,400 U/mL
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich67685
Ethanol absolute ≥99.5%VWRVWRC83813.360
Fetal bovine serum (low endotoxin)BiowestS1810-500
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030024
Neurobasal MediumGibco21103049
Bovine Serum Albumin 10%Sigma-AldrichA1595-50MLCell wash buffer
DPBS (Ca2+, Mg2+free)Gibco14190-169Cell wash buffer
Magnesium Chloride Solution, 1 MSigma-AldrichM1028Nucleus Lysis buffer
Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent)Sigma-Aldrich74385Nucleus Lysis buffer
Nuclease free water (not DEPC-treated)InvitrogenAM9937Nucleus Lysis buffer
Protector RNase Inhibitor, 40 U/µLSigma-Aldrich3335399001Nucleus Lysis buffer
Sodium Chloride Solution, 5 MSigma-Aldrich59222CNucleus Lysis buffer
Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194Nucleus Lysis buffer
Bovine Serum Albumin 10%Sigma-AldrichA1595-50MLNucleus wash
DPBS (Ca2+, Mg2+free)Gibco14190-169Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µLSigma-Aldrich3335399001Nucleus wash
Bovine Serum Albumin 10%Sigma-AldrichA1595-50MLST staining buffer (ST-SB)
Calcium chloride solution, 1 MSigma-Aldrich21115-100MLST staining buffer (ST-SB)
Magnesium Chloride Solution, 1 MSigma-AldrichM1028ST staining buffer (ST-SB)
Nuclease free water (not DEPC treated)InvitrogenAM9937ST staining buffer (ST-SB)
Sodium Chloride Solution, 5MSigma-Aldrich59222CST staining buffer (ST-SB)
Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194ST staining buffer (ST-SB)
Tween-20Merck Millipore822184ST staining buffer (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 AntibodyBiolegend682205Hashtag antibody
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 AntibodyBiolegend682207Hashtag antibody
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 AntibodyBiolegend682209Hashtag antibody
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 AntibodyBiolegend682225Hashtag antibody
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 AntibodyBiolegend682227Hashtag antibody
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 AntibodyBiolegend682229Hashtag antibody
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 AntibodyBiolegend682231Hashtag antibody
TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 AntibodyBiolegend682233Hashtag antibody
TruStain FcX (human)Biolegend422302FC receptor blocking solution
Equipment and consumables
Bright-Line HemacytometerMerckZ359629-1EA
Centrifuge 5702/R A-4-38Eppendorf EP022629905
CoolCell LX Cell Freezing ContainerCorningCLS432003-1EA
CryovialThermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tubeEppendorfEP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorf30121872
Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dishCorning351008
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesFisher scientific10773501
Forceps Dumont #5Fine science tools11252-40
Hardened Fine ScissorsFine science tools14091-09
 Ice Pan, rectangular 4 L OrangeCorningCLS432106-1EA
Leica MS5LeicaMicroscope
Moria MC50 ScissorsFine science tools15370-50
Noyes Spring ScissorsFine science tools15012-12
Olympus CK2 ULWCDOlympusMicroscope
P10GilsonF144802
P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
Preseparation Filters (30 µm)Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
Shaking water bathGFL1083
Silicon plateRubberBV3530Dissection board
Software and packages
Cell rangerV4.0.0
R programmingV4.1.1
R sudioV1.3.1073
SeuratV4.0
tydiverseV1.3.1
Animals
B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouseThe Jackson LaboratoryJAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouseThe Jackson LaboratoryJAX stock #007576
C57BL/6J miceCharles River
Code for the data analysis
https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE

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