3Dプリントされたスタンプ状デバイス による 組織スフェロイドの生成

要約

本プロトコルは、3Dプリントされたスタンプ様デバイスを使用して、大規模かつ費用対効果の高い方法で組織スフェロイドを作製する技術を記載している。

要約

3D細胞培養の進歩により、組織スフェロイドなど、生理学的に関連性のある in vitro モデルが開発されました。スフェロイドとして培養された細胞は、 in vivo 環境に似た、より現実的な生物学的応答を示します。その利点により、組織スフェロイドは、幅広いバイオテクノロジーの適用性を備えた、より優れた、より信頼性が高く、より予測可能な研究モデルに向けた新たなトレンドを表しています。しかし、組織スフェロイドの大規模生産を達成できる再現性のあるプラットフォームは、その可能性を十分に探求し、後押しする上で満たされていないニーズとなっています。本明細書では、均質な組織スフェロイドの大規模生産が、低コストで時間効率の良い方法を用いて報告されている。3Dプリントされたスタンプのようなデバイスは、6ウェルプレートあたり最大4,716個のスフェロイドを生成するために開発されました。このデバイスは、光硬化性樹脂を使用した光造形法によって製造されます。最終的なデバイスは、高さ1.3mm、幅650μmの円筒形マイクロピンで構成されています。このアプローチにより、均一な形状とサイズ、および>95%の細胞生存率を持つ均質なスフェロイドおよび共培養されたスフェロイドを迅速に作製できます。さらに、スタンプのようなデバイスは、さまざまなサイズのウェルプレートとペトリ皿に合わせて調整可能です。滅菌が簡単で、長期間再利用できます。均質組織スフェロイドの効率的な大規模生産は、組織工学、医薬品開発、疾患モデリング、オンデマンドの個別化医療など、さまざまな産業分野でその翻訳を活用するために不可欠です。

概要

組織スフェロイドは、細胞懸濁液によって形成された3次元微小組織であり、外力なしに自己組織化します¹。これらのスフェロイドは、ヒトの生理学的システム^2,3の主要な特徴に類似しているため、バイオファブリケーションプロトコルで広く使用されています。組織スフェロイドは、従来の単層細胞培養よりも代謝、細胞骨格動態、細胞生存率、代謝活性、分泌活性が類似しています¹。その融合能力により、生物学的関連性が強化された複雑な組織工学的構築物を形成するためのビルディングブロック(バイオプリンティングプロトコルなど)としても使用できます^4,5。

その生物学的関連性から、組織スフェロイドは、組織工学、医薬品開発、疾患モデリング、ナノ毒物学的評価などのプロトコルのバイオテクノロジーツールとして使用され、時間、スペースコスト、動物実験を削減してきました3,6,7,8。しかし、組織スフェロイドの可能性を十分に探求し、活用するためには、その大規模生産を目指した信頼性と再現性のある方法が非常に必要であり、これらは依然として継続的な課題です。

いくつかの方法論では、ハンギングドロップ、コーティングされたU字型ボトムウェル、マイクロ流体工学、およびポリマーマトリックス^9,10の使用など、スフェロイドを作製します。これらの方法論はスフェロイド製造市場への道を切り開きましたが、それでも複雑で、時間がかかり、労働集約的で、高価です¹⁰。

本プロトコールは、低コストで時間効率の良い方法を用いた均質な組織スフェロイドの大規模生産を報告しています。3Dプリントされたスタンプのようなデバイスを開発し、6ウェルプレートあたり最大4,716個のスフェロイドを生成しました。さらに、スタンプのようなデバイスは、ウェルごとにより多くのスフェロイドを生成するように調整することができ、さまざまな細胞培養プレートに適しています。滅菌が容易で、長期間再利用できます。均質な組織スフェロイドの効率的な大規模生産は、その使用を臨床に応用するために不可欠であり、組織工学、医薬品開発、疾患モデリング、オンデマンドの個別化医療など、さまざまな産業分野に貢献しています。

プロトコル

L929細胞株であるマウス線維芽細胞を本研究に使用しました。切手のような3Dプリントされたバイオデバイスは、商用ソースから入手しました( 材料の表を参照)。良好な細胞培養の実践と無菌技術は、プロトコール全体を通して行われました。作製した装置を70%アルコールで拭き取り、15分間紫外線を当てて滅菌した。細胞培養培地および溶液を37°Cに温めてから、細胞または組織スフェロイドと接触させました。プロトコルの概略図を 図1に示します。

1.スタンプ状装置からの非接着型の作成

1. 以下の手順に従って、2%(w / v)アガロースゲルを調製します。
   1. アガロース粉末をリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)で希釈し、得られた懸濁液を円運動で均質化します。
      注意: この溶液はガラス瓶に入れることができます。このステップでは、アガロース溶液は半透明になりません。
   2. ガラス瓶を電子レンジに入れ、30秒間セットします。5秒ごとに電子レンジを停止し、ガラス瓶を取り外し、円を描くように動かして溶液を手動で均質化します。加熱プロセスは、溶液が液体の透明な状態に達するまで実行する必要があります。
      注意: ホットプレートは、電子レンジの代替品としても使用できます。加熱プロセス後、溶液は半透明/透明でなければなりません。
   3. 実験用に計画した6ウェルプレートの各ウェルに1 mLのアガロース溶液を加えます。
   4. ~15分、またはアガロースが固まるまで待ちます。
      注:冷却プレートを使用して、固化時間を短縮できます。
   5. 1〜2mLのアガロース溶液を加え、液体アガロースの上にデバイスを静かに挿入します。
      注意: デバイスの配置は、アガロースデバイスインターフェースの気泡を防ぐために慎重に行う必要があります。
   6. ~30分、またはアガロースが固まるまで待ちます。
      注:冷却プレートを使用して、固化時間を短縮できます。
   7. デバイスをアガロースからそっと取り外します。
      メモ: 取り外しは重要です。アガロースの特徴を損なわないように、慎重に取り外す必要があります。そうしないと、アガロースが乱れる可能性があります。
   8. 2 mLのDMEM培地を追加し、10分間待ってから、培地を廃棄し、新しいDMEMと交換します。これを3回繰り返して、井戸を適切に洗います。
   9. 2 mLのDMEMを添加し、6ウェルプレートをインキュベーター(37°C、5%_CO2 、湿度80%)に細胞播種するまで置きます(図2A-F、補足ビデオ1)。

2. 組織スフェロイドの作製

注:細胞系が異なれば、接着特性も異なります。したがって、この方法論を使用すると、一部の種類の細胞が組織スフェロイドを適切に形成できない場合があります。

1. 従来の単層培養(すなわち、10%ウシ胎児血清(FBS)、100 μg/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加した低グルコース添加DMEMを使用して、細胞培養フラスコで細胞を増殖させます( 材料の表を参照)。細胞を5%_CO2 インキュベーターで37°Cに維持し、コンフルエンスの80%に達するまでモニターします。
2. 望ましい合流点に達した後、細胞を1x PBSで洗浄します。
   注:25 cm² フラスコには5 mL、75 cm² フラスコには10 mL、150 cm² フラスコには15 mLを使用することをお勧めします。
3. 解離酵素を添加し、細胞を37°C、5%_CO2 、湿度80%で2〜5分間インキュベートします。
   注:本研究では、解離酵素として0.78 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む0.125%トリプシンを使用しました( 材料の表を参照)。
4. 細胞培養フラスコからの細胞の剥離を観察し、FBSを添加した増殖培地を添加して細胞解離酵素を中和します。
   注:本研究では、低グルコースのDMEM( 材料の表を参照)に10%FBSを補充して使用しました。
5. 細胞懸濁液を400 x g で室温で5分間遠心分離します。次に、セルを手動でカウントします。
6. チューブあたり50 x 10⁵ 個の細胞を取り、1x PBSを5 mL加えます。
   注:播種される細胞の数は、最終的な組織スフェロイドの直径に影響を与えます。したがって、細胞数を増やして、より大きな直径の組織スフェロイドを生成することができます。
7. 細胞懸濁液を400 x g で室温で5分間遠心分離します。
8. ピペットで上清を取り出し、細胞培養液1 mLを加えて溶液をホモジナイズします。
   注:本研究では、10%FBS、100μg/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを補充した低グルコースを含むDMEMの完全な培養培地を使用しました。
9. 6ウェルプレートから2 mLの培地を取り出し(ステップ1.1.9)、3Dプリントしたバイオデバイスによって形成されたアガロース型の中心に1 mLの細胞懸濁液を加えます(ステップ1.1.7)。細胞がマイクロ切除で沈殿するまで待ち(20~30分)、ウェルに1 mLの細胞培養培地を慎重に加えます。
   注:この手順では特に注意する必要があります。培地を静かに加え、ピペットチップをウェル壁の近くに置き、少量分注することをお勧めします。
10. 6ウェルプレートをインキュベーター(5%_CO2 、湿度80%の37°C)に置き、組織スフェロイドが形成されます(細胞の種類によって異なりますが、約24〜48時間)(図3)。
    注:異なる細胞タイプ(例えば、癌細胞、初代細胞)は、異なる自己組織化動態を有する¹¹。

結果

3Dプリントされたスタンプ状デバイスによる均質なマイクロ切除術の生成
3Dプリントされたスタンプ状デバイスは、光硬化性樹脂を用いた光造形法¹²により成功裏に製造した(図2A)。最終的なデバイスは、高さ1.3mm、幅650μmの円筒形マイクロピンで構成されていました(図2A)。非接着性マイク?...

ディスカッション

本プロトコールは、組織スフェロイドの大規模生産のための簡便で、迅速で、安価な方法を記載している。スタンプのような3Dプリントデバイスをマスターモールドとして使用し、6ウェルプレートあたり最大4,716個のスフェロイドを生成しました。スフェロイドとして培養された細胞は、in vivo環境1によく似た、より現実的な生物学的応答を持つことが示され?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well plate	Merck	CLS3516
Agarose	Promega	V3121
Biodevice	Bioedtech
Biological Safety Cabinet	ThermoFisher	51029701
Centrifugue	ThermoFisher	75004031
Corning 50 mL centrifuge tubes	Merck	CLS430829-500EA
Corning cell culture flasks surface area 75 cm2	Merck	CLS430641
Draft Resin	FormLabs	FLDRBL01
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - low glucose	Merck	D6046
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
Form 2	FormLabs
Incubator	ThermoFisher	51033782
L929 cell lines	Stablished in the lab
Penicillin and Streptomycin (PS)	ThermoFisher	15140122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Merck	806552
Trypsin with EDTA	Merck	T3924