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Method Article
このビデオの記事では、安定かつ制御可能なジオメトリを持つ匂い勾配の構築を可能にする新しい方法を説明します。我々は、簡単にこれらの勾配が嗅覚の欠陥のために画面に使用することができます(フルおよび部分的な臭覚障害)と走化性行動のより微妙な特徴を研究する方法を示しています。
ショウジョウバエの幼虫の嗅覚応答は、伝統的に、単一の末梢臭気源を構成するペトリ皿に研究されている。この行動のパラダイムでは、実験者は通常、ソースからの匂い分子の急速な普及は、皿の安定勾配の創造につながることを前提としています。感覚入力と行動反応の間に定量的な相関関係を確立するには、それは、匂いの刺激条件のより完全な特性評価を達成するために必要です。このビデオの記事では、安定かつ制御可能なジオメトリを持つ匂い勾配の構築を可能にする新しい方法を説明します。我々は、簡単にこれらの勾配が嗅覚の欠陥のために画面に使用することができます(フルおよび部分的な臭覚障害)と走化性行動のより微妙な特徴を研究する方法を示しています。
1。機器と試薬
臭気の希釈:
セットアップアッセイの分野:
行動テストのためのショウジョウバエの幼虫の調製:
幼虫の動きの記録:
2。行動アリーナ
行動のアリーナは、3つのスタックされた96ウェルディッシュの蓋で構成されています。底部の蓋は、光パッドからシステムの残りの部分を分離し、舞台で対流を低減するために使用されます。 3%アガロースゲルの25ミリリットルで覆われた第二蓋は、、の上を歩くために幼虫のための舞台としての役割を果たします。上蓋は、表面張力によって中断されたまま臭気の液滴を保持しています。
臭いの液滴は、96ウェルディッシュのフタのウェルに直接ピペッティングしている。単一または複数の悪臭源が明確な、検証可能なプロファイル2と勾配を生成するために使用することができます。臭覚障害と幼虫の走化性の欠陥をテストするために、我々は、次の2つのアッセイを使用することを提案。
2.1。単一の臭気源の検定:よく#E7に敷設された単一の臭いの液滴(標準96ウェルプレートの参照システム)。
このアッセイでは、効率的に変異体の幼虫の基本的な臭覚障害のためにテストします。また、確実に特定の臭気2の検出のしきい値を決定するために使用することができます。
2.2。複数の臭気源の分析
いくつかの臭いの液滴は上部蓋のウェルに配置されます。現在のビデオの記事では、我々は6つの液滴の合計が井戸#E2、#E4、#E10#E6、#E8、および#E12(標準的な96ウェルプレートのリファレンスシステムで導入された中央の行E.に沿ってグラデーションを設定)。ペトリ皿とsingle臭気源のアッセイとは対照的に、複数の臭気源のアッセイは、アリーナの長さと幅に沿ってestablished勾配のジオメトリの質的な制御が可能になります。このアッセイはchemotax 2〜ショウジョウバエの幼虫を可能にする感覚のメカニズムを特徴づけるために使用されていました。
3。勾配のプロファイルの検証
特に勾配の幼虫をテストする前に、それは時間が経過すると、その安定性を判断することが重要です。これに基づき、実験者は、それぞれの試験のための十分な期間と同じ分野で連続して追跡できる幼虫の数を決定することができます。勾配の安定性をテストするために、我々は、IR分光法2に基づく手法を開発した。このメソッドは、このプロトコルの範囲を超えていますし、さらに精緻化されることはありません。
4。実験の準備のためのプロトコル
4.1。アガロースプレートと臭気の希釈液の調製:
ノート:低臭気の濃度が使用されている場合、それは連続希釈に基づいてソースの濃度の集合を準備するのが好ましい。 1.0M溶液を、例えば、起動して、0.5M溶液を得るため、1:2希釈を行う。反復的に進めることによって、人は0.5M等比数列の1.0M、0.25M、0.12M、0.06M、0.03M、0.015M以下の希釈系列を取得します。
重要:多くの有機悪臭はプラスチックと反応するので、臭気の希釈液をテフロンキャップのガラスバイアルに格納する必要があります。各実験は、実験全体で実際の臭気濃度の変動を軽減する前に、理想的には、悪臭が新鮮準備する必要があります。非常に揮発性の薬品を使用している場合に特に当てはまります。
4.2。幼虫の準備:
5。行動の記録を実行するためのプロトコル
5.1。アリーナのセットアップ:
5.2。ローディング幼虫:
6。ビデオの記事で紹介するサンプル実験
6.1。酢酸イソアミルの1.0Mを持つ単一の臭気源アッセイ。
番号が割り当てられていたそのうちの各々に変異し、10の野生型(W1118)の幼虫 - 我々は盲目的にten Or83b - /をテストした。追跡実験ERは、それぞれの動物の遺伝子型に関する情報を受信しませんでした。非smellers、パスがすぐに臭気源の近傍を残した場合、蓄積が全体の試験のためのソースで観察した場合、smellers:各記録した後、予測表現型が試験された各動物に配属されました。 20匹の行動を記録した後、パスは表現型に基づいて分類した。このグループ分けの結果は、幼虫の実際の遺伝子型と比較した。行われたすべての割り当てが正しいことが分かった。
6.2。酢酸イソアミルの指数関数と線形グラデーションを持つ複数の臭気源アッセイ。
この実験では、線形と指数関数的勾配に沿ってchemotaxing野生型幼虫の性能を比較した。走化性行動は、0.5Mの同じ最高濃度の設定2つのグラデーションを記録した。として記事で説明したように、指数関数の勾配の悪臭源は0.015と0.5Mの範囲であった。線形グラデーションの源は、0.25と0.5M(一般的な違いが0.05Mと等差数列)の範囲であった。
濃度の局所差が一定と比較的小規模だったので、線形グラデーションでは、より挑戦的な走化性の環境を表現され、濃度範囲が狭い(0.25M)。対照的に、指数関数の勾配の濃度範囲は、トレイルに沿った濃度の地域差の増加とともに大きくなった。
十五幼虫は、2つの勾配のジオメトリと1つのグラフに重ね合わせたそれぞれのパスを記録した。二つのグラフの目視検査では、野生型の幼虫は、両方のジオメトリのための勾配を確実に上昇することができたことが蛇行の量は、線形グラデーションの条件のための大きいことを示しています。これは、グラデーションの長さに沿って信号の存在がより確実に線形いずれかのより指数関数的な形状のために検出されることを示唆している。
6.3。 "屋根"幾何学における酢酸イソアミルの勾配を持つ複数の臭気源アッセイ。
ここでは、臭気の勾配に導入された幼虫はかなり匂いのちょうど有無より臭気濃度の局所的な変化に敏感であることを確認してください。 0.06、0.12、0.25、0.5、0.25、0.12M:イソアミル勾配は、以下の濃度と臭気の液滴のアプリケーションによって設立されました。その後の勾配の形状は、0.5Mでピーク非対称"屋根"に似ていた。
幼虫は、0.06Mと0.12M臭液滴の間にリリースされました。我々の仮説は、幼虫が単に臭気の存在を計算された場合には濃度の最大値のための特定の好みなしで全体の勾配に従うというものでした。対照的に、場合幼虫は、0.5M液滴の下に蓄積するという濃度の局所的な変化に敏感です。十五幼虫が記録され、そしてそれは短い探索期間の後、すべての幼虫がよく、より高濃度の下に蓄積されたことがわかった。これは、臭気濃度の局所的な変化が計算され、ショウジョウバエの幼虫の走化性行動を通知していることを示唆している。
The authors have nothing to disclose.
我々は、T.フーバーと有用な議論のためのTP Sakmarに感謝しています。この作品は、米国国立衛生研究所からLBVとベルギー系アメリカ人の教育財団とMLへレヴソン財団への補助金によって支えられて
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