ハイコンテンツスクリーニングおよび分析アプリケーションのためのスフェロイドの大規模生産のための堅牢な方法

要約

このプロトコルは、大規模なハイコンテンツスクリーニングおよび分析に適した方法で3つの異なるタイプのスフェロイドを製造する方法を詳述する。さらに、回転楕円体および個々の細胞レベルでそれらをどのように分析できるかを示す例を提示する。

要約

ハイコンテントスクリーニング(HCS)およびハイコンテント分析(HCA)は、研究者が細胞から大規模な定量的表現型測定値を抽出する能力を提供する技術です。このアプローチは、細胞生物学における基本的な事象と応用事象の両方の幅広い理解を深めるのに強力であることが証明されています。今日まで、この技術の用途の大部分は単層で増殖した細胞の使用に依存してきましたが、そのようなモデルは組織で起こる相互作用やプロセスの多くを再現しないことがますます認識されています。そのため、スフェロイドやオルガノイドなどの3次元(3D)細胞アセンブリの開発と使用に出現しています。これらの3Dモデルは、がん生物学および薬物送達研究の文脈において特に強力であるが、HCSおよびHCAに適した再現可能な方法でのそれらの産生および解析は、多くの課題を提示する。ここで詳述するプロトコールは、多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)の生成のための方法を記載し、HCSおよびHCAと適合性のある様式で3つの異なる細胞株に適用できることを実証する。この方法は、ウェル当たり数百個のスフェロイドの産生を容易にし、スクリーニングレジームにおいて使用される場合、ウェル当たり数百個の構造からデータを得ることができ、全て同一の方法で処理され得るという特定の利点を提供する。また、高解像度蛍光イメージングのためにスフェロイドを処理する方法や、HCAがスフェロイドレベルと各スフェロイド内の個々の細胞の両方から定量的特徴を抽出する方法を詳述する例も提供されています。このプロトコルは、細胞生物学における幅広い重要な質問に答えるために容易に適用することができます。

概要

伝統的に、細胞ベースのアッセイは、固体基質上に成長する単層において行われており、これは効果的に2次元(2D)環境と考えることができる。しかし、2D細胞培養モデルは、いくつかの文脈では生理学的関連性を欠いており、細胞間で起こる複雑な相互作用の多くを再現できないことがますます認識されつつあり^ます1。3次元(3D)細胞培養法は研究者の間で急速に普及しており、3D細胞モデルは、組織環境内の細胞が遭遇する生理学的条件をよりよく模倣する高い可能性を示しています²。採用されている3Dセルアセンブリにはいくつかの異なるタイプがありますが、最も一般的な2つのタイプは回転楕円体とオルガノイドです。スフェロイドは、多くの異なる細胞株から増殖させることができ、使用する細胞型およびそれらの組み立て方法に応じて様々な形状およびサイズを採用することができる³。さらに、スフェロイドは、癌細胞株から増殖させる場合、多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)と呼ばれることもあり、これらのモデルは、前臨床のインビトロ薬物送達および毒性研究に特に使用されることを見出している^4,5。一方、オルガノイドは、私たちの体の組織や臓器をよりよく模倣することを目指しており、より複雑な形態学的配置を採用することができ....

プロトコル

1. 細胞培養

1. メディアの準備
   1. 細胞株の種類に応じて特定の細胞培養培地を調製する。細胞維持のためのすべての培地に10%の胎児ウシ血清(FBS)が含まれていることを確認してください。
      注:異なる細胞株は異なる培地を使用する。HT−29結腸癌細胞(ATCC HTB−38)は、マッコイズ5A+10%FBS中で増殖される。HepG2肝細胞癌細胞(ATCC HB-8065)は、最小必須培地+ 1%L-グルタミン+ 10%FBSで増殖させる。H358気管支肺胞癌細胞(ATCC CRL-5807)をRPMI 1640培地+1%L-グルタミン+10%FBS中で増殖させる。L-グルタミンおよびFBSを含むすべての培地は、完全培地と呼ばれる。細胞をスフェロイドとして増殖させるようにプレーティングする場合、ECM地下材料の着色を避けるために、10%FBSを含むフェノールレッドフリー培地が必要であり、その結果、イメージングプロセス中にアーチファクトが発生する可能性があります。
2. 継代培養細胞
   1. 細胞が約80%コンフルエントになったら、2mLのトリプシン-EDTA(0.25%(w/v)トリプシン/0.53mM EDTA)で短時間洗浄します。トリプシン-EDTAを吸引し、3mLの新鮮なトリプシン-EDTAを加え、37°Cで3〜5分間インキュベートする。
   2. 細胞が細胞培養皿から剥離したら、7mLの新鮮な完全培....

結果

このプロトコルでは、さまざまな腫瘍組織を表すために異なる細胞型を使用して、スフェロイドの形態で3D細胞培養アセンブリを作製する堅牢な方法が詳述されている。この方法では、ウェルあたり数百のスフェロイドを生成できるため、細胞ベースのアッセイを高含有量の方法で実行できます(図1)。このアプローチは、HT-29スフェロイド¹⁶ におけるナ.......

ディスカッション

ここで説明するアプローチは、HCSおよびHCAに適した方法でウェルあたり数百の回転楕円体を生成するためのプラットフォームを詳述する。ウェルあたり1つの回転楕円体のみの形成を可能にする平底および丸底ULAプレートの使用など、他の一般的な方法と比較して^18,19、この方法は、スクリーニング形式で多数の回転楕円体から高解像度情報を抽出?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Gibco	25300054
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A6003
Calcium chloride	Fisher Scientific	10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid	Perkin Elmer	6055302	These plates have been renamed as Phenoplates
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated	Gibco	10500064
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029
L-Glutamine solution, 200 mM	Gibco	25030024
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
Magnesium chloride	Fisher Scientific	10647032
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL	Corning	356237	This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	356231	This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning
McCoy's 5A medium	Gibco	26600023
McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red	Hyclone	10358633
Minimum Essential Medium (MEM)	Gibco	21090022
Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red	Gibco	51200046
Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate)	Developmental Studies Hybridoma Bank	H4A3-a
Neubauer counting chamber	Hirschmann	8100203
Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm	ThermoFisher Scientific	150350
Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software	Perkin Elmer	HCSHH14000000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148
Phalloidin Alexa Fluor 568	Invitrogen	A12380
Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets	Sigma Aldrich	P4417
Polysorbate 20	Sigma Aldrich	P5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870010
RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red	Gibco	11835063
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Stericup sterile vacuum filter units	Millipore	SCGVU05RE