腸内細菌叢の調節による大腸炎に対する セレウス菌 投与の緩和効果の調査

要約

ここでは、抗生物質誘発性疑似細菌フリーデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスモデルを確立するためのプロトコルを提示し、腸内細菌叢の役割を調査します 大腸炎に対するセ レウス菌 のプラスの効果を調節する。

要約

腸内細菌叢の異常は、大腸炎の進行に役割を果たすと考えられています。しかし、大腸炎の緩和におけるプロバイオティクス投与の正確な基準は未だに定義されていません。ほとんどの分析方法は、腸内微生物の限られた多様性と存在量に依存しています。したがって、観察研究では因果関係を立証することはできません。本研究では、抗生物質誘導性偽無菌マウスを応用し、マウスのデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性大腸炎に対する セレウス菌(B. cereus)のプロバイオティクス効果の調節における腸内細菌叢の役割を調査した。このプロセスにより、 セレウス菌の補給が健康に及ぼす双方向の調節効果を評価することができ、安定した再現性のある結果が得られます。ここでは、大腸炎マウスのセ レウス菌 の培養、強制経口投与、便の採取、および抗生物質クリアランス治療の詳細なプロトコルを提供します。最適化法は、他の慢性炎症関連疾患にも適用できます。その結果、 セレウス菌 の投与により、体重減少、結腸長の短縮、疾患活動性指数、病理組織学的スコアが減少することが示されました。しかし、抗生物質による治療により、大腸炎 に対するセレウス菌 のプラスの効果が抑制されました。これらの結果は、腸内細菌叢が大腸炎に対する セレウス菌 の影響を緩和するために必要であることを示しています。したがって、この研究でプロバイオティクスの有益な効果を調査することは、慢性炎症関連障害の症状を緩和するための新しい治療戦略を開発するための有望なアプローチです。

概要

炎症性腸疾患(IBD)は、クローン病や潰瘍性大腸炎(UC)¹など、一般的な慢性消化管炎症性疾患です。炎症性大腸炎の現在の治療法は、5-アミノサリチル酸塩、コルチコステロイド、アザチオプリン、および抗生物質²です。さらに、これらの薬にはかなりの副作用があります³。したがって、大腸炎の治療に対するプロバイオティクスの影響にもっと注意を払う必要があります。

代替治療アプローチには、動物モデルや臨床試験で使用されてきたプロバイオティクス投与が含まれます。以前の研究では、セレウス菌やビフィドバクテリウム・インファンティスなどのさまざまなプロバイオティクス投与が大腸炎を緩和できることが示されています^4,5。前臨床試験では、プロバイオティクスの有効性と安全性を動物モデルで調査する必要があります。

デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)大腸炎マウスモデルは、大腸炎のメカニズムを探求し、プロバイオティクスのプラスの効果を評価するのに役立ちます。DSSの誘導は、腸粘膜のびらん、腸管バリア機能障害、および腸上皮透過性の増加をもたらします⁶。プロバイオティクスのほとんどのマウスモデルは、主に生物学的影響を強調しています。しかし、このプロバイオティクスの投与の背後にあるメカニズムは、プロバイオティクスと大腸炎の緩和との間の因果関係をさらに検証することに限界があるため、探求することは困難です。したがって、プロバイオティクスのメカニズムを調査するための標準化された方法を開発する必要があります。

従来、これらの研究では、特定のプロバイオティクスを無菌マウスに接種する必要があります⁷。しかし、無菌マウスをプロバイオティクスの受容体として使用するには、免疫能力が低いことや高価な無^{菌施設であること}など、実験室でいくつかの制限があります8。これらの制限を回避するために、偽無菌マウスを使用して、代替のDSS誘発性大腸炎モデルが確立されました。疑似無菌マウスモデルは、前述の^9,10のように抗生物質の適用によって確立された。

この記事では、抗生物質カクテルを使用して偽無菌マウスを確立します。また、マウス大腸炎モデルを確立および評価するための方法論を詳細に説明し、大腸炎の症状の緩和に対するプロバイオティクスの影響を調査します。以下のプロトコルは、強制経口投与によるプロバイオティクス送達の方法も提供します。

プロトコル

すべての手続きは、中国の安徽大学の実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って実施され、すべての手続きは中国の安徽大学の動物倫理委員会によって承認されました。IACUC(AHU)-2020-014)を参照。

1. 抗生物質の投与

1. アンピシリン(1 g / L)、ネオマイシン硫酸塩(1 g / L)、メトロニダゾール(0.5 g / L)、およびバンコマイシン(0.5 g / L)を1 L^{の飲料水5}に溶かして、抗生物質のカクテルを準備します。
2. 完全に溶解した後、溶液を4°Cで保存します。
3. 抗生物質カクテル溶液をウォーターボトルに入れます。ボトルをマウスケージの上に置きます。
   注意: 抗生物質溶液を光から保護するために、茶色のボトルを使用するか、ボトルをアルミホイルで包んでください。
4. 抗生物質カクテルを週に2回、新鮮な溶液に置き換えてください。
5. マウスが抗生物質カクテル溶液を4週間自由に飲むのを許してください。

2. DSS飲料水の調製と大腸炎の誘発

1. 2.5%デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)溶液を作るには、2.5gのDSSを100mLの蒸留水に溶解します¹¹。
2. 大腸炎モデルマウス群の飲料水を2.5%DSS溶液に交換します。大腸炎グループのマウスが他の飲料水にアクセスできないことを確認してください。その間、コントロールマウスをDSSなしで蒸留水で処理します。
3. 病原体のない条件下で、標準的な食物と水を自由に摂取できるハウスオスのC57BL/6Jマウス(平均体重、20g±2g、7週齢)。
   注:病原体のない条件下で、ケージごとに合計5匹のマウスを収容します。
4. 実験計画法
   注:動物実験は2段階で設計されました。各グループにつき5匹のマウスが含まれた。
   1. 第一段階: 大腸炎の緩和に対する セレウス菌 のプラスの効果を評価するには、マウスを次の 3 つのグループにランダムに割り当てます: 対照群 (対照)、DSS 誘発性大腸炎モデル (DSS)、プロバイオティクス セレウス菌 の DSS 誘発マウス (セレウス菌) の補給。
   2. 第2段階:DSS誘発性大腸炎に対する セレウス菌 のプロバイオティクス効果の調節における腸内細菌叢の役割を調査するために、マウスをABX(コントロール)、ABX(DSS)、およびABX(セレウス菌 + DSS)の3つのグループにランダムに割り当てます。
      1. ABX(コントロール)群のマウスを生理食塩水で治療します。
      2. 抗生物質カクテル溶液で4週間処理した後、ABX(DSS)グループのマウスに2.5%DSSを含む水を1週間、正常な生理食塩水を2週間投与します。
      3. 抗生物質カクテル溶液とDSS水で処理した後、ABX(B.セレウス +DSS)群マウスをB .セレウス (2×10⁸ 細胞)で毎日、胃内カニューレを使用して200μLの生理食塩水で治療します。
5. 抗生物質カクテルの投与後、直ちに雄のC57BL / 6マウスを飲料水中の2.5%DSS溶液で7日間処理します。.
6. DSS介入前のマウスの体重をベースライン体重として記録します。

3. B. cereusの定量化

1. 900 μLの滅菌生理食塩水で満たされた8本の1.5 mL微量遠心チューブを準備します。
2. 100 μLの対数成長 セレウス菌 をピペットで移し、900 μLの滅菌生理食塩水に溶解します。
3. チューブを使用して B.セレウス を連続希釈します。
4. 各希釈液40 μLを、希釈倍率でラベル付けした各LB寒天プレートにプレートします。希釈率ごとに3回繰り返します。
5. プレートを37°Cの恒温インキュベーターで16時間培養します。
6. カウントのために~20-70コロニーのプレートを選択します。選択したプレートの希釈倍数に従って平均細菌濃度を計算します。

4. B. cereus の強制用調製

1. セレウス菌の定量後、1 x 10⁹ CFUを含むセレウス菌培地1 mLを回収し、8,000 x gで10分間遠心分離します。次に、細菌細胞を滅菌水で2回洗浄し、8,000 x gで10分間遠心分離し、上清を除去します。
2. 濃縮された セレウス菌 を滅菌生理食塩水で最終濃度2 x 10⁸ CFU / 200μL⁴に希釈します。
3. 希釈液をピペットで上下に繰り返しピペットで動かし、分散した セレウス菌 懸濁液を取得します。
4. 強制罹患法が完了する前に、プレートカウント法による セレウス菌 濃度の定量化を行う。

5. セレウス菌 の強制経口投与による適用

1. 介入(200μLの生理食塩水に2 x 10⁸ CFUプロバイオティクス)をマウスに経口強制経口投与し、一定時間に投与します。
2. セレウス菌を投与するには、1mLシリンジに強制針(栄養針サイズ:20 G、38 mm)を接続します。マウス間で70%エタノールで強制針の外側を拭き、適切な用量の適用を維持します。.
3. マウスを拘束するには、マウスの尻尾をつかみ、尻尾の端をハンドラーの最後の2本の指の間に固定して、背中の緩んだ皮膚をしっかりとつかみます。
4. マウスを垂直位置に保ちます。次に、強制針を口から丁寧に優しく食道に挿入します。このステップで抵抗が見つからない場合は、針を胃にそっと押し込みます。
   注:薬物投与前に、マウスの規則的で妨げられない呼吸を確認してください。.
5. 針をゆっくりと進め、 セレウス菌 溶液を投与します。強制終了後、針を静かに引き抜いてください。マウスを放し、ケージに戻します。

6. 疾患活動性指数の決定

注:疾患活動性指数(DAI)は、マウスの体重減少、便潜血、および便の一貫性によって毎日計算されました。

1. マウスの体重を毎日測定します。体重減少率(0:0%、1:1%-5%、2:6%-10%、3:11%-18%、4:18%)に基づいて、各マウスに0〜4のスコアを割り当てます(0:0%、1%-5%、3:11%-18%、および4:>18%)。
2. 各マウスから新鮮な便サンプルを収集します。綿棒を使用して肛門の収縮を刺激し、排便を促進します。その後、排便直後に滅菌した遠心チューブに糞便サンプルを採取します。
3. 便潜血検査紙で便潜血を測定します。アプリケータースティックに10mgの便サンプルを採取します。
4. 試験片を試験カードに置き、カードに薄い塗抹標本を塗ります。バックフラップを開き、塗抹標本に現像液を塗布します。
5. 次に、便潜血検査紙を使用して120秒以内に潜血のスコアを付けます。
   注:塗抹標本の上または端にある青色の痕跡は、潜血に対して陽性です。便潜血スコアは、0:なし、1:血行陽性、2:軽度、3:便中の血痕、4:肉眼的出血でした。
6. 便サンプル¹¹を検出することにより、便の一貫性を特定する。0〜4のスコアを割り当てます(0:正常、1:軟便、2:半形成便、3:液体便、4:下痢)。

7. ティッシュコレクション

1. 実験の第1段階と第2段階の最後に10%クロラール水和物(10 mg / kg)を注入してマウスに麻酔をかけます。マウスの麻酔の深さをピンチ離脱反射で評価します。
2. 次に、マウスを頸部脱臼によって安楽死させます。
3. マウスを手術台の上に仰臥位で固定し、腹腔を開きます。
4. 結腸全体を外科的に分離し、定規で長さを測定します。
5. 次に、予冷したPBSを充填した5mLシリンジで結腸をやさしく洗浄します。

8. 組織学的損傷の評価

1. 結腸組織を細かく切開し、4%パラホルムアルデヒドに固定し、組織包埋機を用いてパラフィンに包埋します。
2. 次に、パラフィン包埋組織をミクロトームで切片化し、厚さ4μmの結腸組織切片を調製します。結腸部分を脱ろうして脱水します。次に、結腸切片をヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色します。
   注: 染色された結腸サンプルは、研究者によって次の測定のためのシステムで評価されます: 炎症性細胞浸潤の程度 (なし: 0、軽度: 1、中等度: 2、重度: 3)、粘膜損傷 (なし: 0、粘膜層: 1、粘膜下組織: 2、筋筋および漱膜: 3)、陰窩損傷 (なし: 0、1/3: 1、2/3: 2、全体: 3、全体 + 上皮の損失: 4)、病変の範囲(%)(0%:0、1%-25%:1、26%-50%:2、51%-75%:3、76%-100%:4)。組織学的損傷スコアの合計は、上記の測定値⁵ の個々のスコアごとに計算されます。
3. 2人の独立した実験者が、光学顕微鏡下でサンプルの組織学的スコアを評価(盲検化)します。

結果

B.セレウス のサプリメントと大腸炎
急性実験的大腸炎モデルは、飲料水へのDSS介入によって誘発されました。図1Aは、大腸炎マウスモデルへのセレウス菌投与の実験プロトコルを示しています。DSS誘導は明らかに体重(図1B)と結腸の長さを減少させました。経口強制経口投与によるセレウス?...

ディスカッション

プロバイオティクスを臨床試験で使用するためには、動物モデルにおけるプロバイオティクスの有効性と安全性を評価する必要があります。提供されたプロトコルは、以前に大腸炎の重症度を評価するために最適化されています。DSSで治療されたマウスは、腸の炎症のモデルであり、潰瘍性大腸炎に特徴的な臨床的および組織学的特徴を模倣しています^...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M PBS (powder, pH7.2–7.4)	Solarbio	P1010-2L
Absolute ethyl alcohol	Hushi	64-17-5
Acid alcohol fsat differentiation solution	Beyotime	No.C0163S
Agar	Sangon Biotech	9002-18-0
Ampicillin	Solarbio	69-53-4	Store at 2–8 °C
Anaerobic incubator	Long Yue	LA1-3T
Dextran sulfate sodium salt colitis grade	MP Biomedicals	160110
Electrothermal incubator	SANFA	HP-050A
General purpose tissue fixator	biosharp	BL539A
Glycerinum	Hushi	56-81-5
Hematoxylin and eosin staining kit	Beyotime	No.C0105
Kisser's Mounting Medium	Beyotime	No.C0181
Metronidazole	Solarbio	443-48-1	Store at 2–8 °C
Neomyein sulfate	Solarbio	1405-10-3	Store at 2–8 °C
Oscillating incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180S
Sodium chloride	Sangon Biotech	7647-14-5
Stool occult blood test paper	Baso	BA2020B
Tryptone	OXOID	2285856
Vancomycin	Solarbio	1404-93-9	Store at 2–8 °C
Xylene	Hushi	1330-20-7
Yeast extract	Sangon Biotech	8013-01-2