蛍光タンパク質マーカーによる酵母オルガネラの可視化

要約

ここでは、出芽酵母 Saccharomyces cerevisiaeの生細胞イメージングにおける蛍光タンパク質ベースのオルガネラマーカーのセットの使用について説明します。

要約

出芽酵母である Saccharomyces cerevisiaeは、オルガネラの機能とダイナミクスを研究するための古典的なモデルシステムです。これまでの研究では、核、小胞体(ER)、ゴルジ体、エンドソーム、液胞、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、脂肪滴、オートファゴソームなどの主要なオルガネラや膜内構造に対する蛍光タンパク質ベースのマーカーを構築してきました。ここで紹介するプロトコールでは、酵母形質転換のためのDNA調製、形質転換体の選択と評価、蛍光顕微鏡観察、期待される結果など、これらのマーカーを酵母で使用する手順を説明しています。このテキストは、他のバックグラウンドから酵母オルガネラ研究の分野に参入している研究者を対象としています。重要な手順のほか、顕微鏡ハードウェアに関する考慮事項やいくつかの一般的な落とし穴に関する技術的な注意事項についても説明します。これは、人々が生細胞蛍光顕微鏡で酵母の細胞内実体を観察するための出発点を提供します。これらのツールや方法を使用して、タンパク質の細胞内局在を特定し、タイムラプスイメージングで目的のオルガネラを追跡することができます。

概要

膜結合オルガネラへの細胞内区画化は、真核細胞の組織化における一般的な原則です。各細胞小器官は特定の機能を果たします。真核生物生物学の他の多くの側面と同様に、出芽酵母であるSaccharomyces cerevisiaeは、オルガネラの組織化とダイナミクスの基本原理を解明する古典的なモデルシステムとなっています。例としては、タンパク質分泌経路、ペルオキシソームタンパク質インポート経路、オートファジー経路^1,2,3の独創的な発見があります。

典型的な栄養豊富な条件では、成長の早い酵母細胞には、小胞体(ER)、初期ゴルジ体、後期ゴルジ体/初期エンドソーム、後期エンドソーム、液胞、およびミトコンドリアが含まれます。一部のペルオキシソーム、脂質液滴、およびオートファゴソーム(最初の2つよりもさらに少なく、主にCvt小胞型で、栄養豊富な条件^{で存在する4})も存在しますが、特定の培養条件(脂質が豊富な培地、飢餓培地など)下ほど目立ちません。他の一般的な真核生物モデルと比較して、酵母細胞は非常に小さいです。一般的な酵母細胞の直径は約5μmですが、ほとんどの動物細胞や植物細胞の直径は数十μmです。その結果、通常は単一の接着動物細胞を含む同じイメージングフィールドでも、通常はさまざまな細胞周期の段階で数十の酵母細胞が見られます。サイズの違いに加えて、酵母オルガネラの形態にはいくつかの独特の特徴もあります。超微細構造レベルでは、酵母ERは他のシステムと同様にシートと細管で構成されています。蛍光顕微鏡下では、酵母ERは、間にいくつかの相互接続構造を持つ2つのリングとして現れます。内輪は核膜と連続する核小胞体であり、外輪は末梢小胞体であり、これは原形質膜⁵の下に横たわる管状ネットワークである。植物細胞と似ているが動物細胞とは異なるハイブリッドオルガネラ、後期ゴルジ体/初期エンドソームは、分泌経路とエンドサイトーシス経路の交差点に位置している^6,7。形態学的には、酵母ゴルジ体は細胞質に分散しています。液胞は、動物細胞のリソソームと機能的に類似しています。それらはしばしば細胞質の大部分を占め、頻繁な分裂と融合を受けます。蛍光共局在マーカーの使用に加えて、液胞膜は少なくとも2つの基準で核内小胞体と区別できます:液胞膜は一般に核内細菌室よりも丸みを帯びており、DIC内の液胞の凹面の外観も核のそれよりも顕著です。

日常的には、蛍光タンパク質ベースのマーカーのセットを使用して、生きた酵母細胞の前述のオルガネラを視覚化します(表1)。これらのオルガネラマーカーの忠実度と機能性は実験的に検証されています^7,8。これらのマーカーコンストラクトは、蛍光タンパク質キメラカセットを酵母ゲノムに導入することを目的としています。以下に概説するように、酵母形質転換の準備として、直鎖状DNA断片は酵素消化またはPCR増幅のいずれかによって生成される^7,8。線状DNA断片は、相同組換えによってゲノムに組み込まれます。このプロトコルに記載されているプラスミドについては、3種類の設計が採用されています。第1のタイプでは、プラスミドの大部分を被り、コンストラクトの複数のコピーを有する形質転換体を得ることがしばしば可能である。これは、トランスフォーマント間で表現的および場合によっては機能的なバリエーションを導入するため、通常は望ましくありません。シングルコピー形質転換体は、このプロトコルに記載されているイメージング、イムノブロッティング、または慎重に設計されたPCRテストによって同定する必要があります。GFP-Sed5、GFP-Pep12、およびGFP-Atg8をカバーする第2のタイプでは、一倍体酵母細胞で単一コピーの統合のみが産生されます。第1のタイプと第2のタイプはどちらも、マーカー遺伝子の内因性コピーをゲノムにそのまま保持します。Sec7-2GFPおよびVph1-2GFPをカバーする3番目のタイプのプラスミド設計は、C末端ノックインを導入することを目的としており、キメラが対応するマーカー遺伝子の唯一のコピーとなるようになっています。

ここでは、これらのオルガネラマーカーを利用する手順を説明し、例示的な顕微鏡画像を提供し、酵母オルガネライメージングに不慣れな研究者向けの予防措置について説明します。

プロトコル

1.酵母株の構造

1. マーカープラスミドと適切な酵母株を入手します。
   注:プラスミドはAddgeneから入手できます。このプロトコルは、例として TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2)、BY4741 (MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0)、および DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) を例に利用します。科学的な問題の性質以外に、系統選択に関する重要な考慮事項の1つは、選択マーカーの適合性です。ここで説明するオルガネラマーカープラスミドは、選択マーカーとして URA3 と TRP1 を使用します。したがって、レシピエント株の遺伝子型は ura3 および trp1である必要があります。それ以外の場合は、菌株またはプラスミドを変更する必要があります。
2. 以下のレシピに従って酵母培地を調製します。
   注:SMD(合成最小デキストロース;2%グルコース、0.67%酵母窒素塩基(YNB)、アミノ酸なし、30 mg / Lアデニン、30 mg / Lリジン、30 mg / Lメチオニン、20 mg / Lヒスチジン、20 mg / Lウラシル、50 mg / Lトリプトファン、50 mg / Lロイシン)。SMD+CA(0.5%カサミノ酸を添加したSMD)。YPD(酵母抽出物ペプトンデキストロース;1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%グルコース)。SD-N(窒素を含まない合成デキストロース、アミノ酸と硫酸アンモニウムを含まない0.17%YNBと2%グルコース)。メディアの選択に関する考慮事項については、ディスカッションセクションを参照してください。
3. 形質転換ステップの前に、オルガネラマーカープラスミドの酵素消化またはPCR増幅により、直鎖状DNAフラグメントを作製します。
   注: 表1 は、オルガネラマーカープラスミドから線状フラグメントを生成するための制限酵素部位およびPCRプライマーをリストアップしている。
4. 液体YPD培地で酵母細胞を培養し、直鎖状DNA断片で酵母を形質転換します。
   注:酵母形質転換は、従来のLiAcベースの方法⁹ または他の選択方法を使用して実行できます。形質転換のための適切なコントロール、特にプラスミドなしまたはプラスミド由来DNAを用いたネガティブコントロールを含めることが推奨される。
5. 適切な選択プレート( URA3 選択の場合はSMD-Ura培地を使用)で30°Cで2〜3日間インキュベートします。
   注:単一のコロニーが現れるまでに約2日かかります。
6. 蛍光キメラの発現と波形解析コピー数を確認するには、選択プレートから8つのコロニーを取り出し、新鮮な選択プレートで再ストリークし、30°Cでインキュベートします。

2. 蛍光顕微鏡法:一般的な手技と単一時点イメージング

1. 酵母細胞をSMD液体培地で30°Cに一晩、振とうしながら培養します。
2. 翌朝、600 nm(以下、OD₆₀₀)での酵母培養物の光学密度を分光光度計またはプレートリーダーで測定します。
   注:酵母の接種に関するいくつかの練習により、通常、この段階ですべてのサンプルの_OD600 が2未満であることを確認できます。最終的に高くなった場合は、次のステップでさらに希釈し、酵母細胞が回復するまでの時間を増やすことをお勧めします。
3. 新鮮な培地を使用して、酵母培養物を約0.2 OD₆₀₀ に希釈します。
4. _OD600が約0.8〜1.0に達するまで培養を続けます。
   注:酵母の倍加時間は約1.5〜2時間です。
5. ティッシュペーパーの平らな面にカバーガラスを置き、カバーガラスの上面に5μLの1 mg / mLコンカナバリンAを広げ、5分間待ちます(図1A)¹⁰。
   注:この準備手順は事前に行うことができます。
6. 100 μLの酵母培養物をカバーガラスの上面に移し、5分間待ちます。
7. カバーガラスと支持スライドガラスを組み合わせ、その間に酵母細胞を挟みます。適切な力で押して、アタッチメントを固定します。
   注:酵母細胞が動かない単層を形成するが、押しつぶされないように、適切な圧力を見つけるにはある程度の練習が必要です(図1B)。このステップでは、液体媒体が押し出され、下にあるティッシュペーパーに吸収されます。
8. サンプルスライドを顕微鏡ステージに取り付けます。微分干渉コントラスト(DIC)または位相コントラスト(PC)照明を使用して、酵母細胞のパッチを特定し、焦点を合わせます。
   注:細胞の位置を特定するために蛍光を使用しないでください。そうしないと、データ収集前に信号が漂白される可能性があります。
9. 画像の Z スタックを収集するための 3 つのパラメーター セット (Z セクショニング、イメージング チャネル、露出パラメーター) を手動で構成します。
   注: 1 つの商用ソフトウェアでのパラメータ設定の GUI 例については、 補足の図 1 を参照してください。正確な外観はソフトウェアプラットフォームによって異なりますが、オプションはほぼ同じです。
   1. Z切片:0.5 μmのステッピングでスライスを15スライス(深さ7 μmをカバーし、通常は正常な半数体酵母細胞に十分)を収集します。
   2. イメージングチャンネル:細胞の輪郭や必要に応じて適切な蛍光チャンネルにDICまたはPCを選択します。
   3. 励起光強度と露光時間:サンプルに応じて、励起光強度と露光時間を設定します。
      注:出発点として、励起光強度には100%を使用し、露光時間には100ミリ秒を使用します。Z-Stack Collectionの進行に伴って光退色が明らかになった場合、または信号がカメラの記録容量を超える場合(つまり、信号の飽和)は、光強度を下げます。信号対雑音比が低い場合は、光の強度を上げます。
10. イメージング設定を書き留め、比較するすべてのサンプルに同じ設定を使用します。
    注: データ収集と画像の視覚化に「自動」設定を使用しないでください。ラボノートに設定を記録して、将来の実験の繰り返しでまったく同じパラメータを再適用できるようにすることが重要です。一部の顕微鏡制御ソフトウェアアプリケーションには、設定を保存して再適用する機能があります。それでも、ソフトウェア プロファイルが同僚によって意図せずに削除または変更される可能性があるため、設定を独立して記録することをお勧めします。
11. データを16ビットマルチチャネルスタック形式で保存します。
    注:8ビットRGB画像(または3色すべてをカウントする場合は24ビット)として保存しないでください。8 ビット形式の制限事項については、画像の視覚化のセクション (セクション 4) を参照してください。
12. 次のイメージ スタック コレクションのために、まったく別の領域に移動します。
    注:隣接する領域では、光退色と光毒性が発生している可能性があります。その結果、これらの領域から収集された画像スタックは誤解を招く可能性があります。

3.タイムラプスイメージング

注:タイムラプスイメージングの手順は、サンプル調製とイメージングパラメータの2つの領域で、単一時点イメージングの手順とは異なります。

1. サンプル調製
   1. 35 mmのガラス底皿に1 mg / mLのコンカナバリンAをコーティングし、5分以上待ちます。.
   2. 1.5 mLの酵母液体培養物を皿に加え、酵母細胞がガラス表面に沈殿するまで5分間待ちます。
   3. ピペットを使用して、皿の端から液体培地を吸引し、酵母沈殿物のパッチを約1 mLの新しい培地で穏やかにすすぎ、不安定に付着した細胞を取り除きます。
   4. すすぎを2〜3回繰り返します。ピペットで吸引し、2 mLの新鮮な培地を静かに加えます。
2. イメージングパラメータ
   1. Z切片:0.5μmのステッピングで15スライスを採取します。
   2. イメージングチャンネル:必要に応じて選択します。
   3. 励起光強度と露光時間:調査中の細胞内構造を識別するために必要最小限のものを使用してください。
      注:タイムラプスイメージングの場合、繰り返しの照明による光退色と光毒性により、収集できるタイムポイントの総数が制限されます。そのため、加振強度や露光時間は一般的に低い値に設定して、より多くの時点を撮像できるようにしています。
   4. イメージング間隔:調査対象の生物学的プロセスに適したタイミング間隔を設定します。
      注:例えば、飢餓条件下でのオートファゴソームの形成には約5〜10分かかります。そのダイナミクスを追跡するには、1分以下の間隔が推奨されます。栄養豊富な条件下では、酵母細胞周期は時間スケールで発生します。10〜20分などのより長い間隔を利用できます。
3. 適切なハードウェアが利用可能な場合は、皿の温度を30°Cに保ちます。
   注:酵母細胞のほとんどの生物学的プロセスは、一般的に遅いペースを除いて、室温(RT)でもイメージングできます。

4. 画像スタックの可視化と統合コピー数の評価

1. 画像の視覚化と分析のためのフィジーまたはImageJソフトウェアをインストールします^11,12。
   注:フィジーはImageJに基づくツールコレクションであり、汎用の生物学的画像データの視覚化と処理に適しています。このプロトコルに記載されている画像処理には、追加のプラグインがないImageJで十分です。
2. 画像の表示と比較に適したパラメータを選択します。
   1. フィジーで、いくつかの z-stack イメージを開きます。
   2. 各スタックの Z 位置を中央セクション (または、調査中の構造がそこでより視覚化されている場合は他の位置) にドラッグします。
   3. [画像]>[明るさ/コントラスト>調整]に移動し、[リセット]をクリックします。
   4. 「輝度/コントラスト (B&C)」ウィンドウで、スクロール・バーを使用して 2 つのパラメーター (最小値と最大値) を変更し、調査対象の構造を明確に識別します。
      注:通常、 最小 値は空の領域の平均値に近く設定され、 最大値 は画像の最大値に近くなるように設定されます。これらの値は、表示されたヒストグラムから推測できます(図2A)。イメージングワークステーションがカラーキャリブレーションされている場合は、最小値を少し高く設定して、より多くのバックグラウンド信号を隠すことができます。
   5. 「輝度/コントラスト(B&C)」ウィンドウで、「設定」をクリックし、ポップアップウィンドウの「表示範囲の設定」で「他のすべての開いている画像に伝播」チェックボックスを選択します。
      注:この操作では、開いているすべての画像に同じ明るさ/コントラスト設定(最小値と最大値を含む)を適用して、画像を相互比較できるようにします。
   6. さまざまな画像を見て、それぞれの z スタックをスクロールします。画像が適切な暗い背景と少し誇張された彩度で見栄えがする場合は、 最小 設定と 最大 設定を書き留めます。
3. マルチチャンネル画像の場合は、各チャンネルの画像表示設定を選択します。
   1. [Image > Color > Channels Tool]に移動し、ポップアップウィンドウの[Channels]でグレースケールモードを選択します。
   2. 各チャンネルを確認し、そのチャンネルの適切な 明るさ/コントラスト を選択し、設定を書き留めます。
   3. 明るさ/コントラストを調整したら、チャンネルウィンドウに戻り、コンポジットモードに変更して、複数のチャンネルを同時に視覚化します。
      注意: 各チャンネルの疑似色は、個人の好みに合わせてチャンネルで手動で変更できます。チェックボックスは、特定のチャンネルを表示/非表示にするためのものです。
4. 必要に応じて、「 チャネル」 ウィンドウのチェックボックスを使用して、特定のチャネルを表示または非表示にします。
5. 必要に応じて、[ イメージ] > [スタック] > [Z プロジェクト] に移動して、スタック プロジェクションを生成します。
   注:いくつかの投影モードが利用可能です。最大強度は、迅速な評価に適しています。研究の性質を考慮して、特定の投影モードまたは個々のスライスを定量化に使用する必要があるかどうかを判断する必要があります。投影は、焦点が合っていない光の干渉を減らすために、選択したzスライスに制限することもできます。
6. シングルコピー統合トランスフォーマーのスクリーニング。
   1. 開いているすべての画像に同じ 輝度/コントラスト 設定が適用されたら、サンプル間の画像強度を比較してプラスミド積分数を推測します。
      注:画像は、液体培地での一晩の培養から始めて、単一時点イメージングの一般的な手順に従って取得する必要があります。マルチコピー統合( 例として図2B のコロニー2と3を参照)は、シングルコピーの統合( 図2Bのコロニー1)よりも大幅に明るく見えます。対照的に、シングルコピーのものは互いに似ています(図2B)。
   2. 各株の8つのトランスフォーマントからの画像を調べ、同じ 明るさ/コントラスト 設定を使用していることを確認してください。
   3. 3つ以上のシングルコピー形質転換体をリストリークして保存し、その後の研究に備えます。
7. プレゼンテーション用の画像をエクスポートします。
   1. [Image (画像)]> [Duplicate] (複製) に移動して、目的の画像のコピーを作成し、任意の名前を付けます。
   2. [Image >に移動し、[Type of > 8-bit]を選択して、重複コピーを16ビットから8ビットに変換し、必要に応じて保存します。
      注: これを適用すると、 明るさ/コントラスト の設定が以前に書き留められていない場合、その情報を簡単に取得する方法はなく、したがって、後続の画像視覚化で同じ設定を再適用する簡単な方法はありません。これは、前の複製操作が推奨される理由でもあります。
   3. z スタックを個々のイメージのコレクションに分割するには、[ イメージ] > [スタック] > [イメージ] に移動し 、必要に応じて保存します。
      注:フィジーでは、画像を小さな領域にトリミングすることもできます。

結果

細胞小器官の形態とダイナミクスは、酵母細胞が外部および内部のシグナルに応答するにつれて変化する可能性があります。ここでは、中対数期の酵母オルガネラの代表的な画像を示します(図3A、B)。前述のように、いくつかのオルガネラは明確な形態学的特徴を持っているため、他のオルガネラマーカーと広範囲に比較しなくて?...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、他の研究分野からエントリーしてイメージング酵母オルガネラを探索する人々にとって簡単なスタートを提供します。特定のトピックに移る前に、イメージングソフトウェアの自動機能の過度の使用を控える必要があることをもう一度強調したいと思います。顕微鏡画像は単なる美しい画像ではなく、科学的なデータであるため、その...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sangon Biotech	A600013
Casaminoacid	Sangon Biotech	A603060
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma Aldrich	L7647
D-Glucose	Sangon Biotech	A501991
Fiji			https://fiji.sc/
Glass-bottom petri dish	NEST	706001	Φ35 mm
ImajeJ			https://imagej.net/
Inverted florescence microscope	Olympus		IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera.
L-Histidine	Sangon Biotech	A604351
L-Leucine	Sangon Biotech	A100811
L-Lysine	Sangon Biotech	A602759
L-Methionine	Sangon Biotech	A100801
L-Tryptophan	Sangon Biotech	A601911
Microscope cover glass	CITOTEST	10222222C	22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm
Microscope slides	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm
Peptone	Sangon Biotech	A505247
Uracil	Sangon Biotech	A610564
Visiview	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Yeast extract	Sangon Biotech	A100850
Yeast nitrogen base without amino acids	Sangon Biotech	A610507
YNB without amino acids and ammonium sulfate	Sangon Biotech	A600505