副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

要約

このプロトコルは、ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出するための共焦点イメージング技術を記述する。これらの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う近接融着(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口および開放された細孔の維持を伴うステイ融合、および3)融合小胞収縮を伴う収縮融合が含まれる。

要約

動的融合細孔開閉は、エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスを媒介し、それらの動態を決定する。ここでは、共焦点顕微鏡をパッチクランプ記録と組み合わせて使用して、初代培養ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出する方法を詳細に実証する。3つの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う密閉核(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口と開いた細孔の維持を含むステイ融合、3)核融合によって生成されたΩ形プロファイルの収縮を伴う蠕動融着が含まれる原形膜で完全に融合する。

これらの融合モードを検出するために、原形質膜を標識し、原形質膜の細胞質ゾル対向小葉においてホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸(PtdIns(4,5)_P2)に結合するホスホリパーゼC δ(PH-mNG)のPHドメインと結合するmNeonGreenを過剰発現させた。小胞に蛍光偽神経伝達物質FFN511をロードして、小胞内容物放出を検出した。Atto 655を融合孔閉鎖を検出するために浴液に含ませた。これら3つの蛍光プローブを生クロマフィン細胞で1フレームあたり約20〜90ミリ秒で同時に画像化し、融合孔開口、内容物放出、融合細孔閉鎖、および融合小胞サイズ変化を検出した。分析方法は、これらの蛍光測定から3つの融合モードを区別するために説明されています。ここで説明する方法は、原則として、クロマフィン細胞以外の多くの分泌細胞に適用することができる。

概要

膜融合は、シナプス伝達、血糖恒常性、免疫応答、およびウイルス侵入を含む多くの生物学的機能を媒介する^1,2,3。原形質膜での小胞融合を伴うエキソサイトーシスは、神経伝達物質およびホルモンを放出し、ニューロンネットワーク活動などの多くの重要な機能を達成する。融合は、小胞内容物を放出するために細孔を開き、その後、細孔が融合小胞を取り出すために閉じ得る、これはキスアンドラン^1,4と呼ばれる。不可逆的および可逆的な融合孔開口の両方は、単一小胞融合の融合細孔コンダクタンス記録と組み合わせた細胞付着容量記録で測定することができる。

これはしばしば、融合小胞の平坦化までの融合の拡張を伴う完全崩壊融合、および融合孔の開閉を伴うキスアンドランを反映していると解釈され、それぞれ^5、6、⁷、⁸、⁹、^{10、11、12、13}.クロマフィン細胞における最近の共焦点および誘導放出枯渇(STED)イメージング研究は、融合孔の開閉(キスアンドラン、クローズフュージョンとも呼ばれる)、ステーフュージョンと呼ばれる、長期間にわたって開いた細孔でΩ形状を維持する融合ポア開口部、および原形質膜と完全に融合するまでの融合小胞の収縮、原形質膜と融合小胞を融合させるための完全崩壊融合を置き換える^4、 8,14,15,16,17。

ニューロンにおいて、融合細孔の開閉は、融合孔よりも大きい小胞に予め装填された量子ドットの放出を示す画像化および神経終末の放出面における融合細孔コンダクタンス測定^5、18、19によって検出されている。副腎クロマフィン細胞は、外細胞症およびエンドサイトーシスの研究のためのモデルとして広く使用されている^20,21。クロマフィン細胞は大きな緻密なコア小胞を含むが、シナプスは小さなシナプス小胞を含むが、クロマフィン細胞およびシナプスにおけるエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスタンパク質は、10、11^、12、20、^21、22、23と非常に類似している。

ここでは、ウシ副腎クロマフィン細胞における電気生理学と組み合わせた共焦点イメージング法を用いてこれら3つの融合モードを測定する方法について説明する(図1)。この方法は、エキソサイトーシスを検出するために小胞に蛍光偽神経伝達物質(FFN511)をロードすることを含む。Atto 655(A655)を浴液に添加して融合生成したΩ形プロファイルを充填し、原形質膜⁸、^15、24でPtdIns(4,5)P2に結合するホスホリパーゼC δ(PH)の_PHドメインで原形質膜を標識する。融合細孔ダイナミクスは、異なる蛍光強度の変化によって検出することができる。クロマフィン細胞について記載されているが、ここで説明するこの方法の原理は、クロマフィン細胞をはるかに超えた多くの分泌細胞に広く適用することができる。

プロトコル

注:動物の使用手順はNIHのガイドラインに従い、NIH動物愛護および使用委員会によって承認されました。

1. ウシクロマフィン細胞培養

1. クロマフィン細胞培養の1日前にロックの溶液(表1)とオートクレーブツールを調製する。
2. 培養日に地元の食肉処理場からウシ副腎を入手し、解剖前に氷冷したロックの溶液に沈めておく。
   注:副腎は、体重が約1,400ポンド(〜635 kg)の21〜27ヶ月の生後21〜27ヶ月の健康な黒いアンガス(主に男性)です。
3. 解剖前にコラゲナーゼP、トリプシン阻害剤、ウシ血清アルブミン(表1)を含む新鮮な酵素液30mL(副腎3本分)を調製し、室温で保存する。
4. 表面に切り傷や出血のない無傷の腺を3つ選択し、脂肪組織をはさみで除去します(図1A)。血液が出なくなるまでロックの溶液で灌流して腺を洗う。これを達成するには^、0.22 μmフィルターを取り付けた30 mLシリンジを必要な回数だけ使用して、副腎静脈を通って腺を膨らませます(図1B)。
   注:通常、3つの腺を洗浄するには約150mLのロックの溶液が必要です。
5. 消化のために、腺が腫れ始めるまで、0.22μmフィルターを取り付けた30mLシリンジを使用して副腎静脈を通して酵素溶液を注入する。その後、腺を37°Cで10分間放置する。もう一度注射し、腺を37°Cでさらに10分間放置する。
   注:3つの腺を消化するには、約30mLの酵素溶液が必要です。
6. 消化後、はさみで腺を静脈からもう一方の端まで縦に切断し、腺を広げます(図1C)。白い髄質をロックの溶液を含む10cmのペトリ皿にピンセットでつまんで髄質を分離します。
   注:消化前後の腺の内部の比較を 図1Cに示す。消化および髄質単離の詳細は、以前に報告されている^23、25。
7. 髄質をハサミで細かく切って細かく刻みます(図1D)。髄質懸濁液を80〜100μmのナイロンメッシュでビーカーにろ過する。次いで、濾液を50mL円錐管に移し、48× gで遠心分離を行い、室温、3の減速で3分間行う。
   注:髄質のミンチには通常〜10分かかります。細胞の良好な収量を得るためには、ピンセットでつまむことができないまで、ミンチ片は非常に小さくなければならない。
8. 遠心分離後、上清を除去し、ピペッティングにより細胞ペレットをロック溶液で再懸濁する。細胞懸濁液を80〜100μmのストレーナーで濾過し、48 x g、室温で、3の減速で3分間遠心分離する。
9. 上清を除去し、細胞ペレットを30mlの培養液で再懸濁した(表1)。計数チャンバ²⁵の血球計を用いて細胞数を決定する。

2. エレクトロポレーションによるトランスフェクション

1. ¹⁰⁶個×2.8個を15mLチューブに移す。3の減速で48×gで2分間遠心分離することによって細胞をペレット化する。製造元から提供されたトランスフェクションバッファー 100 μL (材料表を参照) を細胞ペレットに加え、2 μg の PH-mNG プラスミドを追加します。
   注:PH-EGFP¹⁵ において、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)をmNGで置換することによって、PH-mNGプラスミドを作成した( 材料表を参照)。
2. 溶液を上下にピペッティングして懸濁液を穏やかに混合し、混合物を遅滞なくエレクトロポレーションキュベットに移す(図1E)。すぐにキュベットをエレクトロポレーターに移し( 材料表を参照)、画面リストでO-005プログラムを選択し、 Enter キーを押してエレクトロポレーションを実行します。
   注: 細胞培養フードにトランスフェクション用の細胞懸濁液を準備します。混合工程中に懸濁液に気泡を導入しないでください。遅滞なく次のステップに進みます。
3. エレクトロポレーション後、直ちに1.8mLの培地をキュベットに加え、滅菌チップを備えたマイクロピペッターで穏やかに混合する。次いで、各ディッシュのカバースリップ( 材料表を参照)の上にエレクトロポレーションされた細胞の懸濁液300μLを加え、合計5〜6個のディッシュを1回のエレクトロポレーション反応のためにメッキする。
4. ディッシュを9%_CO2 で37°Cの加湿インキュベーターに30分間慎重に移し、30分後に2mLの予備加温培地を各ディッシュに静かに加える。
5. トランスフェクトした細胞を加湿インキュベーター内で、実験前に9%_CO2で37 °Cに保ち、2〜3日間保管する。
   注:培養細胞は1週間続きます。2〜3日目に培養細胞を使用するのが最善です。

3. パッチクランプ記録と共焦点イメージングの準備

メモ:このプロトコルは、レーザー走査型共焦点顕微鏡と電圧クランプ記録付きパッチクランプアンプ、静電容量記録用のロックインアンプで実行されました。固定Z面でのXY平面共焦点イメージング(XY/Z_固定 スキャン)を用いて、3つの蛍光シグナルすべてを同時に撮像した。Z面は、原形質膜がカバースリップに接着している細胞底部に集束した。

1. パッチクランプおよびイメージング実験の日に、蛍光顕微鏡下で細胞を観察した。明視野を使用して細胞培養物が汚染されていないことを確認し(図1F)、蛍光標識タンパク質の適切な発現を確認します。
   注:例えば、PH−mNGは、細胞の〜20〜30%の原形質膜で発現される。
2. ホウケイ酸ガラス毛細血管からパッチピペットを準備する。これを行うには、ピペットプーラーでピペットを引っ張り、先端を液体ワックスでコーティングし、マイクロフォージで研磨します( 材料表を参照)。
3. パッチクランプ記録アンプの電源を入れ、パッチクランプ記録ソフトウェアを起動します( 資料表を参照)。ソフトウェアでカルシウム電流と静電容量の記録に適切なパラメータを設定します( 材料表を参照)。
   1. 合計で60秒の時間の記録プロトコルを設定し、刺激は10秒から始まります。
   2. 電圧クランプ記録の保持電位を-80mVに設定します。-80 mV~10 mVの1 sの分極解除を刺激として設定し、カルシウム流入と静電容量ジャンプを誘導します。
   3. 静電容量測定の場合は、正弦波刺激の周波数を1,000~1,500Hzの範囲に設定し、ピークtoピーク電圧を50mV以下に設定します。
4. プロトコルを保存し、記録用の新しいファイルを作成します。
5. 共焦点顕微鏡システムの電源を入れ、ソフトウェアで適切なパラメータを設定します( 材料表を参照)。
   1. 458nm、514nm、633nmなどのレーザーをオンにし、各蛍光プローブに従ってレーザーごとの発光収集範囲を以下のように設定します。FFN511:励起波長(EX)、458nm;発光波長(EM)、468〜500nm。mNG: EX, 514 nm;EM、524-560 nm。A655: EX, 633 nm;EM、650-700 nm。
   2. FFN511とmNGのシーケンシャルイメージングを使用して、これら2つのプローブ間のクロストークを回避します。画像記録のタイムラプスを1分に設定します(図1G)。

4. パッチクランプ記録と共焦点イメージング

1. 良好な細胞状態および適切な発現を有するディッシュを選択し、2μLの蛍光偽神経伝達物質FFN511(10mMストック、1:1,000作業溶液)を培地に加える。皿をインキュベーターに20分間戻します。または、ステップ 3.2 の後に FFN511 をロードし、時間を節約するのを待っている間にステップ 3.3 から 3.5 を実行します。
2. FFN511の装填が終了したら、記録チャンバーを準備し、500μLの浴液に2μLの蛍光色素A655を添加する(図2A および 表1)。カバースリップをピンセットでディッシュから記録チャンバー( 材料表参照)に移し、直ちにA655含有浴液を加える(図2B)。
   注:A655は-20 °Cに保たれ、濃度は10 mMで、動作濃度は40 μMです。
   警告: FFN511 または A655 に直接皮膚が触れないように、手袋を着用してください。
3. 100倍のオイル浸漬対物レンズ(開口数= 1.4)にオイル(屈折率:1.518、 材料表を参照)を1滴置きます。チャンバーを顕微鏡に取り付け、調整ノブを使用してオイルがカバースリップの底部にちょうど接触するようにしてから、アース線チップをバスソリューションに浸します(図2C、D)。
   メモ:室温での作業に適した浸漬油を選択してください。低倍率レンズと高倍率レンズの切り替えが不要です。室温は、記録中に約20〜22°Cに維持される。
4. 細胞に焦点を合わせ、明視野および共焦点イメージングを使用して、mNG発現を有する良好な細胞を見つける。選択したセルを拡大し、ビューの中央に調整して、空白領域を最小限に抑えます。
   注:蛍光標識の模式図を 図3Aに示す。良好な細胞は、通常、滑らかな膜ときれいな縁を有する(図3B)。落射蛍光または共焦点イメージングでは、良好な細胞は、明るいmNG発現を有する大きくて平らな底を有するように見える(図3C)。
   ピクセルサイズは〜50nmであり、異なるセルサイズおよびズーム係数に応じて〜40〜80nmの範囲内である。
5. FFN511、PH-mNG、およびA655の固定Z平面(XY/Z_固定 スキャン)で、最小の時間間隔でXY平面共焦点イメージングのパラメータを設定します。微調整ノブでセルの下部にフォーカスを調整します。
   注:PH-mNGは、共焦点XY平面断面(細胞底部を除く)における細胞原形質膜の輪郭を信号伝達する。細胞膜底部付近には、Ω形またはΛ形の膜侵入を反映したA655スポットが観察できる。Z焦点面が細胞底部よりも低い場合、すべての蛍光の強度は弱くなります。
6. ソフトウェアで励起レーザー出力を調整して、最適な信号対雑音比を取得し、著しい蛍光漂白を回避するための設定を見つけます。これを行うには、458nmで励起されたFFN511で2.5mWの電力、514nmで励起されたmNGの1mWの初期テスト値から始めます。HeNeレーザーで633nmで励起されたA655の場合、約12〜15mW(すなわち、最大値の70%〜80%)の高いレーザーパワーを使用し、連続励起すると、細孔が閉じられたときにΩ形状プロファイル内のすべての蛍光A655を漂白することができます。
   注:レーザー出力が高すぎると、PH-mNGおよびFFN511蛍光が迅速に漂白されます。レーザー出力が低すぎると、信号が弱すぎたり、ノイズが多すぎたりして分析できなくなります。
7. パッチピペットに9 μLの内部溶液(表1)を加え、パッチクランプアンプステージのホルダーにピペットを取り付けます( 材料表を参照)。
8. シリンジで少量の陽圧をかけ、ピペットチップを動かしてマイクロマニピュレーターで浴液に触れます。電圧パルステストでピペット抵抗が約2~4MΩであることをアンプが示していることを確認します。 LJ/Autoを押し て液体接合部をキャンセルします。
9. マイクロマニピュレーターでピペットを選択したセルに向かって動かします。細胞付着モードを形成するには、ピペットチップを動かして細胞に触れます(抵抗が増加します)。シリンジで静かに負圧をかけ(抵抗は1GΩ以上に増加します)、保持電位を0から-80mVに変更します。
10. 抵抗が1 GΩを超えたら、構成が安定するまで約30秒待ちます。 C-fast/Auto を押して、高速容量を補償します。
11. 全セルモードを形成するには、シリンジでパルス状短くて強力な負圧を印加してメンブレンを破裂させます(電流パルスの形状は、荷電および放電されたメンブレンコンデンサで変化します)。 C-slow/Auto を押して、遅い容量を補償します。
12. イメージングの焦点を少し調整して、セルの底に焦点を合わせます。共焦点タイムラプスイメージングとパッチクランプ記録を同時に開始するには、2つの異なるソフトウェアアプリケーションの [スタート ]ボタンをクリックします。
    メモ:共焦点イメージングソフトウェアは、〜20〜90 ms/フレームのレートでムービーを作成します。パッチクランプ記録には、10秒間の安静状態、1秒間の脱分極刺激、および刺激後の追加の49秒間が含まれる。パッチクランプ構成により、-80~+10mVの1秒分極解除によって誘起されるカルシウム電流、静電容量ジャンプ、および減衰の記録が可能です(図3D)。
13. 記録が完了したら、データが保存されていることを確認してください。保持電位を0mVに戻します。ピペットをバス溶液から取り出して廃棄します。
14. 手順4.7~4.13を繰り返して、ディッシュ内の別のセルを記録します。1時間の録音後、録音のために別の皿に変更します。
    メモ: 1 時間の記録後、パッチクランプの記録の成功率は大幅に低下します。データ収集の効率を高めるために、各皿に1時間だけ記録することをお勧めします。

5. パッチクランプデータ解析

1. データ分析用の適切なソフトウェア( 材料表を参照)を開きます。 PPT|をクリックしますPULSEファイル|のロード.dat ファイルをロードするためのファイルボタン。[ Do it (実行) ]をクリックすると、カルシウム電流と静電容量のトレースを含む4つのトレースが1つのグラフに自動的にプロットされます。
2. ウィンドウ|をクリックします。[新しいグラフ]ボタンをクリックし、Pulse_1_1_1、Y波の最初の波を選択し、[実行]をクリックしてカルシウム電流グラフをプロットします。ウィンドウ|をクリックします。[新しいテーブル] ボタンをクリックし、[Pulse_1_1_1] をクリックしてカルシウム電流の生データを表示し、複数の細胞の平均トレースをプロットするために使用できます。
3. カルシウム電流グラフにそれに応じて正方形を描き、 右クリックして 電流信号 を展開し 、ベースラインとカルシウム電流のピークを含めます。[グラフ|]をクリックします。 「情報を表示」(Show Info ) : カーソル A とカーソル B を表示し、それぞれベースラインとピークに移動します。グラフ情報が下部に表示され、パラメータを推定できます。
4. ステップ5.2を繰り返しますが、Pulse_1_1_1_Cm(Y波の2番目の波)を選択して、容量トレースをプロットします。ステップ 5.3 を繰り返し、A カーソルと B カーソルを適切な位置に配置して、ベースライン、振幅、減衰率などの容量パラメーターを測定します。
5. ステップ5.2の生データをスプレッドシートにコピーし、記録されたセルのグループの平均と標準誤差を計算し、カルシウム電流と膜容量の平均トレース(図3E)を適切なソフトウェアにプロットします。

6. 共焦点イメージングデータ解析

1. 製造元提供のソフトウェアで未加工のイメージングファイルを開きます( 材料表を参照)。
   注:ImageJやFijiなどの他の無料プログラムは、セクション4で取得した画像のデータ処理と定量化に利用できます。
2. 「|の処理」をクリックします。 ProcessTools を使用し、ツールを使用して、タイムラプス画像ごとにローリング平均(たとえば、4つの画像ごとのローリング平均)ファイルを生成し、それらのファイルを保存します。
   注:ローリング平均の後、明るさと背景を適切に調整して、3つのチャンネルの蛍光変化をよりよく示すことができ、融合事象を特定するのに役立ちます。融合事象のないいくつかの領域における蛍光強度をチェックすることは、融合事象の蛍光シグナルをバックグラウンドシグナルから区別するのに役立ち得る。
3. [ |を定量化する]ボタンをクリックツールの|スタックプロファイルは、刺激前後のタイムポイントをチェックして、各チャネルにおける蛍光変化を同定する。[ 楕円を描画] ボタンをクリックして、融合イベントの関心領域 (ROI) を丸で囲みます。画像 を右クリックし、[ ROI の保存]をクリックしてROI を保存します。
   注:3つの蛍光シグナルすべてをカバーするROIのサイズは、クロマフィン細胞²⁴における小胞サイズと類似していた。分析には生データを使用し、信号対雑音比を増加させるローリング平均化データは3つの信号を明確に示すために提供されました。
4. [ プロジェクトを開く ] をクリックして raw ファイルを見つけ、画像 を右クリックし、[ ROI の読み込み ] をクリックして ROI ファイルを raw イメージング ファイルに読み込み、蛍光強度を測定します。
   注:生の蛍光シグナルは、異なるチャンネルのトレースをプロットするために使用されます。各ROIについて、ベースラインは刺激前の強度として定義され、強度トレースはベースラインに正規化され得る。
5. [ツール|]をクリックします。ソフトウェアでROIをソートし、各ROIの3つのチャネルすべてのトレースをプロットします。[レポート]をクリックして、各ROIのデジタルデータとイメージングトレースの両方を含むROIデータをファイルフォルダに保存します。
   1. PH−mNG(F PH)およびA655(F655)スポット蛍光の強度の同時増加(単一フレーム内₎によって融合事象を同定し、FFN511スポット蛍光(F_FFN)の減少を伴う。
   2. 融合によって生成される_Ω プロファイルによるPH-mNG/A655スポット形成_を示すF PHおよびF655の出現を探し、原形質膜からのPH-mNGの拡散および浴中からのA655の持続的な拡散を可能にする。
   3. 融合孔開口による小胞からの放出を示し、F_PHおよび_F655の出現がエンドサイトーシスによって引き起こされる膜浸潤からのものである可能性を排除するF_FFN減少を探す。
   4. セルの下部でフュージョンイベントが発生していることを示すタイムラプスXY/Z_固定 画像を調べます。融合イベントの 3 つのモード (1) 近接融合、2) ステイフュージョン、3) シュリンクフュージョンを分析します。
      注:脱分極前に核融合事象が観測されることはめったになかったが、脱分極後には数十の核融合事象が観測できた。融合後、Ωプロファイルは、その細孔を閉じたり、開いた孔を維持したり、原形質膜に合流するために収縮したりすることがあります。
      1. 近接融着を特定するには、融着孔閉鎖が浴_A655の交換を妨げるため、F PHが持続し、PtdIns(4,5)_P2からPtdIns(4)Pへの継続的な変換を反映して、またはF_PHが小胞のピンチオフを反映して遅延して減衰するため、調光F 655を探してください(閉塞融合、図4A、B)。
      2. ステイフュージョンを同定するために、持続的なF_PH およびF₆₅₅ を探してください(図4C)。
      3. F_PH とF₆₅₅の平行な減少を探し、Ωプロファイル収縮を示して収縮融着を特定します(図4D)。
         メモ: 元のイメージングファイルを調べて、イベントタイプが不明な場合はイメージングトレースを調べます。融合事象のない一部の領域における蛍光強度をチェックすることは、融合事象の蛍光シグナルをバックグラウンドシグナルと区別するのに役立つ可能性がある。
6. FFN511、PH-mNG、およびA655の3つのチャンネルの強度変化の代表的なトレースをプロットします。各セルの異なる融合モードの割合を定量化し、図をプロットします。

結果

図1および図2に示される実験手順に従って、ウシ副腎由来のクロマフィン細胞をPH−mNGでトランスフェクトし、原形質膜を標識した。A655を浴液に添加して、融合孔閉鎖を検出した。蛍光偽神経伝達物質FFN511を放出の検出のために小胞に装填した。次に、FFN511、PH-mNG、およびA655のXY面共焦点タイムラプスイメージングを、細胞底部(細胞膜上方のZ焦点...

ディスカッション

共焦点顕微鏡画像化法は、ウシ副腎クロマフィン細胞4,24における融合孔および伝達物質放出のダイナミクス、ならびに3つの融合モード、近接融合、ステイ融合、および収縮融合を検出するために記載されている^4,24。細胞を脱分極させ、それによってエキソ細胞症およびエンドサイトーシスを呼び起こす電気生理学的方法が記載されている。体系?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187-500MG	ATP for preparing internal solution
Atto 655	ATTO-TEC GmbH	AD 655-21	Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons	Lonza	VSPI-1003	Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette	Warner Instruments	64-0795	Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G	Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M	Quality Biological	351-130-721	Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm	Falcon	352360	Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution	Sigma	232041	Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P	Sigma	11213873001	Enzyme for gland digestion
Coverslip	Neuvitro	GG-14-Laminin	GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885092	Reagent for preparing culture medium
EGTA	Sigma	324626-25GM	Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector	Amaxa Biosystems	Nucleofector II	Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10082147	Reagent for preparing culture medium
FFN511	Abcam	ab120331	Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877-250MG	GTP for preparing internal solution
HEPES	Sigma	H3375-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software	Leica	LAS X software	Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope	Leica	Leica TCS SP5	Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid	Sigma	49449-100G	Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier	Heka	Lock-in	Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M	Quality Biological	351-033-721EA	Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line	Hausser Scientific	3120	Counting chamber
Microforge	Narishige	MF-830	Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Millipore	SLGPR33RB	Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)	Allele Biotechnology	ABP-FP-MNEONSB	Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron	EIKO filtering co	03-100/32	Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10	Heka	EPC-10	Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP	Addgene	Plasmid #51407	Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller	Sutter Instrument	P-97	Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride	Sigma	P5404-500G	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software	Heka	Pulse	Software for patch-clamp data collection
Recording chamber	Warner Instruments	64-1943/QR-40LP	coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride	Sigma	S7653-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S8282-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate	Barnsted/Thermolyne	type 10100	Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL	Becton Dickinson	302832	Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride	Sigma	T2265-100G	TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor	Sigma	T9253-5G	Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid	Leica	195371-10-9	Leica confocal mounting oil