FACSによる無動および損傷マウス骨格筋からの線維脂肪原性前駆細胞および筋幹細胞の単離および培養

要約

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)および筋幹細胞(MuSC)の正確な同定は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的機能を研究するために重要です。このプロトコルは、成体マウスの筋肉からのFAPおよびMuSCの分離、精製、および培養のためのガイドラインを提供します。

要約

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)は、線維形成、脂肪原性、骨形成性、または軟骨原性の系統に沿って分化することができる骨格筋に常在する間葉系間質細胞(MSC)の集団です。FAPは、筋幹細胞(MuSC)とともに、細胞外マトリックス(ECM)を積極的に維持およびリモデリングしながら、筋肉の恒常性、修復、および再生に重要な役割を果たします。慢性的な損傷や筋ジストロフィーなどの病的状態では、FAPは異常な活性化を受け、コラーゲン産生線維芽細胞と脂肪細胞に分化し、線維症と筋肉内脂肪浸潤を引き起こします。したがって、FAPは、MuSC代謝回転を維持し、組織修復を促進するか、骨格筋組織の完全性と機能を損なう線維性瘢痕形成と異所性脂肪浸潤に寄与することにより、筋肉の再生に二重の役割を果たします。FAPおよびMuSCの適切な精製は、生理学的および病理学的状態におけるこれらの細胞の生物学的役割を理解するための前提条件です。ここでは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を用いて成体マウスの四肢筋からFAPとMuSCを同時に単離するための標準化された方法について説明します。プロトコルは、四肢筋全体および損傷した前脛骨筋(TA)からの単核細胞の機械的および酵素的解離を詳細に説明しています。その後、FAPおよびMuSCを半自動セルソーターを使用して単離し、純粋な細胞集団を取得します。さらに、静止および活性化されたFAPおよびMuSCを単独または共存培養条件で培養するための最適化された方法について説明します。

概要

骨格筋は体内で最大の組織であり、成人の体重の~40%を占め、姿勢の維持、運動の生成、基礎エネルギー代謝の調節、^{および体温1}を担っています。骨格筋は非常に動的な組織であり、機械的ストレス、代謝変化、日常の環境要因など、さまざまな刺激に適応する優れた能力を持っています。さらに、骨格筋は急性損傷に応じて再生し、その形態と機能の完全な回復につながります²。骨格筋の可塑性は、主に筋線維原形質膜と基底層の間に位置するサテライト細胞とも呼ばれる常在筋幹細胞(MuSC)の集団に依存しています^2,3。通常の条件下では、MuSCは静止状態で筋肉ニッチに存在し、細胞の代謝回転を補い、幹細胞プールを補充するための分裂はわずかです⁴。損傷に応答して、MuSCは細胞周期に入り、増殖し、新しい筋線維の形成に寄与するか、自己複製プロセスでニッチに戻ります^2,3。MuSCに加えて、骨格筋の恒常性維持と再生は、線維脂肪原性前駆細胞(FAP)と呼ばれる筋肉常在細胞の集団のサポートに依存しています

プロトコル

実施されたすべての動物実験は、国立関節炎・筋骨格系・皮膚疾患研究所(NIAMS)の動物管理使用委員会(ACUC)によって承認された制度的ガイドラインに準拠して実施されました。このプロトコルを実行する研究者は、地域の動物倫理ガイドラインを遵守する必要があります。

注:このプロトコルでは、後肢および損傷した前脛骨筋からFAPおよびMuSCを分離する方法を詳細に説明しています 成体オスおよびメスマウス(3〜6か月)のマウスと共培養のためのガイドラインを提供します。実験手順の概要を 図1に示します。このプロトコルのすべてのステップは、特に指定がない限り、無菌状態および室温(RT)で実行する必要があります。

1. 試薬のセットアップ

1. 洗浄培地(WM):ハムのF-10栄養ミックス細胞培地に10%(vol / vol)の馬血清と1xペニシリン/ストレプトマイシンを加えて、この溶液を調製します。WMは予め調製し、4°Cで保存することができる。
2. 筋肉解離バッファー(MDB):コラゲナーゼIIをWMに溶解してこのバッファーを調製します。後肢全体の筋肉を採取する場合は、マウスごとに10 mLのWMに1000 U / mLのコラゲナーゼIIを溶解します(50 mLのコニカルチューブに調製します)。TA筋肉を収集す....

結果

このプロトコルにより、野生型成体マウス(3〜6か月)の損傷していない後肢から約100万のFAPと最大350,000のMuSCを分離することができ、これはFAPで8%、MuSCで3%の収量に対応します。損傷後7日で損傷したTAから細胞を選別する場合、2〜3個のTA筋肉をプールして、最大300,000個のFAPと120,000個のMuSCを取得し、これらはそれぞれ11%と4%の収率に相当します。ソート後の純度値は、通常、FAP および MuSC で 95%.......

ディスカッション

純粋な成体幹細胞集団の同定と単離のための効率的で再現性のあるプロトコルを確立することは、その機能を理解するための最初で最も重要なステップです。単離されたFAPおよびMuSCは、筋肉疾患の潜在的な治療法として移植実験におけるマルチオミクス解析を行うために使用することができ、または幹細胞治療における疾患モデリングのために遺伝子改変することができる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile	BD Biosciences	305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)	The University of British Columbia	53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody	BioLegend	102510
APC anti-mouse CD45 Antibody	BioLegend	103112
BD FACSMelody Cell Sorter	BD Biosciences
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL	BD Biosciences	309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody	BioLegend	105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male)	The Jackson Laboratory	000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse	The Jackson Laboratory	007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356408
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile	VWR	414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile	Corning	352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile	Corning	353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL	VWR	352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning	VWR	60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning	VWR	21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)	Promega	G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder	ThermoFisher Scientific	17101015
Gibco Dispase, powder	ThermoFisher Scientific	17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES	ThermoFisher Scientific	12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States	ThermoFisher Scientific	16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix	ThermoFisher Scientific	11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin	ThermoFisher Scientific	16050122
Gibco PBS, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4	ThermoFisher Scientific	70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	ThermoFisher Scientific	10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21127
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools Inc	14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)	ThermoFisher Scientific	A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody	R&D Systems	AF1062
Normal Donkey Serum	Fisher Scientific	NC9624464
Normal Goat Serum	ThermoFisher Scientific	31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody	BioLegend	108120
Paraformaldehyde, 16%	Fisher Scientific	NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)	Developmental Study Hybridoma Bank	N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin	BioLegend	405206
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools Inc	91500-09
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools Inc	91150-20
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787