ブタ心臓における容量性免疫プローブによる神経ペプチドダイナミクスの時間分解 インビボ 測定

要約

インビボでペプチド伝達物質を測定するための確立された免疫化学的方法は、オフライン分析のためのサンプルを得るために微量透析またはバルク流体描画に依存する。しかし、これらは時空間的な制限に苦しんでいます。本プロトコールは、既存の技術の限界を克服する容量性免疫プローブバイオセンサの作製および適用を記載する。

要約

疾患進行の評価に関連するバイオマーカーを インビボで 測定する能力は、科学界および医学界にとって大きな関心事である。特定のバイオマーカーを測定する現在の方法から得られた結果の分解能は、空間的および時間的にも分解能が制限される可能性があるため、取得に数日または数週間かかることがあります(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ[ELISA]、高速液体クロマトグラフィー[HPLC]、または質量分析によって分析された間質液の流体区画微量透析)。したがって、タイムリーな診断と治療の指導が中断されます。本研究では、容量性免疫プローブバイオセンサ(CIプローブ)を用いて 生体内で ペプチド伝達物質を検出・測定する独自の技術が報告されている。これらのプローブの製造プロトコルおよび インビトロ 特性評価が記載されている。 インビボでの 交感神経刺激誘発性ニューロペプチドY(NPY)放出の測定が提供される。NPY放出は、参考のためにノルエピネフリンの交感神経放出と相関している。このデータは、 インビボでの神経ペプチドの迅速かつ局所的な測定のためのアプローチを実証している。将来のアプリケーションには、疾患進行の術中リアルタイム評価と、これらのプローブの低侵襲カテーテルベースの展開が含まれます。

概要

バイオマーカーを検出および定量するためのいくつかの化学的方法は、タンパク質化学および臨床診断の両方において、特に癌診断および心血管疾患進行の評価において日常的に利用されている。現在、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、および質量分析などの方法は、バルク流体描画による血管区画¹、^2、3または微小透析による間質区画からのサンプル収集に依存している。微小透析は、関心領域に配置された既知の長さの半透膜チューブを採用する。収集流体は、分析⁵のためにサンプルを収集するために数分にわたってチューブ⁴を通して灌流され、したがって時間的分解能を制限する。このようにして、収集されたサンプルは、局所微小環境の経時的な平均値のみを提供し、灌流速度および十分なサンプル量の収集によって制限される。さらに、これらの方法は、実験データのプーリングとシグナル平均化を必要とする。したがって、被験者間の変動性を説明できない可能性があります。重要なことに、サンプル収集とその後のオフライン分析の間の時間は、即時の臨床介入および治療を妨げます。

本プロトコールにおいて、特異的生理活性ペプチドの時間分解電気的検出のための容量性免疫プローブバイオセンサ(CIプローブ)の使用が概説されている。神経ペプチドY(NPY)は、血管系、心内膜、心筋細胞、および心臓内神経節を神経支配する神経節後交感神経ニューロンから放出され、心血管系における主要な神経調節ペプチド伝達物質である⁶、⁷、^8、9。ここで提示された方法はNPYを測定するように設計されており、実験的実現可能性はブタ心臓モデルで実証されている。しかしながら、このアプローチは、選択的抗体が利用可能である任意の生理活性ペプチドに適用される¹⁰。この方法は、機能化された先端^部11、12における白金線プローブと導電性流体との間の容量性接合に依存する。本出願では、相互作用は、電極先端に結合した標的ニューロペプチド(NPY)に対する抗体を介して媒介され、導電性流体環境とインターフェースする。この官能化は、白金線プローブ^10、13の先端への反応性ポリドーパミンの電着によって達成された。

抗体官能化プローブが 生体内の関心領域に配置されると、誘発された内因性NPY放出はプローブ先端上の捕捉抗体への結合をもたらし、電極表面の導電液はNPYタンパク質によって変位する。電気環境における局所的な変化は、不動の静的に荷電した分子を有する高移動度、高誘電性流体の変位をもたらす。これは、電極-流体界面、したがって、ステップ関数指令電位に応答して充電電流の変化として測定されるその静電容量を変化させる。個々の測定サイクルの直後に負の「リセット」電位を採用して、静電相互作用を介して抗体から結合NPYをはじき、その後の測定¹⁰ラウンドで抗体結合部位をクリアします。これにより、時間分解された方法でNPYを効果的に測定できます。独自のCI技術は、上記で概説した微小透析ベースの免疫化学的方法の限界を克服し、複数の実験にわたってデータプーリングやシグナル平均化を行わずに、単一の実験から動的バイオマーカーレベルを測定し^、ほぼリアルタイムでデータを提供します。さらに、時間分解および局在化スケールで適切な抗体が存在する任意のバイオマーカーにこの方法を適応させる能力は、疾患進行の評価および治療介入のガイダンスのための免疫化学的測定における大きな技術的進歩を提供する。

データ収集と分析のためのソフトウェアは、IGOR Pro(完全にインタラクティブなソフトウェア環境)でカスタム作成されました。アナログ-デジタルコンバータ(A/D)システムは、コンピュータ制御下で指令電圧を発行し、カスタムアンプからデータを集録しました。アンプは、特定のユニークな機能を持っていました。これらには、4つの集録チャンネルのそれぞれに対応する帰還抵抗(切り替え可能)が含まれており、1 MOhmまたは10 MOhmのフィードバック電圧クランプ回路を選択して電極の変動性を統合することができます。また、1つのヘッドと4つの集録チャンネルすべてに対して相互のグランド/リファレンス回路を備えたステージユニットも構築され、デバイスを1つの物理モジュールに胸部の近くに配置しました。1 MOhmの帰還抵抗設定を使用して、報告されたすべてのデータを収集しました。

フィルタとゲインの設定はアンプから電信され、データファイルに記録されました。データは、10kHzでデジタル化された2極アナログベッセルフィルタを介して1kHzでフィルタリングされました。プローブと周囲の導電性溶液との間の電位の差は、プローブ先端にヘルムホルツ容量性層を作り出す。プローブ先端で抗体に結合するリガンドは、局所電荷の変化をもたらし、したがって、ヘルムホルツ容量の変化をもたらす。回路の容量性成分のこの変化は、プローブをステップ関数電圧プロトコルの電位に導くために必要な注入電荷の大きさのシフトをもたらす。したがって、機能化されたプローブへの特異的リガンドの結合は、ピーク容量性電流の変化として電極容量測定に変化をもたらす。

プロトコル

すべての動物実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校動物研究委員会によって承認され、実験動物の世話と使用のための国立衛生研究所ガイド(第8版、2011)によって定められたガイドラインに従って実施されました。約75kgの成体雄ヨークシャーブタを in vivo 研究^{に使用した10}。

1. 容量性免疫プローブの作製と機能化

1. 長さ25cmのパーフルオロアルコキシ(PFA)被覆白金線( 材料表参照)を切断し、一端から約5mmのPFA被覆をメスで剥がし、白金線に切れないように注意する。
2. 白金線の剥がれた端を金メッキの1mmの雄コネクタピンに挿入し、針鼻ペンチを使用して白金線の剥がれた端の周りのコネクタピンの歯を圧着します( 材料表を参照)。
3. 白金線を金メッキコネクタピンにはんだ付けします。はんだを過剰に使用しないよう注意してください。
4. 50 mLのドーパミンHClを10 mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 6.0)に溶解してドーパミン溶液を調製した。
5. ドーパミンが完全に溶解したら、白金線の先端を新しく作ったドーパミン補給PBSの入った容器に入れます。金色のコネクタピンをヘッドステージのチャンネルに差し込みます( 材料表を参照)。
6. AgClディスク電極(接地電極、 材料表を参照)をヘッドステージの接地チャネルに接続します。ドーパミン補充PBSおよび白金線を含む容器にAgClディスクを置く;ディスク電極のみを水没させ、ワイヤやはんだの長さは入れないように注意してください。先に進む前に、ワイヤシャントをヘッドステージのリファレンスチャンネルに接続します。
7. インタラクティブなデータ集録ソフトウェアを開きます( 資料表を参照)。次のパラメータを持つ鋸歯状電着コマンド電位プロトコルを準備します:開始電位= −0.6V;終端電位 = +0.65 V;スキャンレート = 0.04 V∙^s-1;堆積の持続時間= 420秒。ポリドーパミン沈着プロトコルを開始し、すべてのワイヤが正しく接続されていることを確認します。
8. ポリドーパミン蒸着が完了したら、AgClアースペレットと白金線の先端を容器から取り出し、白金線電極の先端を乱さないように注意する。抗体溶液が調製されるにつれて、ワイヤーの先端をPBS(pH7.4)を含むマイクロチューブに2〜5分間置く。ワイヤチップがマイクロチューブの側面または底部に接触していないことを確認します。
   注:抗体溶液は、ポリドーパミン沈着中に作製することができる。しかしながら、ポリドーパミン沈着後のドーパミン含有容器からPBSのマイクロチューブへの白金線の転写はスキップされるべきではない。
9. 抗体溶液を調製する。目的の抗体をPBS(pH 7.4)と1:20の比率で適切なサイズの容器(例えば、マイクロチューブ)で結合させる。
   注:ここで使用した抗NPYモノクローナル抗体( 材料表を参照)は、1mg/mLで小分けされた。ここでの抗体調製の例は、76 μLのPBSに対する4 μLの抗体であろう。
10. 白金電極のポリドーパミン付着チップを抗体溶液に室温で最低2時間浸し、再び白金線チップが溶液中に浮遊し、マイクロチューブの内面に載っていないことを確認します。
    注:この技術の最近の実装では、後で使用するために湿式または乾式の保管ではなく、このステップの直後に白金線電極を使用することが好まれています。
11. 抗体溶液に浸した後、新たに官能化した容量性免疫プローブ(CIプローブ)チップをPBS(pH7.4)で短時間リンスする。これで、プローブを使用する準備ができました。

2. ペプチドの in vitro 検出および測定のための実験セットアップ

1. CIプローブの機能先端をフローチャンバ内に置き、プローブの感覚先端を損傷する可能性があるため、電極の先端をいかなる方法でも乱さないように注意してください。
   注:フローチャンバは、シリコーンエラストマー( 材料表を参照)を35mmの培養皿に注ぎ、皿の中央に細長い卵形スペースフィラーを流すことによって作成されました。硬化後、卵形形状がエラストマーから除去される。次いで、チャンバーをトリス緩衝生理食塩水(TBS)で過溶させ、3mL/minの流速で許容した。流入および流出が過溶融物の潮汐作用が観察されないようにチャンバ内の流体レベルを維持するようにする。フローは、CI プローブが使用されている限り、その場にとどまる必要があります。
2. 最初の実験試験の前に、TBS標準実行を実行してCIプローブをコンディショニングします。次のコマンド電圧プロトコルを設定します:正のステップ電位= +100mV。負のステップ電位 = −5mV;ステップ持続時間 = 20 ミリ秒;取得期間 = 600 秒。
   注:データ取得前のサイクリングコマンド電位の初期段階でプローブの平衡化を可能にすることが重要です。
3. スーパーフセートの組成を維持するために同じTBSを使用して目的のペプチドの溶液を作成します。チューブシステムやフローチャンバに気泡を導入せずに、TBSとペプチド補充TBSの間でスーパーフューセートを切り替えることができるマニホールドシステムを設定します。
   注:合成ブタNPYペプチド( 材料表参照)を本研究に使用した。
4. TBS標準パラメータを使用してペプチドセンシングデータ収集プロトコルを設定します(ステップ2.2を参照)。
   注:この実施において、各実験試験の持続時間は360秒(120秒TBS、120秒ペプチド補充TBS、120秒TBS)であった。

3. in vivo 使用のためのCIプローブの適応

1. ポリドーパミン沈着(ステップ1.7)の前に、白金線電極の露出した先端を22G皮下針に通し、針の先端から約2mm先に残す。鉗子を使用して、白金線電極の先端を静かに曲げ、皮下注射針の端から垂れ下がる「とげ」を作ります。
   1. 有刺鉄線の先端から針を静かに引き抜き、針が流体に接触することなく容器に入れるのに十分なワイヤーを残します。ステップ 1.4.-1.11 に進みます。
      メモ: in vivo の設定によっては、25 cm を超える長さの白金線を切断する必要がある場合があります。
2. CIプローブをヘッドステージに接続する前に、電気セットアップ全体が正しく接地されていることを確認してください。これを怠ると、実験録音中に不要な電気的干渉が発生する可能性があります。
3. 以前に発表された報告書¹⁰に従って動物を麻酔する。
4. 関心領域を露出させる手術を行う。
   注:本研究では、心臓を露出させるために中央値胸骨切除術を行った。動物の手術の詳細については、Kluge et ^al.10 を参照してください。
5. PBSリンスから機能化された先端を静かに取り外し(ステップ1.11)、ヒドダーム針を有刺鉄線のC.I.プローブに前進させ、金コネクタピンをヘッドステージに差し込む前に、関心のある領域に静かに埋め込みます。移植したら、皮下注射針を抜き取り、電極を所定の位置に残します。
   注:本研究のために、プローブを左心室心筋¹⁰の中間側壁に配置した。
6. 適切な電気的セットアップを確認したら、標準および実験的なテストプロトコル(ステップ2.2.およびステップ2.4)に進みます。
7. 実験が完了したら、制度的に承認された技術に従って動物を安楽死させる。
   注:本研究では、動物は心室細動の誘導 を介して 深い麻酔下で安楽死させられる¹⁰。

結果

電極の作製と特性評価
柔軟な容量性免疫プローブ(CIプローブ)を作製し、代表的な画像を 図1Aに示します。電極電位をコンピュータ制御の電圧クランプ回路(図1B)により設定し、PBS製のポリドーパミン溶液に電極を浸漬した。ポリドーパミンを官能化のために導電性電極チップ¹³ 上に電着させた。指令電位がプロー?...

ディスカッション

本プロトコールは、イン ビトロおよびインビ ボの両方の設定において目的のバイオマーカーを検出および測定することができる容量性免疫プローブ( CI プローブ)の製造および試験を記載する。検出は、バイオマーカーを電極先端に捕捉することによって達成される。トラップイベントは、白金線容量性免疫プローブと周囲の導電性流体環境との間の容量性接合を変化させ、プ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654