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要約

本プロトコルは、グルコン酸クロルヘキシジン(CG)誘発腹膜線維症の腹膜透析(PD)マウスモデルを確立する。現在のモデルは、他のPD動物モデルと比較してシンプルで使いやすいです。

要約

腹膜線維症は腹膜透析(PD)の重要な合併症です。この問題を調査して対処するには、PDの適切な動物モデルが必要です。本プロトコルは、PD患者の状態を模倣するグルコン酸クロルヘキシジン(CG)誘発腹膜線維症モデルを確立します。 腹膜線維症は、15%エタノール中のCGの0.1%を腹腔内注射によって3週間(1日おきに投与)、雄のC57BL / 6マウスで合計9回誘発しました。その後、腹膜機能試験を22日目に実施した。マウスを屠殺した後、腹壁の頭頂腹膜および肝臓の内臓腹膜を採取した。マッソンのトリクローム染色後に顕微鏡で分析すると、それらはより厚く、より線維化していました。限外濾過速度は低下し、グルコース物質輸送は腹膜透過性のCG誘発性の増加を示した。このようにして確立されたPDモデルは、PD技術の改善、透析の有効性、および患者の生存期間の延長に応用できる可能性があります。

概要

腹膜透析(PD)は腎代替療法の一種です。しかし、PDには解決できない問題があります。例えば、長期のPD治療は腹膜損傷を引き起こし、最終的には限外濾過不全および治療の中止につながる可能性がある1、2、3、4、5、6。腹膜線維症は最も深刻な合併症の1つです7,8。腹膜線維症は、間質内の細胞外マトリックスの沈着および蓄積、ならびに腹膜の血管新生および血管障害によって特徴付けられる9、10。

これらの腹膜変化の主な原因は、再発性腹膜炎および透析液の非生体適合性であり、これらは高浸透圧、高グルコース、低pH、およびグルコース分解生成物の蓄積である11,12。したがって、適切な動物実験モデルは、研究者がPD療法中の腹膜の生理学的および病理学的変化をよりよく研究するのに役立ちます。したがって、動物PDモデルの確立は、PD技術および透析有効性を改善し、患者の生存期間を延長するために重要である。この研究は、前述のように、グルコン酸クロルヘキシジン(CG)の腹腔内(i.p.)注射によってPDマウスモデルを生成することを目的としていました13,14。このPDマウスモデルは、他のPD動物モデルと比較して、シンプルで使いやすく、実現可能です。

プロトコル

すべてのマウス実験は、E-DA病院/I-Shou大学の実験動物センターによって承認され、「実験動物の世話と使用のためのガイド」(NRC、USA 2011)に従って処理されました。本研究には、7〜8週齢の雄C57BL / 6マウスを使用しました。

1.化学薬品の準備

  1. 0.1%グルコン酸クロルヘキシジン(CG、 材料表を参照)を15%エタノールで希釈することにより、化学刺激物を調製します。

2.動物の治療

  1. 3匹のマウスを対照群として割り当てます。1 mL / kgの0.9%生理食塩水(NS)を1日おきに3週間、合計9回腹腔内注射(i.p.)します。.
  2. 3匹のマウスを腹膜線維症群に割り当てます。グルコン酸クロルヘキシジン(CG)を使用して腹膜線維症を誘発する 15%エタノール中のCGの0.1%のi.p.注射(ステップ1.1)を12.5μL / g体重の用量で投与することにより。.これを1日おきに3週間、合計9回実行します。

3.腹膜機能検査(修正腹膜平衡検査)

  1. 4.25%グルコースを含む透析溶液を調製する。0.5mLの透析液サンプルを注射器で採取し、透析液サンプル中のグルコース濃度を確認します。
    注:グルコース濃度は、ヘキソキナーゼ/ G6PD法に従って決定されます。透析液サンプルをL型Glu2アッセイにアクセスし、生化学分析装置で調査した( 材料の表を参照)。これが初期透析液グルコース濃度である。
  2. ゾレチルとキシラジン(体積で1:2の比率で調製、 材料の表を参照)を20μL / 20gwの用量で筋肉内注射することにより、マウスを麻酔します。.さらに、麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
  3. 透析液(2 mL / 20 g体重)の点滴を行います。
  4. 30分後、つま先のピンチ反射の欠如を伴う麻酔の深さを評価および検証します。次に、腹部の正中線(剣状突起の下)を垂直に切開し、マウスの腹部を開き、注射器(「ボリューム1」と定義)で腹腔内液を採取します。次に、清潔で乾燥した綿の重量を測定し、綿をマウスの腹腔に入れて、残留腹腔内液を吸収します。最後に、綿の重さをもう一度測定します。
    注:綿の体重増加は、残留腹腔内液の重量と同じです。次に、得られた体積(比重:1 g / cm3、「体積2」と定義)に変換します。最終的な透析液量は、ボリューム1とボリューム2です。
  5. 0.5 mLの透析液サンプル(最終透析液)を使用してグルコース濃度を測定します。これが最終的な透析液グルコース濃度です。
  6. 式15を使用して正味限外ろ過を計算します。
    figure-protocol-1439
  7. 下記式15を用いて腹膜透過性を計算する:
    figure-protocol-1586

4.腹壁筋と肝臓の組織調製と組織学的分析

  1. 心臓穿刺(瀉血)によってマウスを犠牲にする3,16。
  2. 腹壁(1 cm x 1 cm)と全肝切除術を切断します。マウスの腹壁と肝臓組織を10%中性緩衝ホルマリンで一晩固定します。
  3. 腹壁筋と肝臓の厚さ3μmのパラフィン切片を作製し、既報の17に続いて組織学的解析を行います。
  4. マウスの腹壁の頭頂腹膜および肝臓表面の内臓腹膜を形態測定18を用いて評価する。
  5. 統計およびグラフ作成ソフトウェアを使用して統計分析を実行します( 材料表を参照)。すべてのデータをSD±平均値として表し、t検定19を使用して統計的有意性を分析します。 P < 0.05 の値を有意な結果として定義します。

結果

図1A,Bでは、腹壁の頭頂腹膜はマッソンのトリクローム染色17の下で著しく厚く、より線維化しており、CG曝露群では腹膜線維症が対照生理食塩水群(NS)よりも重症であることを示しています。図2A,Bでは、肝臓表面の内臓腹膜も著しく厚く、線維性が高く、CG曝露群では、腹膜線維症が対照生理食塩水群(NS)よりも重症で?...

ディスカッション

本研究では、CGのi.p.注射によりマウスPDモデルを提示し、PD患者の状態を模倣した腹膜線維化と機能低下を示した。

プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。まず、CGまたはNSのi.p.注射を行うには、穿刺による腹腔内臓器損傷を防ぐために、鉗子を使用してマウスの腹壁皮膚をピックアップする必要があります。第二に、組織学的分析のために腹壁の腹膜を?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

私たちは、研究の批判的な議論と部分的な実行について、Shin-Han Tsengに心から感謝します。この研究は、E-DA病院研究財団と台湾の国立成功大学のEDAHP110003およびNCKUEDA110002によってサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Normal SalineY F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan-
10% neutral buffered formalinTaiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan00002A
Automatic biochemical analyzerHitachi Ltd., Tokyo, JapanLabospect Series 008for determining glucose concentration
Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2OSigma-Aldrich, MO, USAC9394diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection
EthanolAvantor Performance Materials, LLC, PA, USABAKR8006-05diluted to 15% with normal saline for working concentration
Glucose (Dianeal)Baxter International, Inc., IL, USAFNB9896Commercial dialysis solution (4.25%)
GraphPad Prism 8.0GraphPad Software, Inc., CA, US
L-type Glu 2 assayFUJIFILM Wako, Japan461-32403
Xylazine 20Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan-
Zoletil 50Virbac Laboratories, Carros, France-

参考文献

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