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要約

本プロトコルは、ガス堆積および水溶液反応 による 表面改質のための処理中にシリコン平面皮質内微小電極を処理するためのツールを記述する。手順全体を通してデバイスを処理するために使用されるコンポーネントのアセンブリが詳細に説明されています。

要約

皮質内微小電極は大きな治療可能性を秘めています。しかし、彼らは控えめな移植期間の後に大幅な性能低下に挑戦しています。観察された減少の実質的な寄与は、インプラントに近位の神経組織への損傷およびその後の神経炎症反応である。デバイスの寿命を改善するための努力には、組織応答を改善するためのデバイス表面への化学修飾またはコーティング用途が含まれる。このような表面処理の開発は、典型的には、意図された用途に必要な電気部品を欠いている非機能的な「ダミー」プローブを使用して完了する。機能デバイスへの変換は、皮質内微小電極アレイの脆弱性を考えると、さらなる考慮を必要とする。ハンドリングツールは、特に長い手続き時間を必要とする修正のために、組み立てられたデバイスへの表面処理を大幅に促進します。ここで説明するハンドリングツールは、気相堆積および水溶液曝露 を介して 適用される表面処理に使用される。コーティングの特性評価は、エリプソメトリーおよびX線光電子分光法を用いて行われる。機能デバイス上のコーティング手順の前後の電気インピーダンス分光法記録の比較により、変更後のデバイスの完全性が確認されました。記載されたツールは、化学的適合性を維持する代替電極装置および処理方法に容易に適合させることができる。

概要

神経補綴装置は、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脳性麻痺、および切断を含む幅広い患者集団において、感覚および運動能力の障害または欠如を回復することを目的としている1,2,3。皮質内微小電極(IME)は、皮質ニューロンと神経補綴物を制御するために使用されるデバイスとの間の通信経路を確立することができる。皮質内微小電極の明確な利点は、高い空間的および時間的分解能で神経信号を記録する能力であり、これはその後の信号処理およびブレインコンピュータインターフェースの制御に好ましい4,5。残念なことに、皮質内微小電極の性能は、移植後数ヶ月から1年以内に劇的に低下する2,6,7,8。信号品質と安定性の損失は、技術の適用に悪影響を及ぼします。

観察されたパフォーマンス低下の有意な寄与は、移植関連組織損傷および慢性神経炎症に対する生物学的応答である9、10、11。IMEの移植は脳組織に損傷を与え、反応的な細胞防御プロセスのカスケードを開始するシグナル伝達分子の放出をもたらす。慢性インターフェースは異物応答を悪化させ、装置に近位の組織を損傷する持続的な神経炎症をもたらす。しばしば、神経炎症、瘢痕化、およびシグナル品質の記録の低下に寄与する局所神経変性の症状として認識される12、13、14、15。同伴された活性化ミクログリアおよびマクロファージを有するアストロサイトの緻密なコングロマリットを含み、電極を封入する瘢痕は、材料輸送および炎症因子の局所蓄積の減少を伴う好ましくない局所環境を作り出す16、15、16、17、18。

多くの研究は、皮質内微小電極に対する脳の応答、または応答を緩和するためのアプローチを記載している7。組織応答を改善するための研究開発には、全体的な構造、表面トポロジー、材料、およびコーティング用途への修正を含む、さまざまな戦略が含まれていました。これらの努力は、移植事象から受ける損傷を最小限に抑え、デバイスと近位細胞との間により好ましい界面を導入し、またはデバイスが移植された後の組織歪みを低減することを意図している7。慢性生物学的応答を特異的に標的とする方法は、移植部位を安定化させ、細胞の健康を化学的に促進することを目的としたいくつかの生理活性コーティングをもたらしている。例としては、ポリ(エチレンジオキシチオフェン)(PEDOT)19、20などの導電性ポリマー、カーボンナノチューブ21、ヒドロゲル22、および特定の細胞プロセスを標的とする生理活性分子および薬物の添加23、24、25が挙げられる。特に、私たちの研究グループは、デバイス移植26に関連する外傷の最小化、デバイス/組織の剛性ミスマッチの最小化27、28、29、30、31、32、33、滅菌の最適化など、移植された微小電極に対する炎症反応の減少を促進する多くのメカニズムを探求してきましたが、これらに限定されません手順34、35、酸化ストレス/損傷の低減28、36、37、38、39、40、41、42、代替電極材料43の探索、および天然細胞外マトリックスのナノアーキテクチャを模倣する44、45、46.最近の関心事は、微小電極組織界面における神経炎症反応を直接緩和するための生体模倣体表面コーティングの開発である39。

インターフェースの改変は、信号記録に必要な創傷および近位組織を直接標的とする独自の利点を提供する。免疫応答を悪化させることなく治癒を促進する表面処理は、品質記録の寿命に利益をもたらし、皮質内微小電極の治療および研究の可能性を実現する際の限界を取り除くことができる。提示された研究は、デバイスの脆弱性に対応しながら、長い反応時間を必要とする微小電極アレイに表面処理を適用するための方法を詳述している。提示された技術は、表面改質方法を、装置が治療用途全体にわたって取り扱うことができない機能的な装置に共有することを意図している。これらのツールは、非機能的なダミープローブおよび機能的なシリコン平面微小電極アレイを処理するために提示されています。

電極表面を改質するための提示されたアプローチは、気相堆積および水溶液との反応のための非機能性ダミープローブまたは機能性シリコン平面電極アレイの安全な懸濁液を可能にする。これらの壊れやすいデバイスを処理するために、いくつかの3Dプリント作品が使用されます(図1および図2)。Mn(III)テトラキス(4-安息香酸)ポルフィリン(MnTBAP)の固定化を含む抗酸化コーティングによる表面改質のために気相および溶液相ステップの両方を利用する手順の一例が提供される。MnTBAPは、炎症の媒介性を実証した抗酸化特性を有する合成メタロポルフィリンである47,48。機能性シリコン平面電極アレイに関する提供された例は、非機能性デバイス40について以前に報告されたプロトコルへの更新を検証する。Muniefらからの気相堆積技術の適応は、機能電極49とのプロトコルの適合性を支持する。気相堆積は、活性MnTBAPを固定化するためのカルボジイミド架橋剤化学を含む水性反応の準備において表面をアミン官能化するために利用される。ここで開発されたハンドリング方法論は、他のコーティングや同様のデバイスに対応するように変更できるプラットフォームとして提供されています。

このプロトコルは、機能性シリコン平面電極アレイと同様の寸法を有するシリコンシャンクおよび3D印刷タブを含む非機能性ダミープローブを使用するアプローチを示す。デバイスのコネクタパッケージは、提供された命令の非機能ダミープローブの3D印刷タブに類似していると考えられています。

figure-introduction-4388
図1:真空デシケータでの気相堆積中に機能デバイスを取り扱うための3Dプリントピース(A)構造のベースには、1 cm x 1 cmのサンプルシリコン正方形のホルダー(上矢印)とデシケータプレートに固定するための穴(下矢印)が含まれています。(B)プレートは、デバイスのサスペンションを固定するために使用されます。ここからは、この図の各ピースをピース1Aまたは1Bと呼ぶことにします。スケール バー = 1 cm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-introduction-4944
図2:水溶液中で起こる表面反応のための機能性デバイスを取り扱うための3D印刷片。 (A)培養プレートの蓋に接着されるガイド片。(B)組み立て中に(C)と(D)を安定させるベンチトップピース。(C)及び(D)は、ウェルプレート内に載置するための装置の懸濁液を一緒に固定し、そして(E)さらに、(C)及び(D)片をウェルプレート蓋に固定する。ここからは、この図の各パネルの個々のピースを、この図のパネル番号に対応するピース番号と呼ぶことにする。スケール バー = 1 cm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

3D印刷用のすべてのコーディングファイルは、 補足コーディングファイル1-16で提供されています。代表的な結果に提供される分析は、商業的に取得された機能性シリコン平面電極アレイ( 材料表を参照)を用いて記載されている。

1. 真空デシケータ内での気相堆積用組立の取り扱い

メモ:気相堆積中の装置を取り扱いおよび保持するための組み立てられた装置を 図3に示します。ステップ1.1-1.8は、デバイスを蒸着用の装置に配置するために必要な手順を説明しています(図4A)。

figure-protocol-484
図3:気相堆積中の機能デバイスを処理するための3Dプリントピースの組み立て。 アセンブリは、コーティングするサンプルなしで描かれています。ネジとウィングナットは、ピース1Aと2Bを一緒に固定するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-909
図4:コーティングするサンプルの組み立てと配置のイメージ。 このスキームは、真空デシケータ内に固定された気相堆積中の機能デバイスの取り扱いを記述している。(A)片1Aに両面ポリイミドテープを、1Bに発泡テープを貼る。(C)ネジとウィングナットを使用してピース1Bを1Aに固定し、アセンブリはジップケーブルタイ(赤い矢印)を使用してデシケータトレイに取り付けられます。(D)1cm×1cmの正方形のシリコンサンプルをそれぞれのホルダーに入れる。(e)アルミニウム製秤皿および圧力計を、図示の向きでデシケータ内に設置する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 表面処理のために、デバイスの基板材料の1 cm x 1 cm角のサンプルを入手してください。
    1. シリコンサンプル(このプロトコル用に選択)については、ウェーハダイシングマシンを使用してシリコンウェーハを1 cm x 1 cm角に切断します( 材料表を参照)。
  2. 小片1A(図1A、補助符号化ファイル1、補助符号化ファイル2)および1B(図1B、補助符号化ファイル3、補助符号化ファイル4)を印刷または取得する。
  3. 片1Aに両面ポリイミドテープを取り付け、片面接着剤で厚さ1/8インチの発泡ストリップを片1Bに取り付けます。
  4. 装置のコネクター・パッケージをピース 1A のテープに接着します。
    メモ: テープ上のコネクタの理想的な向きを指定すると、 図 4B に示すように、シャンクが端に吊り下げられたままになります。
  5. ピース1Aとピース1Bを一緒に固定します(図4C)。穴を合わせ、ステンレス製のネジとウィングナットを使用して固定します( 材料表を参照)。
  6. ジップタイを使用して、 図4Cに示すように、ピース1Aの底部の穴を使用してアセンブリを真空デシケータトレイに固定します。
  7. 該当する場合は、正方形の材料サンプルをフレーム下部のスリットに入れます(図4D)。ここでは、1cm×1cm角のシリコンウェーハをダイシングしたサンプルを例に挙げて用いる。
    注:正確な材料は、処理されたデバイスの基板と一致する必要があり、デバイスによって異なります。
  8. 真空デシケータ内の適切なレセプタクルに溶液を反対側に配置し、固定アセンブリに沿って気相堆積を完了します。
    注:アルミニウム製秤皿は、ここでの例として、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)堆積のための容器として使用された。
    1. デシケータ内に真空計( 材料表を参照)を配置して、正確な圧力を記録します。デシケータの蓋のポートを、固定されたアセンブリの近くに、ソリューションに沿って配置します(図4E)。
      注:この気相堆積法の詳細については、以前に公開された参考文献49に記載されています。

2. 水溶液 による 表面反応のハンドリングアセンブリ

注:水相堆積および表面処理中の装置を取り扱いおよび保持するためのコンポーネントおよび組み立てられた装置を 図5〜7に示します。次の手順では、堆積および処理のために装置を装置に配置するために必要な手順を詳述します。

figure-protocol-3135
図5:水溶液中で起こる表面反応のための機能デバイスを扱うための3Dプリント片の組み立て。(B)ベンチトップピースは、組み立て中にピース(C)および(D)を安定させるために使用した。(C)および(D)は、ウェルプレート内に配置するための装置の懸濁液を一緒に固定する。(E)さらに、(C)及び(D)片をウェルプレート蓋に固定する。両面ポリイミドテープを(C)の下部に載置し、(D)の下部に発泡テープを載置した(いずれも赤で囲んだ)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-3853
図 6: 6 つのガイドで構成した細胞培養プレートの蓋 (ピース 2A) 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-4208
図7:溶液反応用のプローブを固定および装填するためのシーケンス。 この図では、画像内の明瞭さのために部品の色を変更しました。これらは図 5 および 図6と同じ部分である。(A)ピース2Cをピース2Bに入れ、デバイスを2Cのテーピング部分に固定します。(B)ピース2Dはピース2Cに収まり、デバイスシャンクを吊り下げるアセンブリを作成します。(C)2C、2D、およびデバイスのアセンブリは、ガイドを使用してウェルプレートの蓋に慎重に配置されます。(D)ピース2Eはアセンブリの上部にフィットし、蓋をさらに固定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. ウェルプレート用の蓋を構築し、デバイスの電極アレイを溶液中に懸濁させる(図6)。このプロトコルは、24ウェルプレートの使用を記載している。
    1. ウェルプレートの蓋に19 mm x 10.5 mmの長方形の穴をレーザーカッターで、またはボックスカッターで手動で切断します。穴の数を治療に必要なデバイスの数に一致させます。
      メモ:組み立てを容易にするために、ウェルプレートごとに6つのデバイスを処理するか、少なくとも隣接していないウェルに穴を開けることをお勧めします(図6)。
    2. 適切な数のガイド(ピース2A(図2A)、補足コーディングファイル 5、補足コーディングファイル6)を印刷または入手します。
    3. シアノアクリレート接着剤を使用して、ガイドを蓋に固定します。 図 6 に示すように、ガイドと蓋の長方形の穴を接着しながら合わせ、ガイドの長方形の穴が遮られていないことを確認します。
  2. 治療が行われる場所で目的の溶液でウェルプレートを満たします。例えば、この溶液は、MES緩衝液中にEDCおよびスルホ−NHS( 材料表を参照のこと)を含む。
    注:溶液の体積は、電極デバイスの寸法に依存する。8.6 mmの薄型コネクタと3 mmのシャンク長を備えたミシガンスタイルの微小電極アレイ( 材料表を参照)の場合、〜9 mmのクリアランス50があります。2mLの溶液を使用すると、デバイスのシャンクを完全に沈めながら、デバイスの残りを反応溶液から遠ざけることができます。
    1. 表面処理の確認に基質サンプルを使用する場合は、角型材料サンプルをプレートのウェルに入れ、反応液に浸します。
  3. デバイスをウェルプレートにしっかりと吊り下げます( 材料表を参照)。シーケンスを 図 7 に示します。
    1. テープ片2B(図2B、補足符号化ファイル7、補助符号化ファイル8)をベンチトップ(図7A)とする。
    2. 片2Cのベースを覆うように両面ポリイミドテープを貼ります(図2C、補足符号化ファイル9、補助符号化ファイル10)。
    3. 片面接着剤付きの1/8インチフォームテープを貼って、ピース2Dのベースを覆います(図2D、補足コーディングファイル11、補足コーディングファイル12)。
    4. ピース2Cをピース2Bの溝にフィットさせます(図7A)。
    5. デバイスのコネクタパッケージをテープに貼り付け、デバイスシャンクの長さが吊り下げられるようにします(図7B)。
    6. ピース2D( 図7ではオレンジ色で表示)をピース2Cにスライドさせてデバイスを固定します。このアセンブリは、ツールピースの間にデバイスを効果的に固定します(図7B)。
    7. アセンブリの端を持ち、慎重に持ち上げてピース2Aから取り外します。
    8. ピース2Cおよび2Dの外向きの半円をピース2Aの対応するガイド( 図7Cの緑色で表示)に合わせ、アセンブリを蓋にフィットさせます。
    9. ピース2E(図2E)をガイドの上に圧入してアセンブリの配置を確保します(図7D、補足コーディングファイル13、補足コーディングファイル14に緑色で示されています)。
    10. 溶液の連続混合から利益を得る反応のために、ウェルプレートを撹拌する。組み立てたウェルプレートをシェーカーテーブルに移し、100rpm以下の速度で実行します。
  4. 複数の溶液ベースの反応または洗浄ステップが必要な場合は、適切なウェルに所望の溶液を分配した新しいウェルプレートに蓋を慎重に移します。
    メモ: ステップ 2.4 はオプションです。
  5. ウェルプレートからデバイスを取り外します。
    1. テープ片2Bをベンチトップにする。
    2. ピース2Eを蓋から取り外します。
    3. デバイスを固定しているアセンブリをウェルプレートから慎重に取り外します。
    4. ピース 2C がベンチトップを向き、ピース 2D が上を向くようにアセンブリを向けます。デバイスのシャンクはベンチトップと平行である必要があります。アセンブリを一緒に嵌合するときに、アセンブリのピース2Cを以前に完了したようにピース2Bに嵌め込む(ステップ2.3.4)。
    5. ピース2Dをピース2Cから慎重に引き離して分離します。ピース2Cのタブにわずかな圧力をかけてベンチに入れ、このタスクに安定性を与えます。
      メモ: 2C のタブは、この処理を容易にするために 2D のタブよりも長くなっています。
    6. 鉗子を使用してデバイスのコネクタパッケージをつかみ、テープから取り出し、デバイスを目的のストレージコンテナに移します。

結果

取り扱い成分の使用を実証するために、酸化剤メディエーターの固定化を活性化シリコンに適合させるために、記載された方法論を実施した。酸化ストレスを低減するためのIMEへのこの化学の適用は、Potter-Bakerらによって考案され、非機能性シリコンダミープローブ40で実証された。この表面処理は、アミン官能化に続いてカルボジイミド架橋化学51を?...

ディスカッション

記載されたプロトコルは、シリコン平面微小電極アレイの表面処理のために設計されました。3Dプリントされたツールは、ロープロファイルコネクタ50を備えたミシガンスタイルの微小電極アレイにカスタマイズされています。非機能性プローブは、生体適合性接着剤を用いてシリコンプローブを3D印刷されたタブに接着することによって組み立てられた。3Dプリントされた?...

開示事項

内容は、米国退役軍人省、国立衛生研究所、または米国政府の見解を表すものではありません。

謝辞

この研究は、米国(米国)退役軍人省リハビリテーション研究開発サービスのメリットレビュー賞IRX002611(カパドーナ)およびリサーチキャリアサイエンティスト賞IK6RX003077(カパドーナ)によって部分的に支援されました。さらに、この研究は、国立衛生研究所、国立神経障害・脳卒中研究所R01NS110823(カパドーナ/パンクラツィオ)、および国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム(クレブス)によって部分的に支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide methiodide (EDC)Sigma-Aldrich165344-1GSolid, stored desiccated at -20 °C
15 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-70C
18 Pound Solid Nylon Cable/Zip TiesCole-ParmerEW-06830-66Length 4 inches
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Sigma-Aldrich4432-31-9Solid
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)Sigma-Aldrich440140-100MLLiquid, container with Sure/Seal
50 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-49A
Aluminum foilFisher Scientific01-213-103
Aluminum weighing dishesFisher Scientific08-732-102Diameter 66 mm
Bel-Art Vacuum DesiccatorFisher Scientific08-594-15B
Corning Costar TC-Treated Multiple Well PlatesMillipore SigmaCLS3527-100EA24-well plate, polystyrene
Cyanoacrylate AdhesiveLocTiteN/A
Digital MicroscopeKeyenceVHX-S750E
Disco DAD3350 Dicing SawDiscoDAD3350Used to cut silicon wafer into 1 cm x 1 cm samples
Double-Sided Polyimide TapeKapton TapePPTDE-1/4¼” x 36 yds.
EP21LVMed – low viscosity, two component epoxy compoundMasterbondEP21LVMedMeets USP Class VI certification, Passes ISO 10993-5 for cytotoxicity
Epilog Fusion Pro 48 Laser MachineEpilogN/ACO2 laser
Foam tapeXFastenN/A1/8" Thick
Gamry Interface 1010E PotentiostatGamry992-00129
High precision 45° curved tapered very fine point tweezers/forcepsFisher Scientific12-000-131
Lab tapeFisher Scientific15-901-10L
Mn(III)tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin (MnTBAP)EMD Millipore475870-25MGSolid, stored at -20 °C
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt, ≥98% (HPLC)Sigma-Aldrich56485-250MGSolid, stored desiccated at 4°C
Platinum clad niobium mesh anodeTechnicN/AClad with 125μ” of platinum on one side, framed in titanium with (1) 1” x 6” titanium strap centered on one 6” dimension
Silicon Planar Microelectrode Array, 16 ChannelNeuroNexusA1x16-3mm-100-177-CM16LPElectrode site material is iridium, shank thickness is 15 μm
Silicon WaferUniversity Wafer1575Diameter 100 mm, p-type, boron-doped, 100 oriented, resistivity 0.01-0.02 Ohm-cm, thickness 525 um, single side polished, prime grade
Silver/silver Chloride reference electrodeGamry Instruments930-00015
SolidworksN/A
Stainless Steel Phillips Flat Head ScrewsMcMaster Carr96877A629#8-32, 1 1/2", fully threaded
Type I deionized waterChemWorldCW-DI1-20
Ultimaker 3 3D printerUltimaker N/A
Ultimaker CuraUltimakerN/A3D printing software
Ultimaker NFC ABS FilamentDynamism, Inc.16212.85 mm
Ultimaker NFC PLA FilamentDynamism, Inc.16092.85 mm
Vacuum Gauge Vacuum GaugeMeasureman DirectN/AGlycerin Filled, 2-1/2” Dial Size, ¼”NPT, -30” Hg/-100kpa-0
Wing nutsEverbilt934917#8-32, zinc plated

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