電界効果バイオセンシング技術を用いた分子シャペロンHsp90とそのクライアントプロテインキナーゼCdc37との生体分子相互作用の探索

要約

電界効果バイオセンシング(FEB)は、生体分子相互作用を検出するための標識のない技術です。これは、結合標的が固定化されているグラフェンバイオセンサを通る電流を測定する。FEB技術を用いてHsp90とCdc37の生体分子間相互作用を評価し、2つのタンパク質間の強い相互作用が検出された。

要約

生体分子相互作用は、機能的に関連する生物学的事象を調節および調整することによって、多数の細胞プロセスにおいて多目的な役割を果たす。タンパク質、炭水化物、ビタミン、脂肪酸、核酸、酵素などの生体分子は、生物の基本的な構成要素です。それらはバイオシステム内の複雑なネットワークに集まり、無数のライフイベントを同期させます。タンパク質は通常、複雑なインターアクトームネットワークを利用してその機能を果たします。したがって、細胞レベルと生物レベルの両方で細胞におけるその重要性を解明するために、そのような相互作用を評価することが必須である。この目標に向けて、我々は、特定の生体分子相互作用を決定するために、急速に出現する技術、電界効果バイオセンシング(FEB)を導入する。FEBは、ベンチトップ型でラベルフリーで信頼性の高い生体分子検出技術で、特定の相互作用を決定し、高品質の電子ベースのバイオセンサーを使用しています。FEB技術は、バイオセンサー表面で使用される生体適合性ナノ材料によるナノモル範囲の相互作用を監視することができる。概念実証として、ヒートショックタンパク質90(Hsp90)と細胞分裂サイクル37(Cdc37)との間のタンパク質間相互作用(PPI)を解明した。Hsp90はATP依存性分子シャペロンであり、多くのタンパク質の折り畳み、安定性、成熟、および品質管理に不可欠な役割を果たし、それによって複数の重要な細胞機能を調節する。Cdc37は、プロテインキナーゼを特異的に認識してHsp90にリクルートし、下流のシグナル伝達経路を調節するため、プロテインキナーゼ特異的分子シャペロンとみなされる。そのため、Cdc37はHsp90の共同シャペロンと考えられている。シャペロンキナーゼ経路(Hsp90/Cdc37複合体)は、細胞増殖を促進する複数の悪性腫瘍において過剰活性化される。したがって、それは癌治療の潜在的な標的である。本研究は、Hsp90/Cdc37モデルシステムを用いたFEB技術の効率を実証する。FEBは、2つのタンパク質間に強力なPPIを検出した(3つの独立した実験_{におけるKD} 値は0.014μM、0.053μM、および0.072μM)。要約すると、FEBはラベルフリーで費用対効果の高いPPI検出プラットフォームであり、迅速かつ正確な測定を提供します。

概要

生体分子相互作用:
タンパク質は生物の不可欠な部分であり、細胞代謝、細胞構造、細胞シグナル伝達、免疫応答、細胞接着などの多数の分子経路に関与する。一部のタンパク質は独立してその機能を果たすが、ほとんどのタンパク質は結合界面を使用して他のタンパク質と相互作用し、適切な生物学的活性を調整する¹。

生体分子相互作用は、主に、タンパク質表面、複合体安定性、または相互作用の持続性に基づいて、関与するタンパク質²の明確な構造的および機能的特性に基づいて分類することができる³。生体分子相互作用における必須タンパク質とその役割を同定することは、分子レベルでの生化学的メカニズムを理解するために不可欠です⁴。現在、これらの相互作用⁵を検出するための様々なアプローチがある:インビトロ⁶、インシリコ⁷、生細胞⁸、エキソビボ⁹、およびインビボ

プロトコル

注:本研究で用いた組換えタンパク質Hsp90およびCdc37は、商業的に入手した( 材料表を参照)。

1. チップの起動

注:実験で使用するすべての材料は、 材料表にリストされています。調製したすべての溶液を滅菌0.2μmフィルターでろ過します。

1. 15 mLチューブ中の1 M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液(pH=6.0)に2 mgのEDCを加えて、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)溶液を調製する。別の 15 mL チューブ内の 2.5 mL の 1 M MES バッファー (pH = 6.0) に 6 mg のスルホ NHS を加えて、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド (スルホ-NHS) 溶液を調製します。各溶液の 50 μL を独立したチューブにアリコートし、将来の使用のために -20 °C で保存します。
2. 等量のEDCサンドスルホNHS溶液(50 μLのEDC + 50 μLのスルホ-NHS)を上下にピペッティングして混合します(渦を巻かないでください)。
   注:EDC/スルホ-NHSの混合溶液は、適切なチップ機能化のための効果的な架橋を維持するために、30分以内に使用する必要があります。
3. ....

結果

実験1の結果:
標的タンパク質Hsp90(500nM)を、上記のような標的固定化プロトコルに従ってチップに固定化した。最初の実験のために、25nM〜5,000nMの範囲の10濃度の分析物タンパク質Cdc37を、文献で入手可能なデータに基づいて調製した( 表1参照)。

実験のステップは、I応答で起こる変化を追跡することによってリアルタイムで監視することができ?.......

ディスカッション

本研究では、Hsp90とCdc37との間の生体分子相互作用を決定するために、FEB技術(リアルタイム動態特性評価アプローチ)を使用することの実現可能性を評価した。最初の探索的実験(最初の実験)は、適切な分析物濃度の選択が実験の重要な部分であり、文献で入手可能なデータに基づいて予測_されたKD 値の上下の濃度点を含めることによって実験を設計するべきであることを示唆した。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated analysis software	Agile plus software, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)	Agile plus software, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	biosensor chip
Data review software	Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag	CelluSep,  Membrane filtration products	T2-10-15 CAS number: NA	T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)	Cardea (Nanomed)	EDC160322-02 CAS number: 25952-53-8	White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system	Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)	NA CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer	Merck	M3671-50G CAS number: 4432-31-9	White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips	Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10	Bio-Lab	001623237500  CAS number: 7758-11-4	Liquid transparent solution
Pipete	Thermo Scientific	11855231 CAS number: NA	Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)	Cardea (Nanomed)	0105-001-002-001 CAS number: NA	Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))	Cardea (Nanomed)	0105-001-003-001 CAS number: NA	Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37	Abcam	ab256157 CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta	Abcam	ab80033 CAS number: NA
Spreadsheet	Excel, Microsoft office	NA CAS number: NA
Statistical software	GraphPad, Prism	NA CAS number: NA	Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS	Cardea (Nanomed)	NHS160321-07 CAS number: 106627-54-7	White powder
Tips	Alex red	LC 1093-800-000 CAS number: NA	Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs