JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

本研究では、キネシン-3ファミリーのメンバーであるKIF1A(1-393LZ)をSf9-バキュロウイルス発現系を用いて精製する。これらの精製モーターの in vitro 単一分子およびマルチモーターグライディング分析は、哺乳類細胞ライセートからのモーターに匹敵する堅牢な運動特性を示しました。したがって、Sf9-バキュロウイルス系は、目的のモータータンパク質を発現および精製するのに適している。

要約

複雑な細胞環境は、単一分子の運動性解析に課題をもたらします。しかし、イメージング技術の進歩により、単一分子の研究が改善され、蛍光タグ付き分子の動的挙動の検出と理解において絶大な人気を得ています。ここでは、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いたキネシン-3ファミリーモーターのin vitro 単一分子研究の詳細な方法について説明します。キネシン-3は、細胞内貨物輸送から細胞分裂、発生に至るまで、細胞および生理学的機能において重要な役割を果たす大きなファミリーです。我々はこれまで、構成的に活性な二量体キネシン-3モーターが、哺乳類細胞でモーターを発現させて調製した細胞ライセートを用いて、1分子レベルで高い微小管親和性を有する高速かつ超加工的な運動性を示すことを示した。私たちの研究室では、キネシン3モーターとその制御機構を細胞学的、生化学的、生物物理学的アプローチを用いて研究しており、そのような研究では大規模な精製タンパク質が必要です。哺乳類細胞を用いたこれらのモーターの発現および精製は高価で時間がかかるが、原核生物発現系での発現は有意に凝集し、不活性なタンパク質をもたらした。細菌精製システムと哺乳類細胞ライセートによってもたらされる制限を克服するために、これらのモーターを発現および精製するための堅牢なSf9バキュロウイルス発現システムを確立しました。キネシン-3モーターは、シグナルを増強し、光退色を減少させる3タンデム蛍光タンパク質(3xmシチリンまたは3xmCit)でC末端にタグ付けされています。Sf9精製タンパク質の in vitro 単一分子およびマルチモーター滑走分析は、キネシン-3モーターが哺乳類細胞溶解物を用いた以前の研究と同様に高速で超加工的であることを示しています。これらのアッセイを使用する他のアプリケーションには、モーターのオリゴマー条件、生化学的研究と並行している特異的結合パートナー、およびそれらの速度論的状態に関する詳細な知識が含まれます。

概要

非常に混雑した細胞環境は、運命のタンパク質や分子を選別する際に多くの課題をもたらします。細胞質内の分子の組織化と時空間分布のこの激しい作業負荷は、分子モーターと細胞骨格トラックによって促進されます。分子モーターは、ATPなどのエネルギー通貨を加水分解し、運動や力の生成中にそのエネルギーを利用する酵素です1。アミノ酸配列の類似性に基づいて、キネシンは14のファミリーにグループ化され、この類似性にもかかわらず、各モーターは細胞の機能に一意に貢献します。キネシン3ファミリーモーターは、5つのサブファミリー(KIF1、KIF13、KIF14、KIF16、KIF28)2からなる最大のモーターの1つであり、小胞輸送、シグナル伝達、有糸分裂、核移動、発生など、多様な細胞および生理学的機能に関連しています3,4,5。キネシン-3輸送機能の障害は、多くの神経変性疾患、発達障害、および癌疾患に関与しています6,7,8,9。

最近の研究では、キネシン-3モーターはモノマーであるが、貨物誘起二量体化を受け、従来のキネシン10,11,12,13と比較して高速で超加工的な運動性をもたらすことが実証されている。それらの生化学的および生物物理学的特性評価には、大量の精製された活性タンパク質が必要です。しかし、原核生物発現系におけるそれらの産生は、おそらく不適合なタンパク質合成、折り畳みおよび修飾機構のために、不活性または凝集したモーターをもたらした14,15,16,17,18。このような制限を回避し、収量を増やすために、ここでは、これらのモーターを発現および精製するための堅牢なSf9バキュロウイルス発現システムを確立しました。

バキュロウイルス発現システムは、ハイスループット真核生物組換えタンパク質発現のための宿主系としてSf9昆虫細胞株を使用する19,20。バキュロウイルスは、異種遺伝子発現と可溶性組換えタンパク質の産生を補助する強力なポリヘドリンプロモーターを持っています17。その費用対効果、取り扱いが安全で、かつ大量の活性タンパク質発現のために、それは強力なツール21となっている。目的のタンパク質を発現させるための重要なステップは、組換えバクミドを生成することです。市販のバクミド生成キットは高価であり、より多くのサンプルを扱うため、キネシン-3モーターをバクミドに大小両方のインサートするための社内プロトコルを開発しました。Sf9精製されたキネシン-3モーターを使用して、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用してin vitroの単一分子およびマルチモーター微小管滑走特性を特徴付けました。モーターは、3タンデム蛍光分子(3xmCit)でC末端にタグ付けされており、シグナルを強化し、光退色を低減します。TIRFイメージングは、シグナル対ノイズ比の増加、光毒性の低減、カバーガラスに近い非常に小さな領域の選択的イメージングにより、in vivoおよびin vitroで単一分子レベルでタンパク質動態を視覚化するために広く使用されています。

本研究では、Sf9バキュロウイルス発現系を用いたキネシン3モーターの精製と、TIRF顕微鏡を用いたモーターの in vitro 単一分子イメージングおよびマルチモーター滑空解析について説明します。全体として、この研究は、Sf9精製モーターの運動特性が哺乳類細胞溶解物から調製されたモーターの運動特性と同一であることを示しています。したがって、Sf9-バキュロウイルスシステムは、目的のモータータンパク質を発現および精製するように適応できると考えています。

プロトコル

1. Sf9培養、トランスフェクション、ウイルス生成

注:抗生物質/抗真菌剤を含まない100 mLの滅菌済みコニカルフラスコ内の30 mLのSf-900 / SFM培地中のSf9細胞を28°Cに維持します。 懸濁培養液を90rpmのオービタルシェーカーに保ちます。CO2の供給と湿度の維持は必要ありません。細胞は通常、4日目に2.0 x 10 6細胞/ mLの密度に達するために0.5 x 106細胞/ mLを接種することにより、4日ごとに継代培養されます。

  1. P0ウイルスストックの生成
    1. トランスフェクションでは、細胞を4.5 x 105 細胞/mLコンフルエンシーの35 mmディッシュにシードし、振とうせずに28°Cに維持します。
    2. 24時間後、細胞が付着して健康に見えたら、以下に説明するようにトランスフェクションに進みます。
      1. チューブA:構成的に活性なKIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG特異的キネシン-3モーターをコードする1 μgのバクミドDNAを、100 μLの非添加グレース培地と混合します。
      2. チューブB:6 μLのトランスフェクション試薬を100 μLの未添加グレース培地と混合します。
      3. チューブ A の内容物を チューブB に注意深く移し、上下にピペッティングして完全に混合します(約20回)。
      4. 混合物を室温で~45分間インキュベートします。
    3. インキュベーションが完了したら、0.8 mLの未添加グレース培地を上記の混合物に加え、ピペッティングでゆっくりと混合します。
    4. 細胞からSf-900/SFM培地を穏やかに吸引します(トランスフェクション効率に影響を与える可能性のある血清の痕跡を除去するため)。
    5. ステップ1.1.3のトランスフェクション混合物を細胞の上部に滴下し、プレートを28°Cで6時間インキュベートします。
    6. インキュベーション後、トランスフェクション混合物を慎重に除去し、2 mLのSf-900/SFM培地を添加し、さらに28°Cで48時間インキュベートします。
    7. 倒立蛍光顕微鏡でモータータンパク質の発現を確認します。モータータンパク質は、黄色蛍光タンパク質の変異体である蛍光タンパク質mCitrineでタグ付けされています。
      注:トランスフェクトされた細胞は、微分干渉コントラスト(DIC)と20倍の対物レンズ(倍率200倍)の落射蛍光照明、水銀ランプ、EM-CCDカメラを備えた倒立顕微鏡で視覚化しました。mCitrine励起および発光フィルターキューブを介して細胞内のmCitrineタグ付きモーターの発現を監視することにより、ウイルスの生成と感染の効率を確認します。さらに、拡大した細胞/核などの感染細胞の形態学的変化を確認します(図1A-C)。
    8. 再度、感染後72時間で細胞を確認します。通常、細胞は表面から剥離し始めます(図2)。
    9. 細胞の>5%が表面から剥離した場合は、感染細胞を含む培地を1.5 mL滅菌マイクロ遠心チューブで回収し、500 x gで5分間回転させます。
    10. 上清を収集し、液体窒素中に1 mLのスナップフリーズアリコートを採取し、-80°CでP0ストックとして保存するか、それを使用してP1ウイルスストックを生成します。
  2. P1ウイルスストックの生成
    1. P0バキュロウイルスストックをさらに増幅し、タンパク質発現を確認するには、浮遊培養でSf9細胞を増殖させます。
    2. 滅菌済みの100 mLコニカルフラスコに、細胞密度が2 x 106 細胞/mLのSf-900/SFM培地10 mLとP0ウイルスストック1 mLを加えます。90rpmで絶えず振とうしながら28°Cでインキュベートします。
    3. 感染から72時間後、前述のようにタンパク質発現を確認します(ステップ1.1.7)。タンパク質発現が良好で(細胞の>90%が明るいmCitrine蛍光シグナルを示す)、有意な細胞死(約10%〜15%)を示す場合は、15 mL滅菌コニカルチューブで細胞を500 x g で5分間スピンダウンします。
    4. 上清を回収し、液体窒素中の1 mL(P1ストック)のアリコートをスナップフリーズして-80°Cで保存するか、大規模な感染とタンパク質精製を進めます。
  3. 大規模感染
    1. 大規模なタンパク質発現には、2 x 106 細胞/mL密度の浮遊培養液30 mLに1 mLのP1ウイルスストックを感染させ、90 rpmで絶えず振とうしながら28°Cでインキュベートします。
    2. 感染後~72時間後、タンパク質発現を確認します(一般に、最大タンパク質発現は感染後65〜75時間で達成されます)。
    3. 細胞の>90%が最小限の細胞死(<5%)で明るい蛍光シグナルを示したら、滅菌済みの50 mLコニカルチューブに細胞を集め、500 x g で4°Cで15分間スピンダウンします。
      注:死んだ細胞は細胞内容物を培地に放出し、発現タンパク質の損失につながるため、細胞死は最小限(<5%)である必要があります。
    4. 上清を廃棄し、細胞ペレットを回収し、タンパク質精製を進めます。

2. キネシン-3モーターのSf9精製

  1. 上記の細胞ペレットに、5 mM DTT、5 μg/mLのアプロチニン、5 μg/mLのロイペプチン、および5 μg/mLのPMSFを新たに添加した3 mLの氷冷溶解バッファー(補足表1)を加え、気泡を発生させずに20〜25回ピペッティングして細胞を溶解します。すべてのバッファー組成および試薬については、 補足表1を参照してください。
  2. 細胞ライセートを150,000 x g で4°Cで30分間スピンします。
  3. 上清を新鮮な滅菌チューブに集め、~40 μLの50%抗FLAG M2親和性樹脂と混合します。混合物を4°Cで3時間インキュベートし、エンドツーエンドのタンブリングを行います。
  4. インキュベート後、500 x g で4°Cで1分間紡糸することによりFLAG樹脂をペレット化した。 ペレットを乱さずに上清を26Gの針で穏やかに吸引し、廃棄します。
  5. FLAG樹脂ペレットを、2 mM DTT、5 μg/mLのアプロチニン、5 μg/mLのロイペプチン、および5 μg/mLのPMSFを新たに添加した氷冷洗浄バッファー(補足表1)で3回洗浄します。各洗浄で500 x g で4°Cで1分間回転させることにより、ビーズをペレット化します。
  6. 3回目の洗浄後、ペレットを乱さずに洗浄バッファーをできるだけ慎重に排出します。タンパク質溶出の場合は、100 μg/mL FLAGペプチドを含む~70 μLの洗浄バッファーを樹脂ペレットに加え、エンドツーエンドのタンブリングを行いながら4°Cで一晩インキュベートします。
  7. 翌日、樹脂を500 x g で4°Cで1分間スピンダウンします。 精製タンパク質を含む上清を新鮮なチューブに集め、10%グリセロールを補給します。液体窒素中で5 μLのアリコートをスナップ凍結し、さらに使用するまで-80°Cで保存します。
  8. SDS-PAGEゲルを実行して、タンパク質濃度と収量を測定します。目的の精製タンパク質とともに、標準的なタンパク質コントロール、0.2 μg、0.4 μg、0.6 μg、0.8 μg、および1 μgの範囲の既知の濃度のBSAをロードして、標準曲線を生成します。ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色します(図3)。
  9. ImageJソフトウェアに組み込まれているゲル定量ツールを使用してゲルを分析します。まず、既知濃度のBSAのバンド強度を測定し、検量線を生成する。次に、精製されたタンパク質バンドの強度を測定し、タンパク質濃度を決定します。これを行うには、Image Jソフトウェアを開き、メニューバーの[ 分析 ]オプションをクリックして、ドロップダウンメニューで [ゲル ]を選択します。

3. Sf9精製キネシン-3モーターを用いた in vitro1 分子運動アッセイ

注:Sf9精製されたキネシン-3モーターは、ATP回転率、微小管親和性、速度、ランレングス、ステップサイズ、力生成などの生化学的および生物物理学的特性の研究に使用できます。ここでは、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いたKIF1A(1-393LZ)の in vitro 単一分子運動性分析のための詳細なプロトコルについて説明します。すべての緩衝液組成および試薬については、 別表1を参照してください。

  1. 微小管重合
    1. 予め冷却した0.5 mLマイクロ遠心チューブ中で、次の順序でピペッティングすることにより重合混合物を調製します:12.0 μLのBRB80バッファー、pH 6.9;100 mM MgCl2 の 0.45 μL、25 mM GTP の 1 μL。
    2. 液体窒素に保存された10 mg/mLチューブリンの10 μLアリコートを取り出し、すぐに解凍して、上記の重合混合物に加えます。気泡を作らずに2〜3回ピペッティングして穏やかに混ぜます。
      注意: 上記の手順を氷上で迅速かつ厳密に実行してください。
    3. 上記の混合物を氷の上に5分間置きます。
      注:これは、チューブリンの変性を防ぐため、または短い微小管種子の形成を回避するための重要なステップです。
    4. チューブを予熱した37°Cのヒートブロック/ウォーターバスに移し、微小管の重合のために30分間インキュベートします。
    5. 微小管が重合している間に、P12バッファーのアリコートを解凍し、室温にします。
    6. 30分間のインキュベーションを完了する前に、100 μLのP12バッファーを新しい微量遠心チューブにピペッティングして、MT安定化バッファーの調製を開始します。これに、1 μLの1 mMタキソールを加え、すぐに混合物をボルテックスします。
      注意: ステップ3.1.4のインキュベーションを完了する約5分前に、MT安定化バッファーの準備を開始します。タキソールは、β-チューブリンに結合することにより、重合した微小管を安定化させます。
    7. 微小管安定化バッファーを37°Cで2〜3分間温め、底部の重合混合物を乱すことなく重合微小管に穏やかに追加します。
      注:安定化バッファーを加温すると、重合混合物と同じ温度になります。
    8. 混合物を軽くたたいたりピペットしたりせず、さらに37°Cで5分間インキュベートします。
    9. 混合物を軽くたたき、ピペットを使用して斜めのカットチップ(容量200 μL)とゆっくりと混合します。
      注意: この時点から、微小管のせん断を避けるために、常に斜めのカットチップで微小管を取り扱ってください。
    10. フローセルに10〜15 μLの重合微小管を取り、適切な微小管重合を確認します。
      注:DIC顕微鏡セットアップを使用して、ラベルのない微小管を視覚化できます。
    11. 微小管が濃縮されている場合は、10 μMタキソールを添加したP12バッファーで希釈します。
  2. 運動性フローセルチャンバーの調製
    1. スライドガラス、両面テープ、ガラスカバーガラス(22 mm x 30 mm)を使用して運動チャンバーを準備します。
    2. スライドガラスを取り、中央に脱イオン蒸留水を一滴(~70μL)置き、糸くずの出ないティッシュペーパーで拭きます。
    3. 両面テープ(~35 x 3 mm)を2枚切り取り、スライドガラスに平行にしっかりと貼り付け、2つのストリップの間に~4〜5 mmの隙間を残して狭い通路を作ります。
    4. 次に、カバーガラスを取り、中央に脱イオン蒸留水を一滴(~20μL)加えます。糸くずの出ないレンズクリーニングティッシュペーパーのストリップを、水を吸収するまで水滴の上に置きます。次に、カバーガラスの一方の端に向かってゆっくりとスライドさせます。
      注意: カバーガラスは完全に乾いている必要があります。カバーガラスに水が見えないようにする必要があります。
    5. スライドに貼り付けられた両面ストリップにカバーガラスを置き、カバースリップをストリップに沿って均等に押してしっかりと貼り付けます。
      注意: カバーガラスの清掃面がスライドガラスに面していることを確認してください。
    6. これにより、運動性アッセイを実行するための10〜15μLの容量の狭いチャンバーが作成されることを確認してください(図4A)。
  3. インビトロ 単一分子運動アッセイ
    注:モーターの微小管ベースの単一分子運動特性を研究するには、微小管を運動チャンバーのカバーガラス表面に吸着させる必要があります。
    1. 重合したタキソール安定化微小管を、10 μMタキソールを添加したP12バッファーで1:5の比率で希釈し、斜めの先端でゆっくりとピペッティングして混合します。
    2. フローチャンバーを傾斜位置(~15-20°)に保ちます。下端に糸くずの出ないティッシュペーパーを保ちながら、上端からフローチャンバーに30 μLの希釈微小管溶液を流して液体を吸収します。これにより、微小管を流れ方向に整列させるせん断力が発生し、微小管をまっすぐに吸着して平行に整列させるのに役立ちます。
    3. チャンバーの両端に少量の液体を残し、運動チャンバーの乾燥を防ぐために、フローセルを閉じた湿ったチャンバー内で逆さまの位置(カバーガラスが底を向いている)に保ちます。
    4. 微小管が運動チャンバー内のカバーガラスの表面に吸着するように、~30分間放置します。
    5. その間に、500 μLのP12-BSAバッファーと5 μLの1 mMタキソールを混合してブロッキングバッファーを調製します。
    6. 40〜50μLのブロッキングバッファーを流し、スライドを逆さにして湿ったチャンバー内で10分間インキュベートします。
    7. 次の成分を容量500 μLの滅菌マイクロ遠心チューブに次の順序でピペッティングして運動混合物を調製します:タキソールを含むP12バッファー25 μL、100 mM MgCl2 0.5 μL、100 mM DTT0.5 μL、20 mg/mLグルコースオキシダーゼ0.5 μL、8 mg/mLカタラーゼ0.5 μL、 2.25 M グルコースを 0.5 μL、100 mM ATP を 1.0 μL。
      注:蛍光イメージングは、生物学的用途に広く使用されています22、23、24、25、26。蛍光タンパク質の光励起は活性酸素種(ROS)を生成し、これは蛍光タンパク質の光退色および生物学的試料への損傷を引き起こし得る27,28。グルコース、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼなどの脱酸素剤は、光損傷を制限し、蛍光タンパク質の漂白時間を延長するために、運動性アッセイで日常的に使用されています。
    8. 最後に、精製モーター1μLを上記の運動性ミックスに加え、よく混合してから運動性チャンバーに流します。
    9. 運動チャンバーの両端を流動パラフィンワックスで密封し、1.5倍の倍率で1.49NAの100倍のTIRF対物レンズを使用してTIRF照明下ですぐに画像化します。
    10. カバーガラス面に焦点を合わせるために、まず、微分干渉コントラスト(DIC)照明下で運動チャンバ内の両面テープの内縁の1つに焦点を合わせる。
      注意: 明るく凹凸のある表面が表示されます。
    11. 次に、焦点を運動チャンバーに移動します。微調整を使用して、カバーガラスの表面に焦点を合わせ、カバーガラスの表面に吸着している微小管を探します。
    12. 微小管が集束したら、488 nm励起レーザーを使用したTIRF照明に切り替え、励起ビーム角度を変更して照明深度を調整し、最適で均一なTIRF照明を取得します(図4B)。
    13. 微小管表面に沿って100 msの露光で処理的に移動する個々のmCitrineタグ付きモーターに焦点を合わせ、EM-CCDカメラを使用して動きを記録します。
      注:運動アッセイは標識されていない微小管で実行されましたが、最大強度z投影関数を使用して微小管トラックの輪郭を明らかにすることができます。優先的に、長い微小管トラック上のイベントが追跡分析のために考慮されました。
    14. 長い微小管上を歩く蛍光タグ付きの個々のモーターの位置を手動で追跡し、前述のようにImageJ(nih.gov)ソフトウェアのカスタムプラグインを使用してフレームごとに追跡します29。
    15. 各ビンのイベントの数をプロットすることにより、モーター母集団の速度とランレングスのヒストグラムを生成します。これらのヒストグラムを単一のガウスピーク関数に適合させて、平均速度とランレングス12を取得します(図4C-E)。

4. インビトロ 微小管グライディングアッセイ

注:キネシン-3モーターの集団的挙動を理解するために、インビトロ微小管滑走アッセイを実施した18、30、31。モーターが逆さの位置でカバーガラスに固定され、微小管をチャンバーに追加すると、微小管がモーターに着地し、モーターがモーター上を歩こうとすると滑空します(図5A、B)。

  1. 蛍光微小管重合:ローダミン標識チューブリン(3 mg / mL)と非標識チューブリン(10 mg / mL)を1:10の比率で混合することを除いて、前述のプロトコルに従って微小管を重合します。
  2. 30分間の重合後、予め温めた微小管安定化バッファー30 μLを穏やかに加え、さらに37°Cで5分間インキュベートします。
  3. 次に、毛細管ローディングチップでピペッティングして微小管をせん断します(~25-30回)。
  4. 前述のように運動性フローチャンバーを準備し、50 μLのSf9精製GFPナノボディ(50 μLのP12バッファーで希釈した100 nMの2.5 μL)を流し、湿ったチャンバー内でカバーガラスを下に向けて室温で30分間インキュベートします。
    注意: モーターはC端子にmCitrineでタグ付けされています。GFPナノボディは、解離定数32が低いため、モーターを固定化するために使用されます。
  5. 非特異的タンパク質吸着を防ぐために50 μLのブロックバッファーをフローチャンバーに流してカバーガラス表面をブロックし、さらに5分間インキュベートします。
  6. 50 μLのブロックバッファー、1 μLの100 mM ATP、および5 μLの100 nM Sf9精製キネシン-3モーターをピペッティングして、モーターミックスを調製します。チャンバーに流す前に穏やかに混合し、湿ったチャンバー内で室温で30分間インキュベートします。
  7. チャンバーを50μLのP12カゼインで2回洗浄します。
  8. 滅菌マイクロ遠心チューブで、45 μLのP12-カゼインと10 μMのタキソール、1 μLの100 mM ATP、0.5 μLの8 mg/mLカタラーゼ、0.5 μLの20 mg/mLグルコースオキシダーゼ、0.5 μLの2.25 Mグルコース、および1 μLのせん断蛍光微小管の順にグライディングアッセイ混合物を調製します。運動性チャンバーに流入する前に内容物を穏やかに混合し、チャンバーの端部を流動パラフィンワックスで密封します。
  9. TIRF照明下で100msの露光で微小管を滑空し、付属のEM-CCDカメラで画像をキャプチャします。
    注:平均微小管滑走速度は、ImageJ29のカスタム作成プラグインを使用して、約100個の個々の微小管をフレームごとに手動で追跡することによって決定されました。ヒストグラムを生成し、ガウス関数に当てはめることにより、平均微小管滑走速度を決定します(図5C、D)。

結果

Sf9バキュロウイルス発現を用いて活性型および機能的組換えモータータンパク質を大規模に発現・精製するためには、Sf9細胞に感染するためのコード配列を安定に保持するウイルス粒子の生成が必要です。これを達成するために、Sf9細胞にKIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAGをコードする組換えバクミドをトランスフェクトした。72時間後、有意な細胞集団が細胞および核の拡大を伴う緑色蛍光タンパク質(mC...

ディスカッション

Sf9-バキュロウイルス発現システムは、ハイスループットタンパク質生産のための最も用途が広く成功した方法の1つです19、36、37。Sf9細胞の翻訳後修飾能は、哺乳動物系15と非常に同等である。このシステムを使用することのかなりの欠点は、それが遅く、汚染に敏感であることです。最も重要なステッ?...

開示事項

著者は、宣言する競合する金銭的利益を持っていません。

謝辞

V.S.とP.S.は、Kristen J. Verhey教授(ミシガン大学、米国ミシガン州アナーバー)とRoop Mallik教授(インド工科大学ボンベイ校(IITB)、ムンバイ、インド)の研究を通して無条件の支援に感謝します。P.S. シヴァプリヤ・キルバカラン博士のプロジェクト全体を通しての支援に感謝します。V.S.は、DBT(助成金番号:BT/PR15214/BRB/10/1449/2015およびBT/RLF/再入国/45/2015)およびDST-SERB(助成金番号:ECR/2016/000913)を通じた資金提供を認めています。P.K.Nは、ICMRの資金提供を認めています(助成金番号5/13/13/2019/NCD-III)。P.S. は DST からの資金提供を認めます (助成金番号: SR/WOS-A/LS-73/2017)。D.J.SはIITガンディナガルからのフェローシップを認めています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinityBiolegend651502For protein purification
AprotininSigmaA6279For protein purification
CellfectinInvitrogen10362100For Sf9 transfection
DTTSigmaD5545For motility assays and protein purification
FLAG peptideSigmaF3290For protein purification
GlycerolSigmaG5516To freeze the protein
HEPESSigmaH3375For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630SigmaI8896For Sf9 lysis buffer
KClSigmaP9541For buffers preparation
LeupeptinSigmaL2884For protein purification
MgCl2SigmaM2670For buffers preparation
NaClSigmaS7653For preparing lysis buffer
PMSFSigmaP7626For protein purification
Sf9 cellsKind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottlesThermo Scientific4115-0125For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlFor culturing Sf9 cells
SucroseSigmaS1888Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s mediaThermo Scientific11595030 -500mlFor Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATPSigmaA2647For motility and gliding assay
BSASigmaA2153For blocking motility chamber
CatalaseSigmaC9322For motility and gliding assay
DMSOSigmaD5879For dissolving Rhodamine
EGTASigma3777For preparing buffers
GlucoseSigmaG7021For motility and gliding assay
Glucose oxidaseSigmaG2133For motility and gliding assay
GTPSigmaG8877For microtubule polymerization
KOHSigmaP1767Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPESSigmaP6757For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needleDispovanFor shearing microtubules
CaseinSigmaC3400For microtubule glidning assay
GFP nanobodiesGift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)For attaching motors to the coverslip
RhodamineThermo Scientific46406For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tipsEppendorfFor Sf9 culture and purification
15ml concal tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
35mm cell culture dishCole Palmer15179-39For Sf9 culture
BalanceSartorious0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubatorREMIFor Sf9 suspenculture at 28oC
CameraEMCCD Andor iXon Ultra 897For TIRF imaging and acquesition
Double sided tapeScotchFor making motility chamber
Glass coverslipFisherfinest12-548-5Asize; 22X30
Glass slideBlue StarFor making motility chamber
Heating blockNeuationDissolving paraffin wax
Inverted microscopeNikon Eclipse Ti- UTo check protein expression
Lasers488nm (100mW)For TIRF imaging
Liquid nitrogenFor sample freezing and storage
Microcapillary loading tipEppendorfEP022491920For shearing microtubules
MicroscopeNikon Eclipse Ti2-E with DIC set upFor TIRF imaging
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdFor quick spin
Objective100X TIRF objective with 1.49NA oil immersionFor TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterFor protein purification
ParafilmEppendorf
pH-meterCorningCoring 430To adjust pH
Pipette-boyVWRFor Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificFor protein purification
Sorvall ST8R centrifugeThermo ScientificProtein purification
ThermoMixerEppendorfFor microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotorBeckman coulterSW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubesBeckman5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixerNeuationSample mixing
WaxSigmaV001228To seal motility chamber

参考文献

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved