スフィンゴシン1-リン酸受容体の構造とシグナル伝達経路を調べるパイプライン

要約

S1Pは、S1P受容体(S1PR)サブファミリーを介して多様な生理効果を発揮する。ここでは、S1PR の構造と機能を説明するためのパイプラインについて説明します。

要約

リゾリン脂質(LPL)は、スフィンゴシン1-リン酸(S1P)、リゾホスファチジン酸などを含む生理活性脂質である。細胞膜におけるスフィンゴ脂質の代謝産物であるS1Pは、スフィンゴシン1-リン酸受容体(S1PR)によって媒介されるシグナル伝達経路 を介して 様々な細胞生理学的応答を調節する最も特徴的なLPLの1つである。これは、S1P-S1PRsシグナル伝達系が、多発性硬化症(MS)、自己免疫障害、癌、炎症、さらにはCOVID-19を含む障害の顕著な潜在的な治療標的であることを示唆した。クラスAのGタンパク質共役型受容体(GPCR)ファミリーの小さなサブセットであるS1PRは、S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、およびS1PR5の5つのサブタイプで構成されています。しかし、詳細な構造情報の欠如は、S1PRを標的とする創薬を妨げる。ここでは、S1P-S1PRs複合体の構造を解明するためにクライオ電子顕微鏡法を適用し、細胞ベースの機能アッセイを用いて、活性化、選択的薬物認識、Gタンパク質結合のメカニズムを解明しました。他のリゾリン脂質受容体(LPLR)およびGPCRも、この戦略を用いて研究することができる。

概要

細胞膜におけるスフィンゴ脂質の代謝産物であるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、リンパ球輸送、血管発達、内皮完全性、および心拍数^1,2,3を含む様々な生物学的活性を含むユビキタスなリゾホスファチド性シグナル伝達分子である。S1Pは、5つのS1P受容体サブタイプ(S1PRs1〜5)を介して多様な生理学的効果を発揮する。S1PRは様々な組織に見られ、下流のGタンパク質に対して独特の嗜好を示す^4,5。S1PR1は主にGiタンパク質と結合し、その後cAMP産生を阻害する。S1PR2 および S1PR3 は Gi、Gq、および G12/13 と結合され、S1PR4 および S1PR5 は Gi および G12/13 を介して信号を伝送^します。

S1P-S1PRシグナル伝達は、自己免疫疾患⁷、炎症⁸、癌9、さらにはCOVID-19¹⁰を含む複数の疾....

プロトコル

1. S1PRs-Gタンパク質複合体の精製

1. ヒトS1PRs-Gタンパク質複合体を精製するには、C末端残基338~382を欠くS1PR1のcDNA、C末端に345~398で切り詰めた野生型S1PR3、S1PR5、および野生型Gi1をpFastBac1ベクターに、野生型Gβ1およびGγ2のcDNAをpFastBacdualベクターにクローニングする(材料表)。
   注:S1PRのすべての構成物には、ヘマググルチニン(HA)シグナル配列とそれに続くN末端のFlagエピトープタグとC末端の10倍のhisタグも含まれています。また、受容体の発現および精製を容易にするために、T4リゾチーム(T4L)を翻訳するための合成DNA配列(材料表)をS1PRのN末端に挿入した。
2. S1PR、Gi1、およびGβ1γ2をコードするバキュロウイルスの調製
   1. -80°Cで1.5 mLチューブに保存したDH5αコンピテント大 腸菌(大腸菌) 50 μLに組換えベクターを添加し、氷上で30分間インキュベートした。
   2. 細胞を42°Cで90秒間ヒートショックし、すぐに氷に移し、2分間冷やします。
   3. 300 μLのライジェニーブロス(LB)培地を添加した後、チューブを37°Cで3〜5時間振盪する。細胞のプレート100 μLをLB寒天プレートに、48時間暗所に保ち....

結果

S1PRs-Gi複合体のサンプルを凍結する前に、精製サンプルをサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で分離し、ゲルろ過クロマトグラフィーで分析する必要があります。 図2 は、S1PR3-Gi複合体を例に示している。均質なGPCR−Gタンパク質複合体のピーク画分は、通常、サイズ排除クロマトグラフィーの〜10.5mLに位置していた(図2A)。S1PR3-Gi複合体のSDSページ?.......

ディスカッション

このプロトコルは、クライオEMによってS1PRの構造を決定し、Gi媒介cAMP阻害アッセイによってS1PRの活性化効力を測定するための一次パイプラインを記述する。いくつかのステップは、実験の成功に不可欠です。

S1PRs-Gi複合体を精製するためには、ウイルスの質およびsf9細胞の健康状態にもっと注意を払うべきである。受容体の発現は、貧弱なsf9細胞において?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA	GIBCO	Cat# 25300054
0.22 µM filter	Thermo Fisher Scientific	Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88533
6-well plate	Corning	Cat# 43016
96-well plate	Corning	Cat# 3917
Aprotinin	Sigma-Aldrich	Cat# 9087-70-1
Apyrase	NEB	Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10362100	For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine	Sigma-Aldrich	Cat# B6506
CHO-K1	ATCC	N/A
CHS	Sigma-Aldrich	Cat# C6512
CryoSPARC	Punjani, A., et al.,2017	https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli	Thermo Fisher Scientific	Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt	Sigma- Aldrich	Cat# 50227
DMSO	Sigma- Aldrich	Cat# D2438
EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium	Expression Systems	Cat#  96-001
Excel	microsoft	N/A
F12 medium	Invitrogen	Cat# 11765
FBS	Cell Box	Cat# SAG-01U-02
Flag resin	Sigma- Aldrich	Cat# A4596
Forskolin	APExBIO	Cat# B1421
Gctf	Zhang, 2016	https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN	Anatrace	Cat# GDN101
Gel filtration column	GE healthcare	Cat# 28990944
Gen5 3.11	BIO-TEK	N/A
Gentamicin	Solarbio	Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit	Promega	Cat# E1291	Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid	Promega	Cat# E2301	Sensor plasmid
Grace’s medium	GIBCO	Cat# 11595030
GraphPad Prism 8	Graphpad	N/A
HBSS	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88284
HEPES	Sigma- Aldrich	Cat# H4034
jetPRIME Reagent	Polyplus Transfection	Cat# 114-15	transfection reagent
Janamycin	Solarbio	Cat# K1030
LB medium	Invitrogen	Cat# 12780052
Leupeptin	Sigma-Aldrich	Cat# L2884
LMNG	Anatrace	Cat# NG310
MotionCor2	(Zheng et al., 2017)	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab	Thermo Fisher Scientific	Cat# 1121822
PBS	Invitrogen	Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs	GenScript	N/A
pFastBac1-Gαi	GenScript	N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10	GenScript	N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2	GenScript	N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	Cat# K210003	For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit	NEB	Cat# E0554S	For the preparation of plasmids
Quantifoil	Quantifoil	Cat# 251448
RELION-3.1	(Zivanov et al., 2018)	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA	addgene	N/A
scFv16	Invitrogen	Cat# 703976
Sf9	Expression Systems	N/A
Siponimod	Selleck	Cat# S7179
sodium cholate	Sigma-Aldrich	Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader	BIO-TEK	N/A
Synthetic T4L DNA (sequence)	N/A	N/A	Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac
TCEP	Thermo Fisher Scientific	Cat# 77720
Tetracycline	Solarbio	Cat# T8180
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A