二次アドヒアランス法によるラット骨からの単球-マクロファージ系譜細胞の単離

要約

ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。

要約

骨塩密度が低下すると、骨が骨折する可能性が高くなり、患者の生活の質に悪影響を及ぼします。骨の成長および発達は、主に骨芽細胞および破骨細胞によって調節される。破骨細胞は骨髄単球 - マクロファージ細胞(BMM)に由来することが広く受け入れられている。BMMおよび他の造血幹細胞は、骨髄腔内に位置する。したがって、異なる異種の細胞集団から単一の安定BMMを単離することは大きな課題である。ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。初代培養で24~48時間培養した付着細胞を回収した。フローサイトメトリー分析により、細胞の約37.94%がCD11b/c+(単球-マクロファージ表面抗原)であることが示された。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色およびウェスタンブロット分析は、BMMが インビトロで破骨細胞に分化できることを実証した。以上の知見は、二次接着細胞が破骨細胞分化研究に好適な細胞モデルと考えられることを示唆した。

概要

骨髄中に存在する単球・マクロファージ系譜細胞が血液単球や組織マクロファージに分化できることが報告されている^1,2。上記の細胞は、骨の成長と発達のバランスをとるために破骨細胞に分化することができ、インビボで破骨細胞を誘導する細胞モデルとして一般的に使用されている^3,4。骨髄は、骨髄間葉系幹細胞、骨髄単球 - マクロファージ細胞(BMM)、造血幹細胞、内皮細胞、および免疫細胞を含むがこれらに限定されない、いくつかの異なるタイプの細胞を含む特別な組織である。実際、いくつかの以前の研究は、長骨の骨髄腔から突出した付着細胞が骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞に分化する可能性を示唆した^5、6、^7、8。異なる均質な細胞集団を作製するために、異なる単離および培養方法が使用されてきたが、様々な異なる細胞型からBMMを単離および培養することには依然として大きな課題がある。

骨髄単核球マクロファージ(BMSC)を抽出するためにいくつかの方法が開発されている。しかしながら、これらの方法の大部分は、複雑な^{9、10、11である}。たとえば、密度勾配遠心分離には特殊なキットが必要であり、操作には時間がかかり面倒です。この方法は、大量の血液サンプルからのBMMの単離には適しているが、骨髄サンプル⁹、^12、13からはそうではない。さらに、コラゲナーゼ消化を使用して組織サンプルを抽出することは、複雑で時間のかかる手順です。この方法は、骨髄サンプルからのBMMの単離には推奨されない^14、15。さらに、流動分離は高度に精製された単球/マクロファージ集団をもたらす可能性がありますが、非常に大きなサンプルサイズと高い機器および機器要件が必要です^10,16。さらに、マイクロビーズ濃縮法は極めて高価であり、一般の実験室¹⁷では実現不可能である。

したがって、現在の研究では、骨髄からの単核球マクロファージの単離のために、便利で、速く、そして安価な方法が提案された。異なる時点で接着した骨髄細胞を用いて、二次接着法を用いてBMMを単離した。上記の方法で抽出されたBMMは、 インビトロで破骨細胞の形成を誘導することができ、したがってイン ビトロでの骨粗鬆症の将来の研究のための簡単で便利な細胞モデルを提供する。

プロトコル

本試験における全ての実験は、浙江省中国医科大学実験動物研究センターの動物実験ガイドライン(承認番号:IACUC-20181029-11)に従って実施した。

1. 細胞抽出

1. Sprague-Dawleyラット(SDラット、生後1〜10日、雄または雌)を_CO2 で満たされた安楽死ケージに、30%〜70%の容器容量/分のバランスのとれた速度で入れる。ラットが意識を失った後(20〜60分)、頸部脱臼によってラットを安楽死させ、痛みのない死を確実にする。
2. 消毒のためにラットを75%アルコールに10分間浸漬する。
3. はさみと鉗子でラットのすべての四肢を慎重に取り除き、ピペットを使用してPBSで吸引し、四肢に付着した血液を洗い流す。
4. 500mLのDMEMに5mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液を加え、よく混ぜる。50 mLの滅菌遠沈管を取り、5 mLのFBSおよび45 mLのDMEM培地を加え、十分に混合して、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を含む10%FBS DMEMを得た。上記の培養液2 mLを5 mLチューブに加える。
5. 四肢の骨を5mLチューブに移す。はさみを使用してチューブ内の四肢の骨を小片(1〜3mm)に切断し、ホモジネートを混合して骨髄細胞を培養液に再懸濁させる。組織断片がチューブの底に落ち着くまで5分間放置する。
6. 100 mLの10%FBS DMEMを100 mm培養皿に加え、上清を培養皿に移した。上清を吸引するときは、組織破片を培養皿に移さないでください。
7. 37°Cおよび5%_CO2で約24 時間インキュベートする。このインキュベーション時間の後、間葉系幹細胞の大部分は培養皿壁に接着し、ゆっくりと増殖するが、ほとんどのBMMは依然として培養培地中に懸濁される。
8. 100 mm培養皿の細胞懸濁液を新しい^{25 cm 2} フラスコに移し、37°Cおよび5%_CO2 でさらに24時間細胞を培養し続ける。古い培地を慎重に取り除き、BMMがフラスコ壁に付着した後、新鮮な培地と交換してください。
9. フラスコ内の細胞が80%〜90%コンフルエントに達したときの継代培養。
   注:全ての細胞を37°Cおよび5%_CO2で培養した。培養中、細胞形態は徐々に統一された。細胞は大きく、不規則な形をしており、放射状に成長し、複数の核が観察できるディスクの形でフラスコに付着していた。

2. 細胞のFACS染色

1. 市販のトリプシン1~2mLを37°Cで5%_CO2 で5分間使用してトリプシン消化し、二次付着細胞をカウントして最終細胞数100,000/サンプルを確保した(ノイバウアー血球計で細胞をカウント)。
2. 細胞を3つの群に分割する(500μLのPBSは100,000個の細胞を含む):(1)染色されていない細胞を含むブランク対照群;(2)前記アイソタイプ対照群;(3)実験群(CD11b/c染色)とした。
3. 一次抗体(ブランク対照群は抗体なし;アイソタイプ対照群は抗CD11アイソタイプ対照、0.6 μLの抗体/サンプル、1 μg/サンプル;実験群は抗CD11b/c、抗体/サンプル1 μL、1 μg/サンプル)を氷上で30分間インキュベートする。
4. 300-350 x g で5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を500 μLのPBSで再懸濁する。上記の手順を 1 回繰り返して、結合していない一次抗体が洗い流されるようにします。
5. 対応する二次抗体(ブランク対照群には抗体なし;アイソタイプ対照群および実験群にはヤギ抗ウサギIgG、0.25 μL抗体/サンプル、1:2,000)を氷上で暗所で30分間インキュベートする。
6. 300-350 x g で5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を500 μLのPBSで再懸濁する。上記の手順を 1 回繰り返して、結合していない第 2 抗体が洗い流されるようにします。
7. フローサイトメトリー(10,000細胞/サンプル)でCD11b/c陽性細胞を検出し、ソフトウェア(FlowJo 7.5など)でデータを分析します。
   注:CD11b/c+細胞の最終百分率を得るために、以下の式を使用した:実験群におけるCD11b / c +細胞の割合−アイソタイプ対照群におけるCD11 +細胞の割合。

3. ライト・ギムザ染色

1. ^35mm2細胞クライミングシート(1×¹⁰⁶細胞/ウェル)上に3回継代した付着性二次細胞を播種し、37°Cおよび5%_CO2で24時間培養する。
2. 培養液を捨て、PBSで3回洗浄する。
3. ライト・ギムザ色素溶液(0.5 mL~0.8 mL)を細胞クライミングシートに1分間加える。
4. 染料を蒸留水(0.5mL〜0.8mL)と綿棒で混合し、10分間静置する。
5. 色素溶液を蒸留水で洗浄し、次いで1〜3分間乾燥させる。顕微鏡下で観察する。

4. トラップ染色

1. ^35mm2細胞クライミングシート(1×¹⁰⁶細胞/ウェル)上に3回継代した付着性二次細胞を播種し、37°Cおよび5%_CO2で24時間培養する。
2. 古い培地を、核因子-κBリガンド(RANKL)の50ng/mL受容体活性化剤および30ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を添加した10%FBS DMEMまたは破骨細胞誘導培地と交換し、37°Cおよび5%_CO2 でさらに7日間培養する。
3. 製造元のプロトコールに従ってTRAP染色キットで細胞を染色し、顕微鏡下で観察する。
   注:TRAP陽性細胞は破骨細胞と定義され、これは光学顕微鏡下で紫色であった。TRAP陽性細胞の数は、ImageJソフトウェアを用いて測定した。

5. ウェスタンブロット

1. ^35mm2細胞クライミングシート(1×¹⁰⁶細胞/ウェル)に3回継代した付着性二次細胞を播種し、24時間培養する。
2. 古い培地を新鮮な10%FBS DMEMまたは破骨細胞誘導培地(50ng/mLのRANKLおよび30ng/mLのM-CSF)と交換し、37°Cおよび5%_CO2でさらに7日間培養する。
3. RIPA緩衝液で全細胞タンパク質を抽出し、10%SDS−PAGEにより分離し、ポリフッ化ビニリデン膜^18、19に転写する。
4. 5%脱脂粉乳(25mL)で2時間ブロックし、TBS-Tween 20(TBST)で3回、毎回10分間洗浄します。
5. 一次抗体を4°Cで一晩インキュベートし(抗βアクチン、抗TRAP、および抗カテプシンK;すべての一次抗体を1:1,000に希釈し、10mL希釈抗体/バンド)、TBSTで3回洗浄した。
6. 二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG、1:2,000希釈、10mL希釈抗体/バンド)を室温で2時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄する。現像液を用いてタンパク質バンドを可視化する。
   注:上記のタンパク質の発現レベルをβ-アクチンに正規化した。

結果

二次付着細胞集団は安定かつ均一であった。連続的な細胞増殖に伴い、細胞の大部分は不規則な形状でより大きくなり、放射状の接着円盤に成長した(図2C、D)。フローサイトメトリーは、単球-マクロファージ系譜細胞の表面上の分子マーカーであるCD11b/cを発現する細胞の割合が約37.94%であることを示した(図2A<...

ディスカッション

破骨細胞は、骨疾患の発生および発症に関与する最も重要な細胞型の1つであり、骨疾患研究の主要な目的の1つである²⁰。単球/マクロファージは破骨細胞に分化することができる。単核マクロファージ(RAW264.7細胞)は高価すぎて購入できず、培養中に活性化されやすいため、この細胞株を用いた 体外 分化実験を行うことは困難である。骨髄から単球/マクロファージを?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm2 cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Anti-cathepsin K	Abcam	ab19027	1:1,000
Anti-CD11 isotype control	Abcam	ab172730	1 μg/test,1.675 mg/Ml
Anti-CD11b/c	Absin	abs124232	1μg/test, 1 mg/mL
Anti-TRAP	Abcam	ab191406	1:1,000
Anti-β-actin	Beyotime	AF5003	1:1,000
Cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Cell culture dish	corning	430167
Cell culture flask	corning	430168
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C
Goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab150077	for IF, 1:2,000
goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab6721	for WB, 1:2,000
M-CSF	Pepro tech	400-28
PBS	Biosharp	BL302A
RANKL	Pepro tech	400-30
SD rat	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd		1-10 days old
SDS-PAGE gel preparation kit	Solarbio	P1200
TRAP/ALP Staining Kit	Wako	294-67001
Trypsin-EDTA solution	Biosharp	BL512A
Wright-Giemsa solution	Keygen Biotech	KGA225-1