眼表面疾患の治療のための多血小板血漿ライセート

要約

血小板溶解物は、眼の表面疾患の治療のための新たなツールを表しています。ここでは、血小板ドナーから採取した血小板溶解液の調製、分注、保存、および特性評価の方法を提案する。

要約

さまざまな眼の表面疾患は、血液由来の点眼薬で治療されます。それらの使用は、眼の表面再生を促進する代謝産物および成長因子含有量のために臨床診療において導入されている。血液ベースの点眼薬は、さまざまな供給源(すなわち、全血または血小板アフェレーシスの寄付)から、および異なるプロトコル(例えば、異なる希釈および凍結/解凍サイクル)で調製することができる。この変動性は、臨床プロトコルの標準化を妨げ、その結果、臨床効果の評価を妨げます。方法論的手順を詳述し、共有することは、共通のガイドラインの定義に貢献する可能性がある。過去数年間、同種異系製品は、より高い有効性基準を保証するため、自家治療の代替として普及しています。その中で、多血小板血漿溶解物(PRP-L)点眼剤は簡単な製造手順で調製されます。イタリアのAUSL-IRCCSディレッジョエミリアの輸血医学ユニットでは、PRP-Lは血小板アフェレーシスの提供から得られます。この製品は、最初に0.9%NaClで0.3 x 10⁹ 血小板/ mL(1 x 10⁹ 血小板/ mLの平均濃度から開始)に希釈されます。希釈された血小板は凍結/解凍され、その後、破片を除去するために遠心分離されます。最終容量を1.45 mLアリコートに分割し、-80°Cで保存します。 患者に調剤される前に、点眼薬は無菌性についてテストされます。患者は血小板溶解物を-15°Cで最大1か月間保存できます。成長因子組成も無作為に選択されたアリコートから評価され、平均値がここで報告されます。

概要

血液由来製品は、創傷ケア¹、顎顔面および整形外科手術、およびドライアイ疾患(DED)³などのさまざまな眼表面疾患²の治療に広く使用されています。DEDでは、涙液膜の恒常性は、涙液の生成および眼の表面の完全性に関与するさまざまな要因の異常な機能の結果として損なわれます^4,5。

DEDは、原因と重症度の不均一性を特徴とします^6,7,8 そして、老化、性別9、コンタクトレンズ、局所または全身薬10、またはシェーグレン症候群¹⁰のような既存の状態などのさまざまな要因の結果である可能性があります。軽度の症状にもかかわらず、DEDは世界中の何百万人もの人々に影響を及ぼし、生活の質と医療システムにも影響を及ぼします⁶。

この病状に対して多くの治療法が報告されていますが、最も効果的な解決策についてはまだコンセンサスがありません¹²。今日まで、人工涙液は涙液膜の水性組成物を回復することを目的とした治療の第一線であるが、これらの代替物は天然涙液の主要な生物学的に活性な溶質を含まない^6,11。血小板ベースの製品は、人工涙液の有効な代替品^12,13と考えられていますが、その臨床効果、使用の推奨事項、および調製方法はまだ議論の問題です³。

血液ベースの製品は、代謝物¹⁴、タンパク質、脂質、ビタミン、イオン、成長因子(GF)、抗酸化化合物¹¹、および浸透圧(300 mOsm / L)¹¹の点で同様の組成を涙と共有します。それらの成分の相乗的活性を通して、それらは角膜上皮の再生を促進し、炎症性サイトカインの放出を阻害し、そして結膜における杯細胞の数およびムチンの発現を増加させる^2,3。

これまでのところ、眼科用血液ベースの製品の不均一性が文献に記録されています。これらの製品は、献血者の起源、すなわち自家または同種、ならびに血液源、すなわち末梢血、臍帯血、血清、または血小板に従って分類することができる。

自家製品は最も普及していました^が3、同種異系製品は、より高い有効性と安全基準15を保証し、コストの大幅な削減を保証するため、現在、好ましい選択肢になりつつあります^16,17。実際、以前の研究では、自己免疫疾患および/または全身性疾患の患者から得られた血液ベースの製品が、品質および機能の変化を示す可能性があることが証明されています6,16,17。血清ベースの点眼薬が最も普及しているという事実にもかかわらず、血小板ベースの製品は、有意なレベルの有効性を維持しながら容易に調製できるため、最近有効な代替品として確認されつつあります^3,11。現在入手可能な血小板ベースの製品は、多血小板血漿(PRP)、多血小板血漿溶解物(PRP-L)、および成長因子に富む血漿(PRGF)^{に分けることができます3}。

その中でも、PRP-Lは長寿命の冷凍品であるという利点があります。PRP-Lは、アフェレーシス、バフィーコート、さらには期限切れの血小板(PLT)^18,19から調製することができ、無駄を大幅に削減します。アリコートは、-80°Cの輸血センターで数ヶ月間、または-15°Cの患者の自宅で短期間保管することができます。

PRP-LはGFが非常に豊富であり、眼の表面再生を刺激することが証明されています12,20,21。それにもかかわらず、この分野で報告された臨床研究はごくわずかであり、それらのすべてが自家源を使用していました^3,22。PRP-Lは、その調製、調剤、および保管に関する標準化されたガイドラインがないため、眼表面疾患の治療に日常的に使用する前に、さらなる検証と特性評価が必要です³。

ここでは、イタリアのAUSL-IRCCSディレッジョエミリアの輸血医学ユニットで使用されるPRP-Lの製造、およびDED患者への調剤に関する詳細なプロトコルが共有されています。私たちは、科学界が標準的な調製方法を開発するのを支援することを目指しており、これにより、世界的な研究や臨床アプローチにおける均質性と一貫性が向上する可能性があります。

プロトコル

成長因子の定量的評価に使用されるPRP-Lは、AUSL-IRCCSディレッジョエミリアで実施され、2019年1月10日にエリアヴァスタエミリアノルド倫理委員会によって承認された、再生目的のPRP製品の特性評価に関するより広範な研究内で収集されました(プロトコル番号2019/0003319)。ドナーは、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを行いました。ドライアイ症候群の症状を監視するために臨床医によって日常的に使用されている眼表面疾患指数(OSDI)質問票の集計された匿名データを収集するために倫理的承認は必要ありませんでした。図 1A は、従ったプロトコルの概要を示し、 図1B の写真は、手順の主なステップを示しています。

1.多血小板血漿(PRP)収集

1. PRPアフェレーシス
   1. このプロトコルでは、イタリアの法律に従って血小板ドナーを選択します:血小板ドナーは18〜65歳で、正常圧と血球数のパラメーターと血小板数が180 x 10⁹ 血小板/ L²³以上である必要があります。適格なドナーは、寄付前1週間以内に抗血小板薬または抗凝固薬を服用することはできません。
   2. 製造業者の指示および国内法²³に従って、自動採血システムを用いて血漿血小板アフェレーシスを行い、1単位の単一ドナー多血小板血漿(PRP)を得た。アデニンクエン酸デキストロース溶液A(ACD-A)抗凝固剤溶液でPRPを収集します。
      注:血小板アフェレーシスは連続的な手順で行われます。収集時間は40分から90分の範囲です。ドナーに送達されるACDの量と手順の時間は、ドナーの特性、例えば、ヘマトクリット値および針ゲージに依存する。
2. PRPユニットの特性
   注:次のステップは通常、血漿血小板アフェレーシス手順中に自動採血システムによって自動的に実行されます。メーカーの取扱説明書をご確認ください。
   1. アフェレーシスによって収集されたPRPユニットを、保存時間全体でpH>6.4を維持するために必要な最小量の残留血漿を含む適切な量の保存液に再懸濁し、抗凝固剤溶液の正味平均最終容量180 mL(約40 mL)まで再懸濁します。.
      注:イタリアの法律によると、品質管理は血小板(PLT)数が少なくとも2.0 x 10 11 PLT /ユニットであり、残留白血球が1 x^{10 6} 細胞/ユニット未満であることを評価する必要があります。
   2. ロイコデプレットし、照射したPRPを血小板振盪機で22°C±2°Cで最大5日間保存してから、さらに操作します²³。
3. PRP希釈
   1. PRP希釈を開始する直前に、メインバッグからピアススパイクを通して採取したサンプルを使用して、血球計算盤でPLTカウントを実行します。
      注意: クラスIIバイオハザードフードの下で無菌状態で次のステップを実行します。手順中は、個人用保護具(白衣、手袋、ゴーグル)を着用してください。
   2. PRPを適切な量の滅菌0.9%NaClで最終濃度0.32 x 10 9 ± 0.03 x^{10 9 PLT} / mLに希釈し、末梢血中の平均PLT濃度をシミュレートします。
   3. 血液バッグのピアススパイクを利用して、希釈したPRPを300 mLの空の収集バッグに分割して、正味容量190 mL /バッグに到達します。
   4. 残留希釈PRP(通常1 mL)のアリコートを使用して、微生物汚染の可能性を評価する品質管理を実行します。微生物学研究所で製造元の指示に従って無菌アッセイを実行します(材料表を参照)。
      注:少量の血液検体から好気性微生物(主に細菌と酵母)の定性的培養と回収を行うことができる好気性血液培養に固有の培養バイアルを使用してください。
   5. 解凍する前に、希釈したPRPバッグを-80°Cで最大2か月間保管してください。

2.多血小板血漿溶解液(PRP-L)製剤

1. 解凍
   1. 解凍手順を開始する前に、温浴が37°Cに設定されていることを確認してください。 PRPバッグを温かいお風呂に入れ、完全に解凍するまで待ちます。
2. PRP-L コレクション
   1. PRPバッグを3000 x g で室温で30分間遠心分離します。
      注意: 次のステップは、クラスIIバイオハザードフードの下で無菌状態で実行する必要があります。
   2. トランスファーバッグのピアススパイクを利用して、遠心分離バッグを空の滅菌300mLトランスファーバッグに接続します。破片を避けながら、PRP-L上清を慎重に新しいバッグに移します。可能であれば、バッグプレスを使用してください。
   3. PRP-Lユニットの接続チューブをバッグシーラーでシールします。
3. PRP-L アリコート
   注:190 mL PRPを含む始動ユニット(ステップ1.3.3を参照)は、2つの点眼キットを充填するのに十分です(血液成分からの点眼剤の適用と保存に使用される特定の医療機器の詳細については、 材料の表を参照してください)。点眼薬キットは、事前に接続されたシリンジの上にストリングバイアル全体を配置し、抗菌フィルターを除外するために活栓の中央の矢印を左に向けて、クラスIIフードの下で開く必要があります。
   1. 滅菌シリンジで30〜60mLのPRP-Lを収集し、シリンジを充填ラインのルアー/ロック接続にリンクします。
   2. 製造元の指示に従って、活栓を半回転させて、PRP-L含有シリンジと事前に接続されたシリンジの間のラインを開きます。事前に接続されたシリンジにPRP-Lを充填します。
   3. PRP-Lシリンジを外し、ルアー/ロック接続のチューブキャップを閉じて、活栓を元の位置に回転させます。点眼キットシリンジを使用して、バイアルにPRP-Lを充填します。
   4. 手順 2.3.1.-2.3.3 の手順を繰り返します。すべてのアプリケーターバイアルが満たされるまで。各アプリケーターが適切に充填されていることを確認してから、バッグシーラーで個別に密封します。
   5. 新しい点眼キットで手順を繰り返します。
   6. 微生物汚染の可能性を評価するために、残留希釈PRP-Lの少量のアリコートを使用してください(ステップ1.3.4を参照)。
      注意: 液体が誤ってストリングの端にある抗菌フィルターに到達した場合、吸引シリンジが抵抗に反対し、充填を妨げる可能性があります。充填サイクルを続けるには、ストリングの端にある抗菌疎水性フィルターからストリングの端部を約5/6アリコート持ち上げます。この位置で、すでに空気で満たされている新しい滅菌注射器(30 mL容量)を使用します。抗菌フィルターのメスルアー/ロックを接続し、シリンジのプランジャーを強く繰り返し押して、血液成分の残留物をすべて取り除き、抗菌フィルターの膜に液体がないようにします。シリンジを取り外し、残りのバイアルを満たします。
4. PRP-L ストレージ
   1. 各アプリケーターに適切なラベルを付け、ビニール袋に入れます。ドナーの血液型を強調するように注意しながら、ビニール袋にもラベルを付けます。
   2. イタリアの法律²³ およびガイドライン²⁴に従って、患者の割り当て前に最大24か月間-80°Cで保管してください。

3. PRP-Lディスペンセーション

1. 好ましくはPRP-L血液型を一致させることによって患者割り当てを行う。クールボックスを使用してPRP-Lアプリケーターバイアルを配送し、各アプリケーターバイアルに約45滴に相当する1.45mLのPRP-Lが含まれていることを確認します。アプリケーターバイアルは、-15°Cで最大1か月間患者の自宅で保管できることを患者に指示します。

結果

血清由来の点眼薬(眼表面疾患の治療に最も頻繁に使用される血液ベースの製品)を使用する理論的根拠は、循環血小板にほぼ完全に由来するGFの含有量にあります。PRPには、末梢血血清と比較して有意に多くの血小板(およびその結果として血小板由来GF)が含まれており、0.15 x 10 9-0.45 x^{10 9} PLT / mLの範囲です。.イタリアの法律によると、PRP単位の血小板数は少なくとも0.9 x 10 9-1

ディスカッション

近年、眼の表面病理に対する血小板ベースの製品の臨床使用が増加しているが、それらの普及は科学的堅牢性の欠如によって妨げられている。これは主に、ドナーソースと調製プロトコルの幅広い異質性によって引き起こされ、それらはしばしば完全に開示されていないか、それらが調剤される目的のために特別に設計されていません。特に、アフェレーシスによって収集された血小板ベー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected