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Erratum Notice

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要約

ここでは、リン酸カルシウムコーティング細胞培養プレートを用いた再吸収ピットアッセイのための簡単で効果的なアッセイ手順を提示する。

要約

成熟破骨細胞は、酸および酵素の分泌を介して骨を分解することができる多核細胞である。それらは様々な疾患(例えば、骨粗鬆症および骨癌)において重要な役割を果たし、したがって重要な研究対象である。 インビトロで、それらの活性は、再吸収ピットの形成によって分析することができる。このプロトコールでは、容易に可視化および定量化できるリン酸カルシウム(CaP)コーティング細胞培養プレートを用いた簡易ピットアッセイ法について記載する。ヒト末梢血単核球由来の破骨細胞前駆体(PBMC)を、破骨細胞形成刺激の存在下でコーティングプレート上で培養した。9日間のインキュベーション後、破骨細胞を固定し、蛍光イメージングのために染色し、一方、CaPコーティングをカルセインによって対比染色した。再吸収領域を定量化するために、プレート上のCaPコーティングを5%AgNO3 で染色し、明視野画像によって可視化した。再吸収ピット面積をImageJを用いて定量した。

概要

破骨細胞(OC)は、造血幹細胞(HSC)に由来する組織特異的マクロファージであり、骨芽細胞1とともに骨リモデリングにおいて極めて重要な役割を果たしている。骨を全身的または局所的に破壊する性ホルモン誘発性、免疫学的、および悪性骨障害は、閉経関連骨粗鬆症2、関節リウマチ3、歯周病4、骨髄腫骨疾患5、および骨溶解性骨転移6を含む過剰な破骨活動によるものである。対照的に、OC形成および機能の欠陥もまた、骨ペトロシス7を引き起こし得る。HSCは、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、遺伝子記号ACP5)刺激下でOC前駆細胞に分化する。M−CSFおよびNF−κBリガンドの受容体アクチベーター(RANKL、遺伝子記号TNFSF11)の両方の存在下で、OC前駆細胞はさらに単核OCに分化し、続いて融合して多核OC8、9、10になる。サイトカインM-CSFおよびRANKLはいずれも、カルシトニン受容体(CT)、核因子κBの受容体活性化剤(RANK)、プロトンポンプV-ATPase、塩化物チャネル7αサブユニット(CIC-7)、インテグリンβ3、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP、遺伝子記号ACP5)、リソソームシステインプロテアーゼカテプシンK(CTSK)、およびマトリックスメタロペプチダーゼ9(MMP9)などの破骨細胞形成マーカーの誘導に不可欠かつ十分である。活性化されたOCは、フリル状の境界11、12を有するアクチンリングの形成を介して骨表面上にシーリングゾーンを形成する。シーリングゾーン内では、OCはプロトンポンプV-ATPase12、13、MMP914、およびCTSK 15を介してプロトンを分泌することによって再吸収を媒介し、ラクナの形成につながる。

インビトロ実験の場合、OC前駆細胞は、マウスの大腿骨および脛骨16,17からの骨髄マクロファージの拡張、ならびに血液試料およびバフィーコート18,19,20からのヒト末梢血単核球(PBMC)の単離によって、または不死化マウス単球細胞RAW 264.7 21,22の分化によって得ることができる。

本プロトコールにおいて、我々は、初代PBMCに由来するOCsを用いたCaPコーティング細胞培養プレートにおける破骨細胞再吸収アッセイを記載する。ここで用いたCaP被覆細胞培養プレート法は、Patntirapongら17 およびMaria et al.21によって以前に記載された方法から採用され、洗練されている。OC前駆体を得るために、PBMCsを密度勾配遠心分離によって単離し、先に記載したように20に拡大する。

プロトコル

このプロトコルは、地元の倫理委員会(承認番号287/2020B02)によってレビューされ、承認されました。

リン酸カルシウム被覆細胞培養プレートの作製

  1. カルシウム原液の調製(トリス緩衝液中で25 mM CaCl 2·2H2O、1.37 mM NaCl、15 mM MgCl2·6H2O)
    1. 1.0 M トリス緩衝液を調製し、1 M HCl を使用して pH を 7.4 に調整します。
    2. マグネチックスターラー上にガラスビーカーを設置し、100mLの1.0Mトリス緩衝液を加える。
    3. 0.368gのCaCl2・2H2O、8.0gのNaCl、0.305gのMgCl2・6H2Oの計量を行い、トリス緩衝液に1つずつ溶解する。
    4. 1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、室温で保存します。
  2. リン酸塩原液の調製(11.H2O、トリス緩衝液中の42mMNaHCO3)
    1. マグネチックスターラー上にガラスビーカーを設置し、100mLの1.0Mトリス緩衝液を加える。
    2. Na2 HPO4· 0.158 gの重量を量る353 gのNaHCO3とH2Oをトリス緩衝液に1つずつ溶解させる。
    3. 1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、室温で保存します。
  3. 96ウェル細胞培養プレートの事前石灰化
    1. 15 mLの1.0 M Tris緩衝液、7.5 mLのカルシウムストック(ステップ1.1.4)溶液、および7.5 mLのリン酸ストック溶液(ステップ1.2.3)を混合することによって、30 mLの作業溶液を調製する。溶液を0.2μmフィルターでろ過します。
    2. 平底を有する96穴細胞培養プレートを作製した。300 μLのリン酸カルシウム溶液をピペット(ステップ1.3.1)を各ウェルに。プレートを蓋で覆い、プレートを37°Cで3日間インキュベートする。
  4. リン酸カルシウム溶液(2.25 mMNa2HPO4・2・2 mMH2O, 4 mM CaCl 2·2H 2 O, 0.14 M NaCl, 50 mM トリス塩基 (ddH 2O)
    1. 磁気攪拌ビーズを備えたビーカー内の40mLの脱イオン水に2mLの1M HClを加え、0.016gのNa2HPO4·H2O、0.0295gのCaCl2・2H2O、0.409gのNaCl、および0.303gのトリス塩基を1つずつ。
    2. 1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、脱イオン水を加えて容量を50 mLに満たします。溶液を0.2μmフィルターでろ過します。
  5. 96穴細胞培養プレートの石灰化
    1. 予め石灰化した96ウェル細胞培養プレートから予備石灰化溶液を吸引し、各ウェルに300μLのリン酸カルシウム溶液(ステップ1.4.2)を加える。プレートを蓋で覆い、37°Cで1日間インキュベートする。
    2. プレートを裏返して溶液を注ぎ、プレートをイオン交換水で3回徹底的に洗い流します。均一な表面を維持するために、ヘアドライヤーまたは圧縮CO2 またはN2 ガスを使用してプレートを直ちに乾燥させる。
    3. コーティングされたプレートをクリーンベンチでUV照射で1時間滅菌する。コーティングされたプレートをすぐに使用するか、プレートをパラフィルムで密封して室温で保管してください。

2. ヒト末梢血からのPBMCの単離

  1. 献血者から書面によるインフォームドコンセントを得た後、静脈から15mLの血液を採取する(倫理的投票:287/2020B02)。
  2. 15mLの新鮮な血液を等量のPBSで希釈し、チューブを数回反転させるか、混合物をピペットに出し入れして混合する。
  3. チューブあたり15mLの密度勾配溶液(例えば、Ficoll、 材料表)を含む50mLの円錐管を調製する。チューブを傾け、30 mLの希釈血液サンプルを15 mLの密度勾配溶液の上に慎重に層状にします(希釈血液サンプル:密度勾配溶液、1:0.5-1比)。
    注:サンプルを重ねるときは、密度勾配溶液を希釈血液サンプルと混合しないように注意してください。
  4. ブレーキなしのスイングバケットローターで20°Cで20分間、810 x g で遠心分離機。
  5. 単核球細胞層(リンパ球、単球、および血小板)を相間において邪魔されずに残したまま上層を吸引する。
  6. 単核球細胞層を新しい50mL円錐管に慎重に移す。
  7. チューブにPBSを充填し、混合し、遠心分離機を300 x g で20°Cで10分間使用します(この段階以降はブレーキを使用できます)。
  8. 上澄み液を慎重に完全に取り除きます。細胞ペレットを50mLのPBSに再懸濁し、300 x g で20°Cで10分間遠心分離する。 上清を慎重に完全に取り除きます。
  9. 血小板を除去するために、細胞ペレットを50mLのPBSに再懸濁し、200 x g で20°Cで10分間遠心分離する。 上清を慎重に完全に取り除きます。
  10. 再懸濁細胞を細胞培養フラスコに移し、OC前駆細胞の増殖を行う。

3. OC前駆細胞の拡大

  1. 20 ng/mL M-CSF を含む完全な α-MEM (FBS 10% FBS、1% Pen/Strep、1% アムホテリシン B) で PBMC を再懸濁します。PBMCを2.5 x 105セル/cm2の密度でシードする。通常、15〜20mLの淡血から単離された細胞は、1つの75cm2フラスコ(1.5〜2 x107細胞)に播種することができる。
  2. 付着した細胞が所望のコンフルエントに達するまで、3日ごとに20ng/mL M-CSFを含む新鮮な完全α-MEMを細胞に供給する。典型的な収量は、細胞が95%コンフルエントである場合、1.5-2 x106 細胞/フラスコである。通常、拡張期間は6日間続きます。
    注:前駆体の骨細胞形成能は、培養時間が長くなるにつれて低下する可能性があります。

4. CaPコーティングプレートにおける骨細胞形成の誘導

  1. 細胞接着を容易にするために、CaP コーティングプレートを 50 μL の FBS と共に 37 °C のインキュベーター内で 1 時間インキュベートします。
  2. OC前駆体を剥離するには、フラスコをPBSで2回洗浄し、死細胞または非接着細胞を除去した。75cm2フラスコあたり4mLのトリプシン(材料表)を30分間加える。
    1. 4 mL の完全α-MEM を加えて消化を止め、セルスクレーパーを使用して細胞を慎重に剥離し、細胞を 50 mL チューブに移します。
    2. ノイバウアーチャンバーまたは類似のものを用いて総細胞数を決定する。
  3. 350 x gで7分間遠心分離することにより細胞をペレット化する。ペレットを20 ng/mL M-CSF および 20 ng/mL RANKL を含む十分な完全な α-MEM に再懸濁して、1 x106 cells/mL の濃度を得る。
  4. CaPコーティングされた96ウェルプレートおよびピペットからFBS溶液を吸引し、1ウェルあたり200μLの細胞懸濁液(2 x105 細胞/ウェル)を吸引する。
  5. OC前駆体を所望の期間、または実験計画に関連する所望の試薬と共にインキュベートする。通常、多数の大型および多核OCが6日後および再吸収ピットが形成されているときに観察され得る。3 日ごとに 20 ng/mL M-CSF および 20 ng/mL RANKL を含む新鮮な完全 α-MEM 培地で細胞を供給します。
  6. インキュベーションの最後に、PBSで細胞を2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、再びPBSで洗浄する。
  7. 固定OCを蛍光染色に直接使用するか、4°Cで保存してください。

5. OCおよびCaPコーティングの蛍光染色

  1. 固定した細胞を透過処理バッファー(PBS中の0.1% Triton)と共に5分間インキュベートする。
  2. アクチンフィラメントをPBS中のAlexaFluor 546標識ファロイジン溶液100 μLで30分間染色し、染色溶液を吸引する。100 μLのヘキスト33342染色液(PBS中10 μg/mL)を10分間加え、核を染色する。DAPI を使用することもできます。
  3. PBS中の10μMカルセイン100μLでCaPコーティングを10分間染色する。PBSで3回洗って画像を撮ります。
  4. 蛍光イメージング後、同じプレートを用いて、フォン・コッサ染色により再吸収ピット面積を定量することができる。これを行うには、プレートを脱イオン水で2回洗ってください。

6. 全吸収ピット面積の定量化

  1. フォンコッサ染色でCaPコーティングを染色するには、ウェル底部のコーティングが茶色になるまで、ウェルあたり50μLの脱イオン水中で UV照射下で1時間インキュベートします。
  2. プレートをイオン交換水で3回洗い、明視野画像を撮影します。1.25倍の対物レンズなど、倍率の小さい対物レンズを使用すると、井戸全体を1つの画像に収めることができます。これにより、その後の画像解析が容易になります。井戸の全領域を捕捉するための代替方法を適用することができる。
  3. ImageJ でイメージファイルを開く: ファイル |オープン|画像|タイプ |8 ビット。[直線] を使用して、画像の右下隅にあるスケール ユニット を確認||の分析スケールを設定します。「既知の距離」ブランケットに長さを入力し、[ 長さの単位] に新しいスケール単位を入力して、[ グローバル] チェックボックスをオンにします。
  4. 分析する測定パラメータのリスト: 分析|測定値を設定します。「測定値を設定」ウィンドウで、「面積」および「しきい値に制限」ボックスにチェック・マークを付けます。
  5. ピットの面積を測定する: 画像||を調整するしきい値。「しきい値」ウィンドウで、「 暗い背景」 にチェック・ボックスをオンにして、「 自動」をクリックします。ピットの領域が赤に変わります。「しきい値」ウィンドウを閉じ、「 |の分析」を選択します。測定します。結果ファイルを保存する: ファイル|名前を付けて保存します。

7. OC数とサイズの定量化、および再吸収ピット面積の正規化

  1. 破骨細胞の蛍光画像をImageJで開き、スケール単位を確認します(ステップ6.3参照)。
  2. 分析する測定パラメータのリスト: 分析|測定値を設定します。「測定値の設定」ウィンドウで、「 面積 」ボックスにチェック・マークを付けます。
  3. ROI マネージャとポリゴン選択を使用した OC の概要: |の分析ツールの|ROI マネージャー。ツールセットのポリゴン選択をクリックし、1つのOC(アクチンリングと≥3つの核を持つセル)の輪郭を描き、ROIマネージャウィンドウで [t]を追加 ]をクリックします。すべてのOCが含まれるまでアウトラインを繰り返します。
  4. OC の数とサイズを測定: ROI マネージャーですべての項目を選択し、[ 測定] をクリックします。結果ファイルを保存する: ファイル|名前を付けて保存します (図3E)。
  5. 蛍光画像のピット面積を測定する。手順7.3で画像と相関する塗膜の蛍光画像を開き、スケール単位を確認します(手順6.3を参照)。
    1. 分析する測定パラメータをリストします(ステップ6.4を参照)。 画像|の選択|を調整するしきい値。「しきい値」ウィンドウで、すべてのボックスのチェックを外し、「 自動」をクリックします。ピットの領域が赤に変わります。「 しきい値」 ウィンドウを閉じ、「 |の分析」を選択します。測定します。結果ファイルを保存します。
  6. OC番号で正規化されたピット面積を計算します。

結果

細胞培養プレートの底部へのリン酸カルシウムコーティングを、3日間の事前石灰化工程と1日間の石灰化工程とを含む2つのコーティング工程で行った。 図1に示すように、96穴プレートの底部に均一に分布したリン酸カルシウムが得られた。このコーティングは、洗浄工程を行った後に底部に非常によく付着した。

ディスカッション

ここでは、PBMCsから インビトロで 誘導および拡張されたOCsを用いた破骨細胞再吸収アッセイのための簡単で信頼性の高い方法を説明する。使用されるCaPコーティング細胞培養プレートは、ラボで利用可能な材料を使用して簡単に調製および視覚化することができます。このプロトコールで採用された未選別PBMCに加えて、マウス単球細胞21 および骨髄マクロファージ?...

開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、中国奨学金評議会[CSC No. 201808440394]によって部分的に資金提供されました。W.C.はCSCから資金提供を受けた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110Silver nitrate
a-MEMGibco32561-029MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin BBiochrom03-028-1BAmphotericin B Solution
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50GCalcium chloride Dihydrate
CalceinSigma-AldrichC0875Calcein
FBSSigma-AldrichF7524fetal bovine serum
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
Fixation bufferBiolegend420801Paraformaldehyde
HClMerk1.09057.1000Hydrochloric acid
Hoechst 33342PromokinePK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25Recombinant Human M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6Magnesium chloride
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaClMerkS7653-250GSodium chloride
NaHCO3MerkK15322429Bicarbonate of Soda
PBSLonza17-512FDulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-StrepLonzaDE17-602EPenicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKLPeproTech310-01Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
TrisSigma-Aldrich93362Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE ExpressGibco12605010Recombinant cell-dissociation enzymes

参考文献

  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
  3. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  4. Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
  5. Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
  6. Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
  7. Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
  8. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
  9. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
  10. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  11. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  12. Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
  13. Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
  14. Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
  15. Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  16. Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
  17. Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
  18. Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
  19. Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
  20. Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
  21. Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
  22. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  23. Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
  24. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  25. Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
  26. Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).

Erratum


Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

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