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要約

増加する証拠は、骨格筋内の脂質の過剰な浸潤が脂肪毒性および糖尿病をもたらすことを示している。ここでは、線維型特異的な方法で脂肪滴のサイズ、密度、および細胞内分布を定量化するために、組織処理、Bodipyによる染色、画像取得、および分析を含む完全なプロトコルを提示する。

要約

筋症として知られている骨格筋脂質浸潤は、肥満および老化とともに増加する。筋症はまた、心血管疾患および癌のようないくつかの他の障害のための負の予後因子として最近発見されている。過剰な脂質浸潤は筋肉量と強度を低下させます。それはまた、総筋細胞内脂質含量、脂肪滴(LD)形態、および細胞内分布に依存して脂肪毒性およびインスリン抵抗性をもたらす。酸化繊維は脂質を利用する能力が大きいため、繊維タイプ(酸化性対解糖系)も重要です。病態生理学におけるそれらの決定的な意味合いのために、LDのダイナミクスおよび繊維タイプ特異的な方法での機能に関する詳細な研究が正当化される。

本明細書では、筋細胞内脂質含量の定量化およびLD形態および細胞内分布の分析をファイバータイプ特異的な様式で分析するための完全なプロトコールが提示される。この目的のために、連続筋凍結切片を、蛍光色素Bodipyおよびミオシン重鎖アイソフォームに対する抗体で染色した。このプロトコルは、異なる筋肉の同時処理を可能にし、時間を節約し、可能性のあるアーチファクトを回避し、フィジーで作成されたパーソナライズされたマクロのおかげで、LD分析の自動化も可能です。

概要

筋症として知られている骨格筋脂質浸潤は、肥満および老化とともに増加する。筋症は、筋肉量および強度およびインスリン感受性1と負の相関がある。さらに、最近の研究は、筋食症の程度が心血管疾患2、非アルコール性脂肪性肝疾患3、または癌4などの他の状態の予後因子として使用できることを示している。脂質は、筋細胞外脂質として、または筋線維内の骨格筋に筋細胞内脂質(IMCL)として蓄積することができる。IMCLsは、主に脂肪滴(LD)中のトリグリセリドとして貯蔵され、身体運動中に代謝燃料として使用される5,6。しかし、脂質供給が需要を上回ったり、ミトコンドリアが機能不全になったりすると、IMCLは代謝的に不健康な肥満の個人や2型糖尿病患者に見られるように、筋肉インスリン抵抗性に関与します7。興味深いことに、持久力アスリートは、高いインスリン感受性を維持しながら、2型糖尿病の肥満患者に見られるものと同様のレベルのIMCLを有する。この現象は「アスリートのパラドックス」8,9として記述され、筋肉LDのサイズ、密度、局在化、動態、脂質種の組成に関連する筋肉LDのより微妙な評価によって説明される。

第1に、LDサイズはインスリン感受性および体力に反比例する10、11。実際、より小さいLDは、リパーゼ作用に対して比較的大きな表面積を示し、したがって、潜在的に、脂質12を動員するより大きな能力を有する。第二に、LD密度(数/表面)は、インスリン作用において物議を醸す役割を果たしている8,10;しかし、アスリートでは増えているようです。第3に、表面膜のすぐ下に位置するLDs(サルコレマール下または末梢)は、中心膜よりもインスリン感受性に対してより有害な影響を及ぼすので、LDの細胞内局在化は重要である8、9、13。後者は、より大きな呼吸活動を有し、収縮に必要な高いエネルギー需要を満たすためにより専門化された中枢ミトコンドリアに燃料を供給する14。対照的に、末梢LDは、膜関連プロセスに関与するサルコレンマル下ミトコンドリアを供給する8。最後に、トリグリセリドを超えて、筋肉内の特定の複合脂質は、他の脂質よりも有害であり得る。例えば、ジアシルグリセロール、長鎖アシルCoA、およびセラミドは、トリグリセリドの代謝回転率が低いときに筋肉に蓄積し、それによってインスリンシグナル伝達を損なう9、15。「アスリートのパラドックス」に戻ると、持久力アスリートはI型(酸化)線維において高い回転率を有する多数のより小さな中枢LDを有するが、肥満および糖尿病患者は、II型(解糖系)線維において低いターンオーバー率を有するより大きな末梢LDを有する8,15,16。エネルギー貯蔵および放出におけるそれらの役割に加えて、誘導脂肪酸(FA)およびコートタンパク質(ペリリピン5)を介したLDは、FA酸化およびミトコンドリア生合成の転写調節に関与する重要なプレーヤーとしても機能し得る8。生理学および病態生理学におけるそれらの決定的な意味合いのために、LDsのダイナミクスおよび機能に関する詳細な研究が正当化される。

IMCLを研究するにはいくつかの手法がありますが、繊維固有の方法でLDのサイズ、密度、および分布を正確に定量化するのには適していません。例えば、磁気共鳴分光法によるIMCLの評価は、非侵襲的でありながら、繊維内のLDのサイズおよび正確な位置を研究するのに十分ではないレベルの分解能を提供し、繊維タイプ特異的ではない17,18。同様に、全筋ホモジネート19に対して行われる生化学的技術は、脂質の位置およびサイズを評価することができない。したがって、LDの形態および位置を分析するための最も適切な方法は、定量的透過電子顕微鏡13であるが、この技術は高価で時間がかかる。したがって、オイルレッドO(ORO)20,21、モノダンシルペンタン(MDH)22、またはボディピー23,24,25などの色素を含む調製物に対する共焦点蛍光イメージングは、これらの研究のための最良のツールとして浮上している。

ここでは、組織サンプリングと処理、ボディ染色、共焦点画像の取得と分析を含む完全なプロトコルが説明され、マウス筋肉凍結切片におけるLDのサイズ、数、および局在を定量化します。IMCLは酸化性繊維と解糖系繊維の間で均等に分布しておらず、各繊維タイプはLDダイナミクスを異なる方法で調節するので、IMCLの研究は繊維タイプ特異的でなければならない16,25,26,27。したがって、このプロトコルは、シリアルセクションの免疫蛍光を使用して、各ファイバーによって発現されるミオシン重鎖(MyHC)アイソフォームを同定します。このプロトコルのもう1つの利点は、解糖系(伸筋デジトルムロンガス、EDL)と酸化的(ヒラメ)筋肉を同時に処理して凍結前に並べて配置することです(図1)。この同時処理により、時間を節約できるだけでなく、サンプルの個別の処理による変動も回避されます。

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図1:手順の概略概要 筋肉解剖(1)後、類似の大きさの選択された筋肉が調製され、一緒に凍結される(2)。10μmの連続横切片は、クライオスタットを使用して得られ、接着スライドに直接取り付けられる(3)。2つの連続スライドから、第1の(4A)はラミニンについて免疫標識され、LDを認識するためにボディピーで染色され、第2の(4B)は筋線維タイプの認識のためにMyHCに対する抗体で免疫染色される。画像は、ボディピーの共焦点顕微鏡(5A)および筋線維タイプの落射蛍光顕微鏡(5B)を使用して取得される。フィジーでは、閾値を適用し、粒子(6A)を定量化して、LD(7)または計数細胞(6B)が占める総面積の数、平均サイズ、密度、および割合を取得して、セクション(7)内の各タイプの繊維の割合を得ることによって、画像が分析されます。略語: LDs = 脂肪滴;EDL = 伸筋デジトーラム・ロンガス;MyHCs=ミオシン重鎖アイソフォーム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

マウスに対して実施されたすべての手順は、ルーヴァン・カトリック大学の医学部門の動物実験倫理委員会によって承認されました(2019/UCL/MD/013)。

1. 凍結用試料の解剖・調製

  1. 筋肉の各ペアに厚さ3mmのコルク片にラベルを付けます。
  2. コルクの中央に刃先で作った小さな切開部を通して、支持体となる長方形の硬質プラスチック片(0.5 cm W、1 cm H)を垂直に挿入します(図2B)。
    注:長方形のプラスチック片のサイズは、筋肉のサイズによって異なります。ここで、記載された寸法は、生後3ヶ月のC57BL/6J雄マウスのヒラメ(〜9mg、1cmL、2〜3mmW)およびEDL(〜5mg、1cmL、2〜3mmW)のサイズに適合している。
  3. 解剖時には、マウス後肢のヒラメおよびEDLを除去する。解剖中にサンプルが乾燥するのを防ぐために、氷の上に置かれたペトリ皿に生理食塩水で軽く湿らせた圧縮の上にそれらを置きます。
    注:これら2つの四肢の筋肉を解剖する方法の説明については、Wang et al.28 を参照してください。
  4. 最適切削温度コンパウンド(OCT)をコルク/プラスチック接合部に少量置き、気泡を避けます。
  5. サンプルをペーパータオルで優しく乾燥させて余分な水分を取り除き(図2A)、コルクに垂直なプラスチックに両方の筋肉を置きます(図2C)。
  6. 実体顕微鏡下で筋筋線維の向きを確認する(図2D)。
    注:その絶縁効果は急速な凍結を防ぎ、凍結アーチファクトを生成するため、OCTで筋肉を覆わないことが重要です。

2. 凍結切断のための凍結骨格筋サンプル

警告: 筋肉の凍結は、適切な個人用保護具を装着した状態で、化学フードの下で行う必要があります( 「材料表」を参照)。

  1. 長さ25cm以上の2つのサイドストラップが取り付けられたステンレス製のタンブラー(高さ約8cm、6cmØ)を使用し(図2F)、タンブラーを容量の2/3までイソペンタンで満たします。
  2. タンブラーのストラップをつかみ、容器外の窒素レベルが内部のイソペンタンのレベルを超えるように、液体窒素で満たされたポリスチレンボックスに静かに浸します(図2F、G)。
    警告: タンブラーが窒素に接触すると、熱衝撃によって渦巻くことがあります。タンブラーが十分に浸漬されていることを確認してくださいが、イソペンタン沈殿を引き起こすため、窒素の侵入を避けてください。このような場合は、イソペンタンを冷やし、タンブラーを新しいイソペンタンで満たし、最初からやり直してください。
  3. タンブラーの内部がイソペンタンの白色固体層で完全に覆われたら、液体窒素ボックスから取り出します(図2H)。
    注:イソペンタンの溶融温度は-159°Cであり、タンブラーの端は十分に寒いときに白くなります。
  4. 固体イソペンタン片を、全体積が再び液体になるまで鉗子で残りの液体イソペンタンに穏やかに攪拌する。
  5. イソペンタンがタンブラーの底部と端全体に白い小石を形成するまで、タンブラーを液体窒素に再浸漬します(図2G,H)。
    メモ:この2番目の冷却ステップは、イソペンタンの適切な凍結温度を保証します。
  6. 液体窒素からタンブラーを取り出し、ラットの歯のピンセットでコルクを保持しながら、タンブラーの底に筋肉を素早く浸します。コルクをイソペンタンで15秒間旋回させ、処理するまで-80°Cで保管します(図2I)。
    メモ:短期間保存する場合、サンプルは-20°Cの冷凍庫に保管することができます。骨格筋の急速凍結のための完全なプロトコルは、すでに他の場所で公開されています。詳細な参考文献とトラブルシューティングについては、Meng et al.29、Kumar et al.30、および Leiva-Cepas et al.31 を参照してください。

3. 凍結切断

  1. サンプルを、事前に-20 °C に冷却し、ブレード温度を -25 °C に設定したクライオスタットのチャンバーに入れます。
    メモ: -20 °C/-80 °C の冷凍庫からドライアイスで満たされたポリスチレン製ボックス内のクライオスタットにサンプルを輸送し、切断前にチャンバー温度まで少なくとも 20 ~ 30 分間平衡化できるようにします。
  2. 細かいピンセットでコルクからプラスチックを取り出し、クライオスタット標本ディスクを急速凍結プレートの上に置き、冷却します。プレートが-50°Cに達したら、ディスクにOCTを置き、コルクをディスクの上に置き、しっかりと押します。OCTが固まり、コルクがディスクにしっかりと固定されるまで待ちます。
  3. 目的の切断方向(図2J、K)で対象物頭にディスクを置き、筋肉の長さの少なくとも1/3を超えて、筋肉の両方の断面が見えるまで筋肉ブロックをトリミングします。
  4. 切断厚さを10μmに設定し、接着スライドに1つのセクションを置き、明視野顕微鏡で繊維の正しい配向を確認します。
    メモ: ファイバーの横方向の向きを確認することが重要です。繊維の向きが適切でない場合は、オブジェクトヘッドの角度を調整し、別のセクションをカットしてもう一度確認します。
  5. 2つの予めラベル付けされた接着スライドに2つの連続断面を配置します:1つのスライドは繊維タイプを決定し、もう1つは脂質含有量を定量化します(図2L)。
    注:追加の連続断面が得られ、他の組織学的研究のために-80°Cに保たれます。しかしながら、脂質含量および細胞内形態24の変化を避けるためには、風乾を防ぐために切断直後に最初の2枚のスライドを処理することが不可欠である。LD定量化のためにスライドを凍結および解凍しても同じ効果が得られるため、非常にお勧めできません。

4. ファイバータイピングとボディ染色

  1. 筋線維型の免疫組織化学的検出
    注:以下のプロトコールの場合、250μLの総溶液量は、1セント硬貨のおおよその大きさの疎水性ペンで描かれた円で囲まれた筋肉部分全体を覆うのに十分である。
    1. 疎水性ペンで描かれた輪郭で切片を囲み、氷冷した0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で室温(RT)で1分間すすいでください。スライドを湿潤チャンバーに入れ、ブロッキング溶液(PBS中の10%正常ヤギ血清(NGS)およびマウス上のマウス(MOM)ブロッキング試薬)中で37°Cで90分間ブロックする。
    2. ブロッキング溶液を除去し、一次抗体(5%NGS、1:30 MOMブロッキング試薬、I型を認識するマウス一次抗体(IgG2b、1:10)、IIa型(IgG1、1:10)、およびIIx型(IgM、1:5)繊維およびラット抗ラミニン(α2鎖、 1:1,000) (PBS 単位)。
    3. スライドをPBS 3 x 5 minでRTで洗います。
    4. 二次抗体(PBS中のヤギ抗IgG2b AF405(1:500)、ヤギ抗IgG1 AF488(1:500)、ヤギ抗IgM AF568(1:1,000)、およびヤギ抗ラミニンAF647(1:500))を含む溶液と共にRTで1時間暗所でスライドをインキュベートする。
      警告: プロトコルの残りの部分では、蛍光を保つためにスライドを光から遠ざけてください。
    5. PBSで再度3 x 5分間洗浄し、二重蒸留H2Oですすぎ、余分な水分を取り除き、退色防止試薬でマウントします。
      メモ:スライドを4°Cで保存し、光から保護して画像取得まで蛍光を維持します。スライドは固定されていないため、各実験に新しく作られた溶液を使用し、PBSをオートクレーブし、切片の汚染を避けるためにできるだけ早く画像を取得することをお勧めします。
  2. ボディピーによるLDの染色
    注:ステップ4.1と同様に、250μLの総溶液量は、1セント硬貨のおおよその大きさの疎水性ペンで描かれた円で囲まれた筋肉部分全体を覆うのに十分である。
    1. 疎水性ペンで描かれた輪郭で切片を囲み、氷冷0.1 M PBSでRTで10分間すすぎます。すべてのすすぎと洗浄には氷冷PBSを使用してください。
    2. メタノールを含まない冷たい4%パラホルムアルデヒド(PFA)でRTで10分間固定します。最初のクイックリンスの後、RTでPBS 3 x 5分でスライドを洗い流します。
      警告: この手順は、化学フードの下で実行してください。
    3. 湿気の多いチャンバーにスライドを置き、PBSで5%NGSでRTで1時間ブロックします。
    4. スライドを一次抗体(PBS中の2%NGSおよびラット抗ラミニン(α2鎖、1:1,000))の溶液と共に37°Cで90分間インキュベートする。スライドをPBS 3 x 5 minでRTで洗います。
      警告: プロトコルの残りの部分では、蛍光を保つためにスライドを光から遠ざけてください。
    5. PBS中のヤギ抗ラットAF647抗体(1:500)を含む二次抗体溶液と共にRTで1時間インキュベートする。スライドをPBS 3 x 5 minでRTで洗います。
    6. PBS中の4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、0.5μg/mL)およびBODIPY(1μg/mL)の溶液を用いてRTで20分間インキュベートする。
      注:BODIPY原液を調製するには、DMSOに1mg/mLの濃度で溶解します。異なるボディピー製剤がLD染色のために市販されている。行った選択に応じて、染色方法は同じです(同じステップ、濃度、およびインキュベーション時間)。ただし、取得方法は若干異なります。
    7. 最初のクイックリンスの後、RTでPBS 3 x 5分間スライドを洗浄し、ダブル蒸留H2Oですすぎ、余分な水分を除去し、退色防止試薬でマウントします。
      メモ:スライドを光から保護した4°Cで保存し、画像が取得されるまで蛍光を保持します。

5. 画像の取得

注:染色プロトコルが完了したら、汚染を避けるためだけでなく、LDの形態、サイズ、および数を維持するためにも、直ちに画像取得(次の24時間以内)に進むことが重要です。

  1. サンプリングした各筋肉の線維型を評価するための画像の取得
    注:このステップは、スライド全体の蛍光走査顕微鏡または従来の落射蛍光顕微鏡で達成できます。後者では、セクションを再構築するために、画像の手動または自動ステッチングを行う必要があります。
    1. ファイバー型認識には、対物レンズが10x/0.3の落射蛍光顕微鏡を使用してください。DAPI(405 nm)、FITC、TRITC、および Cy5 の励起フィルターを選択して、それぞれ I、IIa、IIx ファイバー、およびラミニンを検出します。
      注:タイプIIb繊維は免疫標識されません。それらは、黒い筋漿を有するサルコレンマの限界でラミニンによって染色された繊維として認識されるであろう。
    2. 各チャンネルの適切な露出時間を調整します。
    3. 従来の落射蛍光顕微鏡を用いる場合、筋肉再建を容易にするために常に同じ順序に従って筋肉全体の画像を取得する。1 つのイメージの右端のファイバーが、次のイメージの左端にも表示されることを確認します。画像の上部と下部についても同じことが言えます(図3A)。
      注:参考として、生後3ヶ月のマウスから解剖されたEDLまたはヒラメのセクションでは、それぞれ平均6枚と8枚の画像が筋肉断面全体をカバーします。
    4. 筋肉をスキャンした後、繊維形態(ラミニン)と筋肉部の組織学に基づいて、撮影したデジタル画像を再構成(ステッチング)用の画像処理ソフトウェアにアップロードし、すべてのチャンネル(色)をマージしたTIFF、PNG、またはJPGファイルとして保存します(図3A)。
  2. ラミニンとボディピーの共染色による画像の取得
    注:繊維タイプを認識し、キャプチャされた各タイプの繊維数の推定値を得るには、ボディピラミニンの画像取得を開始する前に、繊維タイプのセクションをすでにスキャンし、筋肉を再構築することが不可欠です(図3B)。
    1. ボディピー像の観察と取得には、開口数1.4の40倍油浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用してください。
    2. 1 AU のピンホール、2,048 ピクセル x 2,048 ピクセルの解像度、0.08 μm のピクセル サイズ、一方向モード、スキャン速度 4 (~4 μs/ピクセル)、ライン平均を 4 倍に設定、デジタル ズームを 1 に設定します。
    3. Bodipy-558/568とラミニン-AF647の間のクロストークを回避するには、共焦点ソフトウェアでシーケンシャルスキャンモードを使用します。
      注:選択した色素がBodipy-493/503の場合、ボディピーチャンネルとラミニン-AF647チャンネルの間にクロストークなしで同時共焦点レーザースキャンが可能です。これにより、画像の取得が高速化されます。
    4. Bodipy-493/503は488nmレーザーラインまたはアルゴンレーザーラインで励起し、Bodipy-555/568は561nmダイオードレーザーラインを使用して励起します。最後に、640nmのダイオードレーザーラインでラミニン-AF647を検出します。
      警告: ボディピー分子はフォトブリーチングに非常に敏感であるため、不要なレーザースキャンは避けてください。繊維を認識するには、ラミニンにレーザーのみを使用してください。
    5. 選択した色素に応じて、Bodipy-493/50324 の場合は 570-650 nm、Bodipy-558/568 の場合は 565-620 nm に発光範囲を設定します。ラミニンの発光範囲を656-700nmに設定します。
    6. ゲインとデジタルゲインを適切に設定して、レンジインジケータで飽和ピクセルが検出されないようにします。オフセットを調整してバックグラウンド信号を修正します。
      メモ:フィルターの選択と上記のその他のスキャンパラメータは、共焦点顕微鏡ごとに最適化する必要があります。上記のすべての設定は、サンプルからキャプチャされたすべての画像を比較するために一定に保たれることが重要です。
    7. 共焦点顕微鏡で可視化されたものの中からファイバーの種類を特定するには、ファイバー型免疫検出後に再構築された断面の画像をチェックするパーソナルラップトップを使用します(図3B)。
    8. 繊維のグループが正しく識別されたら、ボディピーチャンネルとラミニンチャンネルで画像を取得します。
      注:LDの後の線維特異的分析を容易にするために、MyHC認識のために取得した画像上のこれらの線維が位置する筋肉の領域に身体ラミニン画像名を書き留めておくことが推奨される。

6. 画像の解析

  1. 各筋肉サンプルの繊維タイプの分析
    1. フィジー(またはImageJ)32で、ファイバーアイソフォームを検出するために使用されるすべてのチャネルのマージから得られた再構築された筋肉を含むTIFF、PNG、またはJPGファイルを開きます。
    2. セルカウントツールを起動するには、[プラグイン]||の分析セルカウンター|セル カウンター。
    3. [ セル カウンター ] ウィンドウで、[ アクション] | をクリックします。初期化します。
    4. 同じウィンドウ の [カウンター] で、[ タイプ 1] を選択します。
    5. フィジーのメインウィンドウ で、ワンド ツールを選択します。
    6. 各タイプのファイバーの数を定量化するには、同じタイプの各ファイバーをクリックして、クリックされたファイバーの数を記録します。
    7. 完了したら、次のタイプのファイバーを選択し、同じ手順を繰り返します。
    8. 画像のすべてのファイバーが特定のファイバータイプに割り当てられたら、[セルカウンター]ウィンドウの[結果]をクリックして結果をテーブルに表示します。
    9. このテーブルをスプレッドシートのテーブルとして保存するには、[ファイル] |[結果] ウィンドウで [名前を付けて保存] をクリックします。
    10. セルカウントウィンドウで、それぞれ「マーカーの保存」または「マーカーの読み込み」をクリックして、同じ画像の選択内容をいつでも保存および再読み込みできます。
  2. 線維型依存的な脂肪滴の解析
    1. LDの定量化のためにフィジーを使用して共焦点で得られたボディピーとラミニンの画像を解析します。
      注: 著者らは、分析を自動化するためにカスタマイズされたマクロを設計しました。このマクロは、その使用方法に関する詳細な説明とともに、それぞれ 補足ファイル 1 および 補足ファイル 2 として入手できます。
    2. フィジーの バイオフォーマットインポーター の助けを借りて、各画像を開きます。[ スタックの表示方法] オプションで 、[ ハイパースタック |] を選択します。カラーモード、デフォルト。 「自動スケール」 ウィンドウが選択されていることを確認します。
      メモ: 次の手順では、画像上の 1 つのファイバーを分析するためのプロトコルについて説明しますが、ファイバー全体の数が画像に表示される回数だけ繰り返す必要があります。
    3. フリーハンド選択ツールを使用して、ラミニンチャネルに基づいてファイバのサルコレンマを手動で選択し(図4A)、キーボードのTを押してROIウィンドウの選択または関心領域(ROI)を記録します。
    4. フィジーの メイン ウィンドウに移動し、[ |の分析]をクリックします。「測定値」を設定し、ポップアップウィンドウで「 面積 」と 「フェレットの直径」を選択します。残りのボックスとその他のパラメータは、デフォルトで表示されるままにしておきます。
    5. ROIウィンドウの[測定]をクリックして、選択した繊維の面積と最小フェレの直径(MF)を取得し、後で使用するためにメモしておきます。
      注:LDを分析する場合、LDのサイズと密度は繊維の中心と末梢(サルコレンマル下領域-SS)の間で異なることに留意することが重要です。したがって、分析は個別に実行する必要があります。
    6. MF の 1/6 の値を計算して、ファイバーの中央部分を区切ります。
      メモ: マクロでは、デフォルトの MF 値は 6 に設定されており、これは適用される縮小が MF の 1/6 として設定されることを意味します。この値は、高脂肪食を与えられた動物のヒラメから得られた経験的データに基づいて選択された。しかし、各研究者は、経験的データと分析された筋肉、繊維の種類、および動物の状態に基づいてこの数値を変更する必要があります。
    7. ROIウィンドウで、[追加]をクリックして最初のROIの複製を作成し、ウィンドウに表示される2番目のROIを選択します。
    8. フィジーのメインウィンドウで、[|の編集]をクリックします。 セレクション|以前に計算した値(ステップ6.2.6から)を拡大して導入し、数字の前にマイナス記号を付けて[ OK]をクリックします。ROIウィンドウで、[追加][ t ](3番目のROIが表示される必要があります)と [削除]をクリックして、2番目のROIを削除します。
      注:研究者は、ROIウィンドウの[すべて表示]ボックスをクリックして結果を確認できます。この時点で、ファイバの全周を囲むROI(図4B)と中央に配置されたROI(図4C)の2つのROIが表示されます。
    9. ROIウィンドウで両方の ROI を選択し、[ その他の|]をクリックします。XOR |追加[t]。ファイバの周辺に対応する3番目のROIが表示されるのを待ちます(図4D)。
    10. [詳細] をクリックして ROI を保存 |保存 して、同じファイバーを後で再分析する必要がある場合に備えて、ROI を節約します。
    11. ボディピーチャンネルを選択し、画像|をクリックしてしきい値ツールを開きます|の調整フィジーのメインウィンドウのしきい値。
    12. [ しきい値] ポップアップ ウィンドウで、値を 70/255 に設定し、[ 円|] を選択します。白黒メソッドをクリックし、 暗い背景|適用します。
      注: しきい値に適用される値は、実験の条件によって異なる場合があり、分析を最適化するには しきい値 を適切に設定する必要があります。白で示したスレッショルド制限を超えるボディ信号と黒の背景を持つB&Wウィンドウが表示される必要があります( 図4E の元のボディピ画像と 図4Fの画像を比較してください)。
    13. フィジーのメインウィンドウに移動し、[|の分析]をクリックします。[測定値]を設定し、ポップアップウィンドウで、[面積]、[面積分数]、[しきい値に制限]を選択します。残りのボックスとその他のパラメータは、デフォルトで表示されるままにしておきます。
      注: 研究者が LD の「円形度」を分析する場合 (完全な球の場合は 1 から線の場合は 0 の範囲の球面形態のインデックスです) は、[測定の設定] ポップアップ ウィンドウの [形状記述子] ボックスをクリックします。
    14. ROIウィンドウに移動し、最初の ROI を選択します。フィジーの メイン ウィンドウで、[ |の分析]をクリックしますパーティクルの解析ツール。
      メモ: このツールは、各選択範囲のパーティクルがカバーする合計面積の数、サイズ、カバーされる面積、および割合を定量化し、結果をスプレッドシートファイルとして保存します。
    15. [パーティクルの解析]ウィンドウで値を2から無限大(2-無限大)に設定し、[ピクセル]チェックボックスをオンにしてデフォルトの円形度値を維持し、[要約]を選択して[OK]をクリックします。
      メモ: ファイバーの結果を確認するには、[表示] オプションで、使用可能なオプションのいずれかを選択します。テーブル内の選択範囲で各 LD の情報を認識させるには、[パーティクルの解析]ウィンドウの[結果の表示]オプションをオンにします。繊維の総面積の分析結果は平均化され、いくつかの列(数、総面積、平均サイズ、%面積;これらは粒子の数[LD]、これらの粒子が占める面積、それらの平均サイズ、および粒子が占める選択の総面積に対する割合、 それぞれ)。密度を計算するには、パーティクルの数を各選択範囲の合計面積で割ります。
    16. ファイバーの中心と周辺値を取得するには、ステップ 6.2.14 と 6.2.15 を繰り返し、2 番目 (中心) と 3 番目の ROI (周辺) を毎回選択します。
    17. [ファイル]をクリックして結果を保存 | [概要] ウィンドウに [名前を付けて保存] をクリックします。
      メモ: 結果の割り当てられた名前にファイバーの種類、条件、およびイメージ名を含めて、後でデータの統一と統計分析を容易にします。同じ画像内の残りの繊維を分析するには、手順 6.2.3 ~ 6.2.17 を繰り返します。統計分析のためには、動物1匹あたり少なくとも10〜15本の各タイプの繊維を分析しなければならない。

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結果

本明細書に記載されるプロトコルは、ファイバータイプおよびサブセルラー特異的な様式でLDsを容易に定量するための効率的な方法を提供する。EDLとヒラメなどの同様のサイズの2つの筋肉を一緒に凍結することによって、次のステップに費やされる時間とリソースが半分に減少する方法を示しています。

免疫染色、画像取得、および成体マウスの筋肉で発現するさまざ?...

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ディスカッション

ここで詳述するプロトコルは、繊維タイプおよびサブセルラー特異的にBodipyでタグ付けされたLDを定量する効率的な方法を説明しています。近年、OROやスーダンブラックBなどの古典的な脂質色素は、中性脂質に結合する細胞透過性、親油性、蛍光色素(例えば、Bodipy)の新しい配列で置き換えられています。異なるコンジュゲートとして利用可能なBodipyは、異なる固定組織および細胞23、

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は 、Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20)と Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care)からの助成金によって支援されました。M.A.D.-L.d.C.はワロニー・ブリュッセル国際エクセレンス・プログラムからフェローシップを受けました。

著者らは、このプロトコルの開発に貢献したアリス・モニエと、画像取得プロセスにおける彼女の専門知識と技術的支援に対してキャロライン・ブーザンに感謝します。我々はまた、クライオスタット及び顕微鏡へのアクセスについて、2IP-IRECイメージングプラットフォーム(2IP-IRECイメージングプラットフォーム、実験臨床研究所、ルーヴァンカトリック大学、1200ブリュッセル、ベルギー)にも感謝する。最後に、著者らは、原稿の建設的な批判に対して、ニコラ・デュビュイソン、ロマン・ヴェルセル、ミシェル・アブー=サムラに感謝したい。これらの記事の数字のいくつかは、BioRender.com で作成されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix cameraZeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera Zeiss
Chemical hoodPotteau LaboEN-14175
Confocal microscopeZeissLSM800
Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick) Electron Microscopy Sciences63305
Cryo-GlovesTempshield16072252
Cryostat Thermo Scientific Microm Cryo Star HM 560
Dissecting Stereo Microscope SMZ745Nikon
Dry Ice
Dumont ForcepsF.S.T11295-10
Epifluorescence microscopeZeissAxioImage-Apotome Z1
Extra Fine Bonn ScissorsF.S.T14084-08
FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm)ThermoFisher22-363-552Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing
Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)BRAND Petri dish, MERKBR455751Used to place the muscles on ice during dissection
ImmEdge Hydrophobic barrier PAP PenVector LabsH-4000Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections
IncubatorMMM MedcenterIncucell 707 
Microscope Cover Glasses (24x50 mm)Assistent 40990151
Microscope Slide Boxes Kartell278Used as humid chambers for immunohistochemistry
Neck holderLinie zwoSB-035X-02Used as strap to hold the stainless steel tumbler
No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel BladeSwann-Morton0205
Paint brushesVan BleiswijckAmazon B07W7KJQ2XUsed to handle cryosections
Permanent Marker Pen BlackKlinipath/VWR98307-RUsed to label slides
Pierce Fixation ForcepsF.S.T18155-13
Polystyrene Box H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat
Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3AesculapBB073R
Stainless Steel Cup 10oz EboxerB07GFCBPFHTumbler to fill with isopentene for muscle freezing
Superfrost Ultra Plus slidesThermoFisherJ1800AMNZ
Surgical tweezers 1/2 teethMedische Vakhandel1303152Also called "Rat teeth tweezers"
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting EdgeF.S.T15000-00
Weighing boatsVWR international611-2249
Whole-Slide Scanner for FluorescenceZeissAxio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2bSigma-AldrichSAB4600477Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1ThermoFisherA-21121Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgMAbcamab175702Used at a final concentration of 1:1,000
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibodyThermoFisherA-21247Used at a final concentration of 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)ThermoFisherD3922Used at a final concentration of 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)ThermoFisherD3835Used at a final concentration of 1 µg/mL
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)ThermoFisherD1306Used at a final concentration of 0.5 µg/mL
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD-8418Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9Sigma-Aldrich1004969011CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Isopentane GPR RectaPurVWR international24872.298CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection.
Liquid NitrogenCAUTION:  Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids.
Mouse on mouse Blocking Reagent Vector LabsMKB-2213-1Used at concentration of 1:30
Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2bDSHB University of IowaBA-D5-supernatantUsed at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene:  MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1DSHB University of IowaSC-71-supernatantUsed at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene:  MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgMDevelopmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa6H1-supernatantUsed at a final concentration of 1:5
Normal Goat Serum (NGS)Vector LabsS-1000
PBS 0.1 MCommonly used on histology laboratories
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen P36930
Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal)Sigma-AldrichL0663Used at a final concentration of 1:1,000
Tissue-Tek O.C.T compoundSakura 4583
Software
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.Used to design the figures
Adobe PhotoshopAdobe Inc.Confocal software
BioRenderhttps://biorender.com/Used to design the figures
Fiji/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/Used to analyse the acquired images
Microsoft PowerPointMicrosoftUsed to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types
Zen Blue 2.6ZeissUsed to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types

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