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要約

IL-9発現TおよびILC2細胞は、 N. brasiliensis 感染中に誘導されますが、その特性評価は、その低頻度および異なる動態のために、感染した腸ではほとんど見過ごされてきました。このプロトコルは、異なる標的臓器からのこれらの細胞の単離と、異なる感染段階でのフローサイトメトリー による それらの同一性の確認について説明しています。

要約

IL-9は、抗腫瘍免疫、アレルギー病理の誘導、および寄生虫の排除に重要な役割を果たす蠕虫感染に対する免疫応答を含む様々な過程に関連する多面的サイトカインである。 ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス 感染症のマウスモデルでは、IL-9は主に肺、小腸、排液リンパ節に見られるCD4+ Tリンパ球と自然リンパ球によって産生されます。IL-9の細胞内染色に伴う技術的な困難、および感染時に小腸から造血細胞を単離することの複雑さを考えると、このモデルの異なるリンパ組織および非リンパ組織におけるIL-9の発現を分析するための包括的で簡単なプロトコルが差し迫っています。ここで説明するプロトコルは、CD4+ T細胞と自然リンパ球細胞によって産生されるIL-9の動態を概説しています 肺と小腸、ブラ ジリエンシス菌の標的となる主な臓器、ならびに縦隔と腸間膜リンパ節で、感染全体を通して。さらに、細胞の種類と目的の臓器に応じて、感染に必要な幼虫の数を詳しく説明します。このプロトコルは、 N. brasiliensis 感染モデルで関心のある特定の細胞、臓器、および疾患段階に焦点を当てる機会を提供することにより、時間とリソースを節約するためのアッセイの標準化を支援することを目的としています。

概要

鉤虫は、主に発展途上国の熱帯地域で、世界中で約7億人に感染する腸内寄生虫です。ヒトで最も一般的な鉤虫寄生虫である 十二指腸下腺腫 と ネクターアメリカヌスによる高強度感染症は、貧血とタンパク質欠乏症を引き起こし、成長と精神発達の遅延を引き起こす可能性があります1。 N. americanus とげっ歯類の寄生虫 Nippostrongylus brasiliensis は、宿主にプロトタイプの2型免疫応答を誘導し、ライフサイクルの類似点を共有しています。したがって、 N.ブラジリエンシス によるマウスの感染は、ヒト鉤虫感染の最も一般的に使用されるモデルです。ステージ3(L3) N.ブラジリエンシス 感染性幼虫は、感染後最初の数時間で皮膚から肺に移動します。肺に入ると、L4になり、気管を上って飲み込み、胃を通過し、腸に到達して4〜5日以内に成人(L5)になります。腸内では、L5ワームが糞便中に排泄される卵を産み、寄生虫のライフサイクルを再開します2。

N. brasiliensisによって誘導される免疫応答は、好酸球増加症、好塩基球増加症、杯および肥満細胞の過形成、ならびにIgG1およびIgE産生の増加とともに、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、およびIL-13を含むいくつかのタイプ2サイトカインの増加によって特徴付けられる。N. brasiliensis感染時に誘発される免疫応答を特定および定義しようとする研究のほとんどは、このモデル3におけるIL-4またはIL-13の役割に集中しています。しかし、IL-9発現細胞の同定と特性評価、およびこのサイトカインの機能はほとんど見過ごされていましたが、Licona-Limónらは、N.ブラジリエンシスに対する免疫応答におけるIL-9の重要な役割を示す最初の研究を発表しました。レポーターマウスを用いて、この研究では、感染時にIL-9を発現する主要な細胞サブセットとして、T細胞(主にTヘルパー9)および2型自然リンパ系細胞(ILC2)について説明しました4。

蠕虫感染肺からの免疫細胞の単離と特性評価は実行可能であり、広く報告されています3,4。しかし、固有の組織リモデリングと粘液産生のために、感染した腸でそうすることは、Ferrer-Fontらの最近の発表まで技術的な課題であることが証明されました5。このグループは、ヘリグモソモイデスポリギラスに感染したマウス腸からの免疫サブセットの単一細胞懸濁液を単離および分析するためのプロトコルの概要を説明しました。それに基づいて、我々は現在、N. brasiliensis感染腸からのIL-9発現リンパ系細胞の単離およびサイトメトリー分析のためのプロトコルを標準化しました。さらに、感染中のさまざまな細胞源および解剖学的位置からのIL-9動態を確立しました。

この感染に関与する異なる細胞集団を特徴付けることは、寄生虫に対する免疫応答および宿主との相互作用をより広く理解するために不可欠です。この包括的なプロトコルは、目的の疾患段階で目的の臓器からIL-9産生細胞を分離および分析するための明確なルートを提供し、 ブラジリエンス菌 感染症および寄生虫感染全般におけるこれらの細胞の役割に関する知識の大幅な向上を可能にします。

プロトコル

ここに記載されているすべての動物実験は、メキシコ国立自治大学細胞生理学研究所の動物取り扱い内部委員会(CICUAL)によって承認されました。

メモ: プロトコル全体のフローチャートを 図1に示します。

1.マウスの飼育

  1. 8〜10週齢の雌または雄のマウス群を使用し、12時間の明暗サイクルで一定の温度と湿度の動物施設に収容し、水と食物に 自由 にアクセスできるようにします。
    注:このプロトコルは、前述のように、C57BL / 6バックグラウンドのIL-9レポーターマウス系統を使用します4;しかしながら、他のIL−9レポーター株は、6、7、8、ならびに細胞内IL−9染色を使用することができ、結果は変動した9であった。

2.マウスの感染

  1. 感染の1日前にマウスの背中を体の中央から尾の付け根近くまで剃ります。麻酔薬の使用は必須ではありません。
  2. 前述のように、各マウスに200匹の生存可能な第3段階のN.ブラジリエンシス幼虫(L3)を腰部に100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)10で接種するか、対照として100 μLのPBSを単独で注射します。感染後4日目、7日目、または10日目に動物を犠牲にします。

3.肺、小腸、縦隔、腸間膜リンパ節の分離

  1. 頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。マウスを背中に置き、70%エタノールをスプレーします。ハサミを使用して正中切開を行い、皮膚を開いて腹部と胸部を露出させます。
    注:イソフルランは代替の安楽死方法として使用できます12。二酸化炭素室は、CO2 が肺組織の損傷や出血を引き起こすため、推奨されません13。
  2. 縦隔リンパ節および肺の分離
    1. 胸骨を切開し、「V」字型にカットして肋骨と胸筋を取り除きます。胸腔が露出したら、心臓の下の食道の隣に縦隔リンパ節を配置します( 補足図1を参照)。
    2. 縦隔リンパ節を抽出し、12ウェル培養プレート内の1 mLのR-10培地(表1)に回収します。処理するまで光から保護された氷の上に保管してください。
      注:これらの実験で使用したレポーターマウスからの蛍光シグナルが減少しないように、サンプルを光から保護する必要があります。
    3. 肺を抽出し、マウス1匹あたり12ウェル培養プレートに1 mLのR-10培地で採取します。処理するまで光から保護された氷の上に保管してください。
  3. 腸間膜リンパ節鎖および小腸の分離
    1. 腹膜腔を露出させ、小腸を慎重に右に動かして、結腸に沿って腸間膜リンパ節(MLN)鎖を露出させます。
    2. 鉗子を使用して、MLNを取り外し、ペーパータオルでそっと転がし、脂肪を引き抜きます。
    3. MLNを12ウェル培養プレート内の1 mLのR-10培地に移します。処理するまで光から保護された氷の上に保管してください。
    4. 幽門括約筋のすぐ下と盲腸の上の小腸を切断します。鉗子の助けを借りて腸をゆっくりと引き出し、付着した腸間膜と脂肪組織を取り除きます。
    5. 小腸をペーパータオルの上に置き、PBSでたっぷりと湿らせます。ハサミで小腸からパイエル板を取り除きます。
      注意: 生存率を維持するために、残りの脂肪組織を取り除き、プロセス全体を通して小腸をPBSで湿らせてください。
    6. ハサミを使って小腸を縦方向に切り、開いた腸の上に鉗子をそっとスライドさせて糞便と粘液を取り除きます。
    7. 小腸を鉗子で保持し、氷上で5 mLのPBSで数回注意深く沈めて洗浄します。2回繰り返します。
    8. 小腸を短い断片(約5 mm)に切断し、2%FBSを含む10 mLのHBSS14 を含む50 mLの円錐管に収集します(表1)。直ちに上皮内および固有層細胞を単離し続ける。

4.小腸、肺、リンパ節からの単一細胞懸濁液の調製

注:小腸から単一細胞懸濁液を調製する場合、処理期間が長くなると細胞の生存率が大幅に低下するため、1人あたり最大6匹のマウスを処理することが非常に重要です。この方法は、 ヘリグモソモイデス・ポリギラス 感染マウスモデル5から適応した。

  1. 振とうインキュベーター、R-20培地、HBSS、およびHBSS-2 mM EDTA(表1)を37°Cで予熱します。
  2. サンプルあたり10 mLの小腸消化培地(表1)を調製します。
  3. ステップ3.3.8の腸片を手で激しく振る。
  4. 各サンプルをガラス漏斗上のナイロンメッシュ(約10 cm x 10 cm)でろ過します。メッシュ上に10 mLの予熱したHBSSを加えてサンプルを洗浄し、フロースルーを廃棄します。もう一度繰り返します。
    注:サンプルごとに新しいメッシュを使用し、手順全体で再利用します。
  5. 漏斗からメッシュを取り外し、10 mLの温かいHBSS-2 mM EDTAを含む50 mLのコニカルチューブでメッシュからサンプルを収集します(ステップ4.1)。200rpmで振とうしながら、37°Cで10分間インキュベートします。
  6. 最高速度(3,200 rpm)で10秒間ボルテックスし、ガラス漏斗上でメッシュでサンプルをろ過し、50 mLのコニカルチューブでフロースルーを回収します。
  7. 手順4.5と4.6を2回繰り返し、同じ50 mLコニカルチューブでフロースルーを回収します。上皮内細胞はこの30mL画分に位置する。残りの組織を保存します。
  8. 上皮内細胞からの単一細胞懸濁液調製
    1. ステップ4.7で回収した30 mLの細胞懸濁液を遠心分離し、室温(RT)で5分間450 x g で回収します。上澄み液を捨てる。
    2. 5 mLのPBSを加え、450 x g でRTで5分間遠心分離します。 上清を捨てます。
    3. 細胞ペレットを3 mLのRPMI 10%FBS-20 μg/mL DNaseに再懸濁します(表1)。細胞染色まで光から保護された氷上に保管してください。
  9. 固有層細胞からの単一細胞懸濁液調製
    1. ステップ4.7の残りの小腸組織を、漏斗のメッシュを通して10mL以上の温かいHBSSを注ぐことによって洗浄します。洗浄を繰り返します。10 mLの小腸消化培地を含む50 mLのコニカルチューブのメッシュから組織を収集します。
    2. 200 rpmで振とうしながら、37°Cで30分間インキュベートします。5分ごとに10秒間最高速度で渦を巻きます。
    3. 10 mLのFACS-EDTAバッファー(表1)を加えて消化反応を停止し、氷上に置きます。
    4. 血清学的ピペットを使用して100 μmセルストレーナーを通して各サンプルをろ過し、氷上に置かれた50 mLコニカルチューブで懸濁液を回収します。
    5. 600 x g で4°Cで6分間遠心分離します。
    6. 上澄み液を捨てる。細胞ペレットを5 mLのPBSで洗浄し、600 x g で4°Cで6分間遠心分離します。
    7. 上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLのRPMI 10%FBS-20 μg/mL DNaseに再懸濁します。細胞染色まで光から保護された氷上に保管してください。
  10. 肺からの単一細胞懸濁液の調製
    注:各肺と小腸は、細胞の生存率が低くなる処理時間の延長を避けるために、2人で並行して処理する必要があります。
    1. 処理したサンプルごとに4 mLの肺消化培地(表1)を準備します。
    2. ステップ3.2.3の肺を含むウェルからRPMI培地を取り除きます。細かいハサミで肺を細かく切ります。
    3. 肺片をスパチュラ付きの15mLコニカルチューブに移します。4 mLの肺消化培地を追加します(表1)。
    4. 250 rpmで振とうしながら、37°Cで30分間インキュベートします。終了したら、各サンプルが処理されるまで氷上に保ちます。
    5. 各サンプルを100 μmのセルストレーナーでろ過し、6ウェル培養プレートの単一ウェルに配置します。シリンジプランジャーで組織を解離します。
    6. 各サンプルを15 mLのコニカルチューブに回収し、4 mLのR-2培地を加えます(表1)。他のサンプルが処理されている間、氷上に保管してください。
    7. 600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞ペレットを1 mLのR-5培地に再懸濁します(表1)。
    8. 遠心分離しながら、造血細胞画分15、16を富化するために、サンプルあたり4mLの27.5%密度勾配溶液(表1)を調製する。単一細胞分離のためのこの戦略は、他の同様の密度勾配媒体17と比較して、より効率的で、費用効果が高く、毒性が低い。
    9. ステップ4.10.7の細胞懸濁液1 mLに4 mLの27.5%密度勾配溶液を加え、激しく振とうします。
    10. 混合懸濁液の上に1 mLのR-5培地(表1)をゆっくりと加え、2つの相を作ります。
    11. 1,500 x g でRTで20分間遠心分離し、低加速でブレーキをオフにします。2つの相の間に形成されたリングを観察します。
    12. 1 mLマイクロピペットで2つの相の間に形成されたリングを回収し、4 mLのR-2培地に再懸濁します。
    13. 450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。細胞ペレットを1mLのACK緩衝液(表1)に再懸濁し、RTで1分間インキュベートします。
    14. 4 mLのR-5培地を加え、450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞ペレットを1 mLのR-10培地に再懸濁します。フローサイトメトリーで染色するまで光から保護された氷上に保管してください。
  11. リンパ節からの単一細胞懸濁液調製
    1. ステップ3.2.2または3.3.3のリンパ節を6ウェル培養プレートのウェル内の2つのメッシュの間に置き、シリンジプランジャーで解離します。
    2. 細胞懸濁液を 1.5 mL コニカルチューブで回収し、450 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
    3. 上清を捨て、細胞ペレットを1 mLのR-10培地に再懸濁する。フローサイトメトリーで染色するまで光から保護された氷上に保管してください。
      注:塊が見える場合は、100 μmのセルストレーナーでサンプルをろ過します。

5. フローサイトメトリーのための細胞染色(図2および図3)

注:ステップ4.11.3のリンパ節細胞懸濁液を450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを500 μLのFACSバッファーに再懸濁します(表1)。

  1. ILC2の同定のための細胞染色(図3 および 補足図2)
    注:この染色手順は、IL-9発現ILC2細胞の同定に特異的です。
    1. ステップ4.10.14の肺サンプルあたり150 μL(約1.8 x 10 6細胞)、およびステップ4.11.3のリンパ節サンプルあたり50 μL(縦隔および腸間膜リンパ節サンプルの場合はそれぞれ約0.7 x 10 6および2.2 x 106細胞)を96ウェル円錐形底部培養プレートにプレートします。100 μLのFACSバッファーを加え、450 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
    2. 小腸サンプルあたり100 μL(上皮内および固有層サンプルの場合はそれぞれ約2.7 x 10 6および0.6 x 106細胞)をステップ4.8.3および4.9.7から96ウェル円錐形底部培養プレートにプレートします。150 μLのFACSバッファーを加え、450 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
    3. 上清を捨て、各細胞ペレットをFACS緩衝液で希釈した50 μLのビオチン化抗体カクテル(表2)に再懸濁した。光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。
      注:上皮内および固有層サンプルには、20 μg/mL DNaseを含むFACSバッファーを使用してください。
    4. 150 μLのFACSバッファーを加えます。450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    5. 上清を捨て、細胞ペレットを200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。再度遠心分離し、上清を廃棄する。
    6. 細胞ペレットを50 μLの抗体/染色カクテル(表2)に再懸濁し、光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。
    7. 150 μLのFACSバッファーを加えます。450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    8. 上清を捨て、細胞ペレットを200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。再度遠心分離し、上清を廃棄する。洗浄を繰り返し(ステップ5.1.7)、上清を廃棄します。
    9. 細胞ペレットを300 μLのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。
    10. 小腸および肺のサンプルについては、リンパ球、単一細胞、生細胞、造血細胞、CD90+系統細胞、ST2+細胞、およびIL-9+細胞(図3A、Bおよび補足図2A)のゲーティング戦略を使用します。リンパ節サンプルには、生細胞、単一細胞、CD90+系統細胞、ST2+細胞、およびIL-9+細胞というゲーティング戦略を使用します(補足図2B、C)。
  2. IL-9産生リンパ球の同定のための細胞染色(図2 および 補足図3)
    1. ステップ4.10.14から肺あたり800 μLのサンプルを1.5 mLチューブ(約14.6 x 106 細胞)に移します。450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。
    2. リンパ節サンプルの場合、ステップ4.11.3からの細胞懸濁液400 μL(縦隔リンパ節および腸間膜リンパ節サンプルの場合はそれぞれ約5.6 x 10 6および17.5 x 106細胞)を96ウェル円錐ボトムプレートに2段階でプレートします。
      1. まず200 μLを移し、450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
      2. さらに200 μLを対応するウェルに移します。450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    3. 細胞ペレットを50-400 μLの抗体/染色カクテル(表3)に再懸濁し、光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。
      注:肺サンプルは400 μL、縦隔リンパ節サンプルは50 μL、腸間膜リンパ節サンプルは100 μLの染色カクテルに再懸濁する必要があります。
    4. 縦隔リンパ節サンプルに150 μL、腸間膜リンパ節サンプルに100 μLのFACSバッファーを追加します。450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    5. ペレットをそれぞれ1 mLおよび200 μLのFACSバッファーに再懸濁することにより、肺およびリンパ節サンプルを洗浄します。450 xg で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨てて洗浄を繰り返します。
    6. 肺サンプルを600 μLのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。ゲーティング戦略を使用します:リンパ球、単一細胞、生細胞、造血細胞、CD4+TCRβ+細胞、およびIL-9+細胞(図2A)。
    7. リンパ節サンプルを300 μLのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。ゲーティング戦略を使用します:リンパ球、単一細胞、生細胞、CD4+ TCRβ+細胞、およびIL-9+細胞(図2B および 補足図3A)。

6. シングルセル懸濁液中の細胞の絶対数の決定

  1. 分離ステップ4.8.3、4.9.7、4.10.14、および4.11.3のサンプルをPBSで1:20の比率で希釈します(サンプル10 μL+ PBS190 μL)。
  2. ステップ6.1で希釈した各サンプル10 μLをトリパンブルー10 μLと混合します。10 μLを血球計算盤にロードし、各希釈を考慮して生細胞をカウントします。
  3. フローサイトメトリーで求めた生細胞(生残色素陰性細胞)由来の目的集団の割合に単離後の単一細胞懸濁液中の生細胞の総数を乗じ、この数を100で割ることにより、細胞の絶対数を求めます(補足図4、補足図5、および補足図6)。
    絶対数 = (フローサイトメトリーで測定した生細胞由来の関心集団の割合 x 単一細胞懸濁液中の生細胞の総数)/100

結果

マウスに200匹のL3ステージ のN.ブラジリエンシス 幼虫、または偽対照用のPBSを皮下注射しました。このプロトコルで使用される幼虫の数は、リンパ組織および肺の細胞を検出するために高負荷のワームが使用された以前の報告とは異なり、肺、リンパ組織、および小腸から生細胞を分離するために調整されました4。肺、縦隔リンパ節、腸間膜リンパ節、および小腸は...

ディスカッション

腸の寄生虫と宿主の相互作用と蠕虫感染に対する免疫応答を完全に理解するには、組織のリモデリングと線虫の排出の誘導に鍵となるさまざまな細胞集団とエフェクター分子の同定と分析が必要です。土壌伝染性蠕虫感染症は、世界中の発展途上国で大きな問題となっています。しかし、最近まで、この感染症の影響を受ける主な臓器である小腸に存在する希少細胞集団の分析を可能にする?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

著者は、ホセ・ルイス・ラモス・バルデラスの技術サポートに感謝したいと思います。この研究は、CONACYTからPLLへの以下の助成金(FORDECYT-PRONACE-303027)によってサポートされました。OM-PとEO-MはCONACYTからフェローシップを受けました(それぞれ736162と481437)。MCM-MはCONACYTからフェローシップを受けました(Estancias Posdoctorales por México 2022 (3))。

資料

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参考文献

  1. Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

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