胎児組織由来エンテロイドの上皮透過性の試験

要約

このプロトコルは、胎児の腸組織からの3次元腸モデルであるエンテロイドの確立を詳述しています。上皮バイオマーカーの免疫蛍光イメージングをモデルの特性評価に使用しました。細菌性エンドトキシンであるリポ多糖の頂端曝露は、マイクロインジェクション技術を用いて、蛍光デキストランの漏出によって測定される用量依存的に上皮透過性を誘導した。

要約

ヒト胎児組織由来エンテロイドは、早産児の腸管損傷を研究するための有望な in vitro モデルとして浮上しています。エンテロイドは極性を示し、頂端境界を有する内腔、タイトジャンクション、および成長培地に露出した基底外側外層からなる。腸管損傷の結果には、粘膜の炎症と透過性の増加が含まれます。脆弱な早産のヒト被験者における腸透過性の試験は、しばしば実行不可能である。したがって、早産児の腸管損傷を研究するには、 in vitro 胎児組織由来腸モデルが必要です。エンテロイドは、タイトジャンクションタンパク質によって調節される上皮透過性の変化を試験するために使用できます。エンテロイドでは、腸幹細胞はすべての上皮細胞型に分化し、マウス肉腫細胞から分泌される基底膜マトリックス上に立体構造を形成します。本稿では、胎児の腸組織からエンテロイドを樹立し、免疫蛍光イメージングで腸内タイトジャンクションタンパク質を特徴付け、上皮透過性をテストするために使用される方法について説明します。グラム陰性優性菌嚥下障害は腸管損傷の危険因子として知られていることから、グラム陰性菌が産生するエンドトキシンであるリポ多糖(LPS)を用いてエンテロイドの透過性を誘導した。フルオレセイン標識デキストランを腸管腔にマイクロインジェクションし、培地に漏出した連続デキストラン濃度を測定して、傍細胞透過性の変化を定量化しました。実験は、LPSへの頂端曝露が濃度依存的に上皮透過性を誘導することを示した。これらの知見は、グラム陰性優性嚥下障害が早産児の腸管損傷のメカニズムに寄与しているという仮説を支持している。

概要

早産児は頻繁かつ長期にわたる炎症にさらされるため、腸の損傷のリスクが高まり、長期的な障害や死亡につながります¹。この分野の研究は、脆弱な早産児で実験を行う能力が限られていることに挑戦しています。さらに、適切なモデルの欠如は、早期腸環境の包括的な研究を妨げています²。既存のin vitroおよびin vivoモデルは、早期のヒト腸内環境を包括的に表現することができませんでした。具体的には、単一の上皮胎児細胞株はタイトジャンクションを形成しない可能性があり、動物モデルはヒト早産児とは異なる炎症性および免疫学的応答を示します。腸管陰窩幹細胞の増殖と分化における主要な経路としてのWntシグナル伝達と新規Lgr5⁺組織幹細胞の発見により、エンテロイドやコロノイドなどの腸組織由来オルガノイドがin vitroモデルとして確立されました^3,4,5。この技術を用いて、腸の全組織または生検から開発された3次元(3D)腸内モデルを作成して利用し、腸内環境に対する上皮応答を研究することができます^6,7。

培養で増殖する典型的な腸細胞株とは対照的に、エンテロイドはタイトジャン^{クションタンパク質8}によって接続された内腔を有する極性を示す。これにより、成長培地中の基底外側境界への曝露、ならびに頂端境界を評価するための管腔マイクロインジェクションが可能になります。さらに、エンテロイドは、ヒト上皮と同様の遺伝的、生理学的、および免疫学的特徴を示す^9,10。胎児組織由来エンテロイドは、上皮機能に対する未熟児の役割の検査を可能にする。エンテロイドのユニークな特徴は、早産の腸内環境により近い可能性があります⁹。組織由来エンテロイドは、単層形態として、または固化した基底膜タンパク質混合物に埋め込まれた3D構造として、タイトジャンクションの完全性を試験するために使用できます。頂端曝露が望まれる場合、後者の形態にはマイクロインジェクション技術が必要である。エンテロイドモデルにおける上皮応答の測定には、RNAシーケンシングによる遺伝子発現、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)によるバイオマーカー、または高度なイメージング技術が含まれます。ここで紹介する手法は、蛍光測定で総透過性を測定するための別の実行可能なオプションを提供します。

早産児の腸管損傷には、腸内微生物群集の不均衡を含む多因子性病因があります。エンテロイドは、上皮機能を伴う壊死性腸炎などの早産腸疾患の特定の側面を研究するための優れたモデルを提供することができます¹¹。エンテロイドは、ヒト胎児腸と同様の特徴を示す¹⁰。エンテロイドをグラム陰性菌によって産生されるエンドトキシンであるリポ多糖(LPS)に基底外側曝露として培地中に曝露すると、炎症の増加と腸透過性につながる可能性のある遺伝子発現が誘導されます⁷。この研究は、LPSなどの細菌製品への頂端曝露後の総上皮透過性の変化を評価することを目的としています。この結果は、腸管損傷の病因に関与する微生物と上皮の相互作用に関する手掛かりとなる可能性がある。総透過性をテストするために設計された方法には、マイクロインジェクションのセットアップとスキルが必要です。

プロトコル

ヒト組織採取は、ワシントン大学治験審査委員会(研究ID:STUDY380およびCR ID:CR3603)によって承認され、先天性欠損症研究所によって実施されました。先天性欠損症研究所は、ユーニスケネディシュライバー国立小児保健人間発達研究所からのNIH賞番号5R24HD000836によってサポートされました。検体は同意した参加者から収集され、匿名化された状態で健康情報なしで送信されました。小腸検体は、氷冷したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に保存され、一晩受入検査室に郵送されました。

1. 試薬調製

注:試薬とカタログ番号のリストについては、 材料表 を参照してください。推奨容量は、特に明記されていない限り、6ウェルプレート用です。

1. 50 mgのBSA粉末を50 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に100 μg/mLの広域抗生物質プリモシンを溶解して0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製し、組織またはエンテロイドと接触するすべてのプラスチック製品およびチップをコーティングします。
   1. BSAでコーティングするには、ろ過されていないピペットチップを、チップを覆うのに十分なBSAを含む50 mLコニカルチューブに入れるか、ペトリ皿の表面を覆うために1〜2 mLのBSAを追加するか、使用前に室温で少なくとも20〜30分間、15 mLのコニカルチューブにBSAを充填します。
2. 50 mLのDPBSを100 μg/mLのプリモシンおよび50 μg/mLのゲンタマイシンと混合して、DPBS培地を調製します。この培地は、2.5 μg/mL アムホテリシンの有無にかかわらず調製してください。
3. 2 mLのオルガノイド増殖培地、100 μg/mLのプリモシン、10 μM Y27632、および2.5 μM CHIR99021を混合して、腸様増殖培地を調製します。毎日新鮮な培地を作り、37°Cの細胞培養インキュベーターで温めます。
   注:Y27632の希釈係数は1:250です。CHIR99021の場合、CHIRストック溶液を温かい培地で1:100に希釈し、次に腸内増殖培地で1:40に希釈して、1:4000に希釈します。
4. ストックの基底膜マトリックス10 μM Y27632および2.5 μM CHIR99021を添加して、基底膜マトリックスミックスを調製します。6ウェルプレートの1ウェルに対して、8 mg/mLのタンパク質濃度で合計285 μLの最終基底膜マトリックスミックスを作成します。
   注:基底膜マトリックスは、液体の形を保つために氷のように冷たくする必要があり、より暖かい温度で固化します。ストック基底膜マトリックスのタンパク質濃度は、次の式を使用して8 mg/mLの最終タンパク質濃度を作成するのに必要な量を決定します。
   ボリューム 1 ×濃度 1 = ボリューム 2 × 濃度 2
5. PBS中の32%ストックPFAを1:8に希釈して4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製し、室温で保存します。固定するエンテロイドの各ウェルに0.5 mLを作ります。
6. PBSに5%ヤギ血清と0.5%トリトンX-100を加えてブロッキングバッファーを調製します。ウェルあたり最初の抗体用に1 mL、ウェルあたり追加の抗体用に0.5 mLを準備します。
   注:二次抗体の宿主と同じ種の血清を使用してください
7. 一次抗体および二次抗体を調製し、各抗体について製造業者が推奨する濃度でブロッキングバッファーで希釈する。
8. PBS中の1 mg/mLストック溶液から1:200に希釈することにより、5 μg/mLのドミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を調製します。染色したエンテロイドのウェルあたり0.5 mLを作ります。
9. PBSで70%グリセロールを調製し、エンテロイドを顕微鏡スライドに取り付けるための0.5 mLを作ります。
10. PBS中の25 mg/mLストック溶液を1:5の比率で希釈することにより、5 mg/mLデキストラン-FITC(フルオレセイン-イソチオシアネート)を調製します。マイクロインジェクション用に20μLを作ります。
11. PBS中のLPS粉末を5 mg/mLストック溶液に再構成することにより、リポ多糖(LPS)およびデキストランFITCを調製します。PBS中のLPSおよびデキストランのストック溶液を0.1 mg/mLおよび0.5 mg/mL LPSおよび5 mg/mLデキストランFITCに希釈します。マイクロインジェクション用に20μLを作ります。
12. エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)は、EGTA粉末を蒸留水に溶解し、塩酸(HCl)を用いてpHを約8に調整して0.2Mの原液を作り、調製する。1:100の希釈を行うことにより、培養培地中に2 mMの試験濃度を調製します。

2. 検体採取

1. サンプルを受け取ったら、検体収集から24時間以内に上皮細胞の分離とメッキを行います。

3. 全検体の基底膜マトリックスにおける腸管上皮細胞プレーティング

注:この手順は、ミシガン大学のトランスレーショナルティッシュモデリングラボラ^{トリー12,13,14}からの修正されたプロトコルに従います。高いWnt因子を有する増殖培地を使用すると、腸管樹立について一貫した結果が得られる。エンテロイドが確立されたら、Wnt係数の高い同じ培地を使用して、マイクロインジェクション用のエンテロイドを球形に駆動します。

1. 腸のセグメントを、アムホテリシンを含む氷冷DPBSを含む60 mm x 15 mmのペトリ皿に移し、氷上に20分間浸します。組織が浸っている間に、小腸の領域(十二指腸、空腸、または回腸)を特定し、鉗子とはさみで結合組織と血管を取り除きます。上皮を破壊することなく、23〜25 Gの小さな針と3 mLのシリンジを使用して、必要に応じて内腔の内容物を洗い流します。
2. メスを使用して腸のセグメントを3〜5 mmの小片に切断し、氷上に0.5〜1 mLのオルガノイド増殖培地を含む35 mm x 15 mmのペトリ皿に1〜2個(6ウェルプレートの1ウェルにメッキ用)を入れます。
3. 解剖マイクロハサミと鉗子を使用して、腸管を縦方向に切断します。鉗子の先端を使用して、10倍の実体顕微鏡で筋膜から上皮細胞をこすり落とします。筋膜を取り除き、皿を旋回させて細胞の塊を砕きます。
4. 20 μLのピペットカットチップを使用して、細胞と培地を5〜10 μL刻みで基底膜マトリックスミックスに移し、8 mg/mLのマトリックスタンパク質濃度で285 μLの溶液を作成します。200 μLのカットチップを使用して、氷上で基底膜マトリックス内の細胞を混合するために、ゆっくりと上下にピペットします。
5. 細胞基底膜マトリックスミックスの50 μLストリップを、温かいフォームブリック上に保持した予熱した6ウェルプレートの1ウェルに入れます。プレートを細胞培養インキュベーター内で37°C、5%_CO2 で10分間インキュベートし、基底膜マトリックスを重合および硬化させます。
6. 固化した基底膜マトリックスストリップのウェルに2 mLの腸内増殖培地を加え、細胞培養インキュベーター内に戻します。腸管の成長を促進するために毎日メディアを交換してください。腸管幹細胞の分化を毎日10倍倒立顕微鏡でチェックします。
7. 10〜14日後、腸内密度に応じて、エンテロイドを12ウェルまたは6ウェルプレートの1ウェルに通します。一日おきにメディアの交換を開始し、エンテロイドが繁栄し始めると、5〜7日ごとに1:2の比率で渡します。
   1. 継代中に基底膜マトリックス層でエンテロイドに分化しない細胞を除去します。必要に応じて、80%増殖培地、10%ウシ胎児血清(FBS)、および10%ジメチルスルホキシド(DMSO)で凍結することにより、低継代のエンテロイドの凍結ストックを作成します。

4. エンテロイドの免疫蛍光染色

注意: 固定と染色のプロセスには3日かかります。このプロトコルでは、修飾プロトコル¹⁵を使用して、核(DAPI)、上皮マーカー(ビリン、CDX2)、リゾチーム、ムチン、およびタイトジャンクションタンパク質(クローディン2、クローディン3、オクルージン、帯状疱疹-1)を固定および染色しました。蛍光画像は共焦点顕微鏡で撮影した。

1. 固定
   注:このプロセスは通常、腸管通過または凍結手順と同時に行われます。
   1. 腸管プレートを氷の上に置きます。成長培地を取り外し、冷たいDPBSで2回穏やかに洗浄します。
   2. 固定および染色するエンテロイドを特定します。200 μLのカットチップで慎重にピペッティングするか、1 μLの接種ループを使用して、12ウェルプレートに移します。異なる抗体による染色を行う場合は、エンテロイドを別々のウェルに入れます。
   3. 200 μLのチップでできるだけ多くの液体を、エンテロイドを乱すことなく除去します。0.5 mLの4%PFAを加え、室温で30分間インキュベートします。プレートを時々回転させて、基底膜マトリックスからのエンテロイドの剥離を容易にします。
   4. 基底膜マトリックスからのエンテロイドの剥離を決定するために、肉眼的に調べます。液体PFAを慎重に吸引し、エンテロイドを乱すことなく廃棄します。PBS 3xで洗浄して、PFAと残留基底膜マトリックスを除去します
      注:実体顕微鏡で液体を吸引すると、エンテロイドを回避するのに役立ちます。固定エンテロイドは、PBSに4°Cで最大1ヶ月間保存できます。
2. ブロッキング
   1. 残留PBSを200 μLピペットで、エンテロイドを乱すことなく慎重に除去します。0.5 mLのブロッキングバッファーを加え、室温で2時間インキュベートします。
   2. ブロッキングバッファーを200 μLピペットで除去して廃棄し、エンテロイドを破壊しないように注意してください。
3. 抗体染色
   1. ブロッキングバッファー中の一次抗体500 μLをエンテロイドを含む各ウェルに追加します。一次抗体およびリゾチームの場合、希釈係数は1:100、CDX2の場合、希釈係数は1:100、ビリンの場合、希釈係数は1:50です。4°Cで一晩インキュベートします。
   2. 翌日、抗体溶液を取り出し、PBSで3回洗浄します。洗浄ごとに10〜15分のインキュベーション時間を確保してください。
   3. 手順 4.3.1.-4.3.2 を繰り返します。希釈倍率が1:400の二次抗体用。
   4. 500 μLのDAPIを5 μg/mLのPBS溶液に加え、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、PBSで3回洗浄し、洗浄ごとに10〜15分のインキュベーション時間を確保します
4. マウンティング
   1. できるだけ多くのPBSを削除します。染色したエンテロイドを70%グリセロール1回洗浄する。
   2. 1 μLの接種ループまたはカットした200 μLのチップを使用してエンテロイドをプレートから持ち上げ、70%グリセロールを顕微鏡スライドガラスにマウントします。
   3. エンテロイドの3D構造を維持するには、下部スライドガラスとカバーガラスの間に0.5〜1mmのスペースを確保してください。薄いシリコンゴムシートまたはガラスカバースリップの切り欠きを使用して、スライドガラスとカバーガラスの間にスペースを作成します。エンテロイドを共焦点顕微鏡でイメージングできるようになりました。

5.エンテロイドのマイクロインジェクションの準備

注:マイクロインジェクションプロトコルは、リソースと設定に合わせてHillら¹⁶ から修正されたプロトコルです。一部の準備手順は、数日前に完了する必要があります。

1. マイクロインジェクションのセットアップ
   1. マイクロインジェクター装置を、実験の目的に応じて、バイオセーフティキャビネット内またはクリーンカウンターのいずれかに、次のようにセットアップします:観察用の実体顕微鏡、顕微鏡の隣の重いスタンドに取り付けられたX、Y、およびZ軸制御ノブを備えたマイクロマニピュレーター、マイクロマニピュレーターアームに取り付けられたマイクロピペットホルダー、マイクロピペットホルダーと三方活栓を備えたシリンジを接続するマイクロインジェクターチューブ、 次に、空気圧ポンプに接続し、ポンプに接続された壁の空気源に接続します(図1)。
   2. 実験使用前および使用後に、マイクロインジェクション装置を70%エタノールで消毒してください。マイクロピペットが目的の標本に到達できることを確認するために軸ノブを動かすなど、顕微鏡とマイクロマニピュレーターの位置を目的の物理的仕様に合わせてテストします。
2. マイクロピペットの調製
   メモ: これらの手順は事前に実行してください。
   1. マイクロピペットプーラーを使用して、ガラスキャピラリーチューブをマイクロピペットに引き込みます。
   2. 実体顕微鏡下で、マイクロピペットを水平マイクロピペットホルダー(図2)に置き、先端に焦点を合わせ、顕微鏡の接眼レンズを通して見ながらマイクロハサミを使用して先端を切り取ります。各実験について、同様のチップサイズで約10〜15個のマイクロピペットを準備します。
   3. 0.5〜1μLの液体を引き上げてチップサイズをテストし、ボリュームを空にするために必要なポンプの数を数えます。いくつかのチップサイズをテストして、実験に適したサイズを見つけます。適切なチップサイズは、ポンプあたり約10〜30nLの容量を排出します。
   4. カットガラスのマイクロピペットは、チップを傷つけずに清潔な箱またはチューブに保管してください。
      注:カット済みのマイクロピペットは市販されています。
3. 腸管製剤
   1. 主に大きくて球形のエンテロイドのプレートを氷の上に置きます。古い増殖培地を新しい培地と交換します。
   2. 基底膜マトリックスドットをセルリフターでプレートから静かに解離します。氷上でゲルドットを左右に旋回させて、エンテロイドを乱すことなく基底膜マトリックスを破壊します。
   3. 実体顕微鏡下でカットした20 μLピペットチップで約10〜15個の球状エンテロイドを選択し、基底膜マトリックスに加えて285 μLの8 mg/mLタンパク質濃度混合物を作ります。
   4. カットされた200μLのチップでピペットを軽く上下させ、エンテロイドを壊さずに混ぜます。35 mm x 10 mmの丸い細胞培養ペトリ皿または同様の寸法のペトリ皿の中央に50 μLのゲルドットを5つプレートします。
   5. 腸管ゲルドットを37°Cで10分間インキュベートして固化させます。次に、1 mLの新鮮な増殖培地を皿に加えます。安定化のために、そしてエンテロイドが0.5〜1μLの適切なサイズに達するまで、少なくとも2〜3日間インキュベートします。
      注:エンテロイドへのアクセスを容易にするために壁が低く、成長培地の量を減らすために直径が小さい皿を用意することが重要です。
4. デキストランFITCおよび試験材料のマイクロインジェクション
   1. 空気圧ポンプへの三方活栓をオフにします。マイクロピペットに注入された材料(この場合はLPSの有無にかかわらずデキストランFITCを充填します)。
   2. 透明なフィルムのストリップで覆われたペトリ皿を準備します。注入された材料の2〜4つの1μLドットをフィルム上に置きます。
   3. マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットの先端を液体のすぐ内側に駆動しますが、実体顕微鏡の視覚化下でフィルムの上にします。シリンジをそっと引っ張って、注入された材料をマイクロピペットに引き出します。
   4. マイクロピペットに2〜4μLの注入材料を満たし、シリンジを押してマイクロピペットの先端の空気を取り除きます。マイクロピペットの注入された材料カラムを検査して、エアポケットがないことを確認します。マイクロピペット内で引き出された注入された材料の量を記録します。
      注:液体はデキストランFITCにより緑がかった色で見えます。
   5. 空気圧ポンプに接続されている空気源をオンにすると、空気圧は約60psiになります。ポンプの電源を入れ、ポンプの持続時間を10〜15ミリ秒に設定します。シリンジの活栓を回して、ポンプからマイクロピペットまでのラインを開きます。
      注意: ポンプの持続時間が長いほど、ポンプごとにより多くの材料を放出できます。注入量の推定には、実験全体で同じポンプ持続時間と同様のチップサイズのマイクロピペットを使用することをお勧めします。
   6. 細胞培養インキュベーターからエンテロイドを取り出し、カバー付き容器内の温かいフォームレンガの上に皿を置き、マイクロインジェクション後の光への露出を制限します。
   7. エンテロイドの入ったペトリ皿を実体顕微鏡下に置き、マイクロマニピュレーターのノブを動かして、マイクロピペットの先端を水平面に対して約35°〜45°の角度で配置します(図3)。これには、事前にある程度の練習が必要です。
   8. 顕微鏡下で各ペトリ皿のエンテロイドを視覚化してマッピングし、皿ごとに約3〜5個の球状エンテロイドを注入する計画を立てます。
   9. マイクロピペットの先端が液面に近づいたら、顕微鏡の接眼レンズを覗き込み、先端を標的のエンテロイドに向かって進めます。
   10. 正確なゆっくりとした動きを使用してz軸ノブを進めて、マイクロピペットチップで腸管を穿刺します。先端が腸管表面を通過すると、腸壁は押し下げられて飛び出し、その時点で前進が止まるはずです。
   11. 片足でポンプペダルをタップし、腸管に緑がかったデキストラン-FITC溶液をわずかに膨張するまで満たします。ポンプ数を記録し、ポンプ容量とデキストラン濃度を算出する。
   12. マイクロインジェクション終了後、マイクロピペットの先端を引き出し、次のエンテロイドに移動します。練習すれば、プロセスはスムーズに進むことができます。
       1. チップが壊れた場合は、同様のチップサイズの別のマイクロピペットと交換してください。同じ露光グループ内のすべてのエンテロイドに十分な量の注入材料を引き出し、注入された材料間でマイクロピペットを交換して、相互汚染を回避します。
   13. 光にさらされないように、注射した腸管皿を覆いの下に置きます。
5. デキストランFITCの収集と測定
   1. マイクロインジェクション手順の後、直ちに培地を取り出します。新鮮な成長培地で2回洗浄して、残留デキストランFITCを取り除きます。新鮮な培地を追加し、マイクロインジェクション後の時間を時間0として記録します。
      注意: マイクロインジェクションプロセスを中断することなくこの手順を実行するには、2人目の人が必要になる場合があります。
   2. 不透明な0.5 mLマイクロフュージチューブに200 μLの培養液を採取し、マイクロインジェクション後1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、10時間、および12時間で、除去した培養培地を同量の新鮮な増殖培地と交換します。
      注:時間間隔は実験によって異なる場合があります。基底外側ばく露では、交換用媒体は同じ濃度の暴露を含むべきである。
   3. 採取した培地を4°Cで保存し、24時間以内にデキストラン濃度を測定する。残りの培地は、他の分析のために-80°Cで保管してください。培地収集の最後に、必要に応じてRNA抽出またはイメージングのためにエンテロイドを回収します。
   4. 蛍光マイクロプレートリーダーでデキストランFITC濃度を測定します。 図4に示すように、段階希釈を使用し、線形回帰直線をフィッティングすることにより、各プレートの標準曲線を作成します。
   5. デキストランを含まない新鮮な増殖培地に交換したデキストランを含む培養培地の除去体積の吸光度を次のように補正します:2 mLの培養培地から200 μLを除去すると、10容量%になります。
      2時間での補正吸光度=(1時間での吸光度x 10%)+2時間で測定された吸光度
      最初に補正された培地の吸光度は補正を必要としない。そして、検量線式を用いて補正した吸光度値からデキストラン濃度を算出する。
   6. 正規化のために、デキストラン濃度を各ペトリ皿のポンプの総数で割り、次に皿あたりのポンプの最大数を掛けます。
      注:すべての露光はトリプリケートで行われます(露光ごとに3つのペトリ皿、皿ごとに3〜5個のマイクロインジェクションされたエンテロイド)。三重の平均値は、スチューデントのt検定を使用して曝露間で比較されます。

結果

ミシガン大学トランスレーショナル組織モデリングラボ¹²の共同研究者から提供された修正プロトコルに従って、提供された回腸胎児組織から腸内細胞株を確立しました。腸内細胞株はマイ コプラズマ 感染陰性でした。エンテロイドは、ビリン、CDX2、リゾチーム、ムチン、クローディン、オクルージン、および小帯-閉塞1に対して陽性に染色され(図5)、小腸上皮起源が確認されました。エンテロイドには、4 kDaのデキストランFITCを5 mg/mLのPBS溶液でマイクロインジェクションしました(図6)。試験ばく露は、0.1 mg/mLおよび0.5 mg/mLの異なる濃度のLPSで、頂端ばく露のためにデキストランFITCと混合した。ポジティブコントロールとして、2 mM EGTAを使用し、デキストランのマイクロインジェクションの4時間後に培地に添加しました。EGTAは、タイトジャンクションの透過性を高めるカルシウムキレート剤です。陰性対照には、PBSのみでデキストランFITCをマイクロインジェクションしました。基底側方ばく露の場合、連続培養培地収集用の交換培地は、同じ濃度のばく露(すなわち、2mM EGTA)を有していた。結果は、陰性対照であるPBSと比較して、EGTA添加後の培地中のデキストラン濃度の明らかな増加を示しています。LPSの頂端ばく露は、濃度依存的にばく露後約8時間からデキストランの透過性を高めました(図7)。

図1:マイクロインジェクターのセットアップ。 セットアップには、実体顕微鏡、重いスチールベースプレートの磁気スタンドに取り付けられたマイクロマニピュレーター、三方活栓を備えたシリンジに接続されたマイクロピペットホルダー、および空気圧ポンプが含まれます。壁の空気供給は空気圧を提供し、ポンプによって調整されて一貫したポンプ容量を生成します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:横型マイクロピペットホルダー。 このプラスチックプラットフォームは、先端を切断するためにガラスキャピラリーチューブを引っ張った後にマイクロピペットを保持するように設計されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:マイクロピペットの位置決め。 35°〜45°の角度は、ペトリ皿の中央にあるエンテロイドを注入するのに理想的です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:デキストラン検量線。 曲線は、デキストランの10段階希釈の蛍光吸光度を二重に構築した。線形回帰直線をフィッティングして回帰式を生成しました。エラーバーはSEMです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:エンテロイドの蛍光バイオマーカー。 核染色のDAPIは青色です。以下のバイオマーカーが示されている:(A)ビリン、(B)CDX2、(C)リゾチーム、(D)ムチン、(E)クローディン、(F)閉塞、および(G)帯-閉塞1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:異なる段階のエンテロイド 。 (A)生後7〜10日の腸は小さく、壁が厚い。(B)大きなサイズ、内腔、思考壁を備えたマイクロインジェクションの準備ができているエンテロイド、および(C)マイクロインジェクションの2日後に腸内に配置された蛍光デキストラン-FITC。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:マイクロインジェクション後のデキストランFITCの透過性 。 (A)培地中の測定されたデキストランレベルは、PBSと比較してEGTA添加後に高かった。(B)マイクロインジェクションされた0.5 mg / mL LPSは、マイクロインジェクションされた0.1 mg / mL LPSが注入後8時間で開始したよりも、腸管腔から培地へのデキストランの漏出を大きく誘導しました。*p値<0.05、エラーバーはSEM、n = 3、有意性の計算にはスチューデントのt検定が使用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルでは、胎児の腸組織からのエンテロイドの樹立、および免疫蛍光染色および上皮透過性試験によるモデル特性評価について詳しく説明します。エンテロイドの透過性を、マイクロインジェクション技術および培地中の漏出デキストラン-FITC濃度の連続経時変化測定を用いて試験した。このプロトコルの新規性は、培養培地⁷における基底外側曝露と比較して、ヒト腸生理学により近い頂端曝露である。以前の研究では、Hillらは、連続画像化および経時的な蛍光強度の計算を利用した¹⁶。Aresらは、上皮モデルの基底外側膜をLPSに曝露し、細胞遺伝子^{発現パターン7}を比較しました。比較として、試験した試薬の頂端曝露を使用し、培地中の漏れたデキストランの連続濃度を測定することにより、総透過性の潜在的な変化を調べます。また、培地中の上皮細胞が産生するサイトカインや、細胞のmRNAを収集することで遺伝子発現を連続的に比較することができます。LPSは、透過性および炎症を誘発する能力があるため、動物およびin vitroモデルにおける腸管損傷の研究に一般的に使用されています^7,17。このモデルでLPSを試験したところ、上皮透過性は曝露濃度によって区別された。このプロトコルは、異なるマイクロインジェクション材料および結果測定を使用して他の疾患病理を研究するために拡張することができる。

このプロトコルの重要なステップには、胎児の腸組織からのエンテロイドの確立、腸管の特性評価、およびマイクロインジェクション技術が含まれます。この研究の完全性は、正確な細胞サンプリングに依存します。解剖学的ランドマークと血管を使用することは、小腸細胞の選択を確実にするのに役立ちます。胎児の腸幹細胞の強力な増殖と分化のために、他の上皮細胞から幹細胞を分離するための広範な手順は必要ありません。エンテロイドが樹立されたら、タンパク質や細胞マーカーを染色してモデルの特徴を確認することが重要です。このプロトコールでは、エンテロイドを、ビリンおよびCDX2を用いて腸細胞、リゾチームを用いてPaneth細胞、およびムチンを用いて杯細胞について染色し、小腸上皮内に見出される全ての細胞¹⁸、^19、20について染色した。1つの細胞型を示す従来の単一細胞株とは対照的に、エンテロイドは腸前駆幹細胞からすべての細胞型を確立します⁸。このプロトコルの染色部分は、目的の特定の細胞マーカーに対して変更することができる。このプロトコルの信頼性にとって重要なのは、マイクロインジェクション技術です。マイクロピペットチップの一貫性は、デキストランFITC溶液を使用してポンプあたりの容量を測定し、顕微鏡下でチップの直径を視覚化することで確認できます。汚染のリスクがあるため、同じマイクロピペットを複数の曝露に使用することはできません。さらに、エンテロイドの形状と成長は、それらの成長培地の内容によって影響を受ける可能性があります。カリフラワー型エンテロイドよりも球形のエンテロイドがマイクロインジェクションのより良いモデルを提供することがわかりました。球状形状は、媒体²¹におけるより大きなWnt係数によって誘導され得る。

このプロトコルは、特に時間に敏感な測定において、変動を減らすためのマイクロインジェクションにおける実行者のスキルに大きく依存します。同じ経験豊富なパフォーマーを一貫した技術で使用し、同じ細胞起源を使用して遺伝的変異を回避し、同じ継代でテストして成熟度バイアスを除去し、同様の細胞分化のために同じタイプの培地で細胞を増殖させることで、変動を最小限に抑えることができます。増殖培地の成分は、インビボ環境中ではなくインビトロで幹細胞の様々な分化を誘導し得る。例えば、インビボでは、リゾチームは、Paneth細胞が形成されて機能的になる妊娠発達の22〜24週まで発現しない²²。しかし、10週目の胎児腸から樹立したエンテロイドからリゾチームを検出することができました。この方法は、マイクロインジェクションに必要な高度な技術的スキルにより、一度にテストされる露光の数を制限することができます。マイクロインジェクション穿刺孔からのデキストラン漏れは、透過性の評価に影響を与える可能性があります。この影響を排除するために、マイクロインジェクションの直後のトリプル洗浄が、手順から残留デキストランを除去するために推奨されます。培地中のデキストラン濃度は、マイクロインジェクション後4〜6時間毎に測定する必要があります。.注射後2〜4時間以内にデキストラン濃度が大幅に上昇した実験は、最終分析から除外する必要があります。.

この方法にはいくつかの利点があります。トランスウェル上のエンテロイド由来の単分子膜と比較して、必要なコストとリソースが少なくて済みます。さらに、生きた細菌やウイルスなどの他の曝露に拡張して、腸内微生物と上皮の間の最初の相互作用を研究することができます。腸管の密閉された内腔は、増殖培地¹³の汚染なしにマイクロ注入された生細菌の安定した増殖を維持することができる。成長培地やインキュベーション酸素にさらされる単層とは異なり、密閉された内腔は狭く隔離された空間です。密閉された内腔は、増殖培地への連絡を許さず、生細菌の増殖とともに時間の経過とともに低くなる管腔酸素含有量を可能にします¹³。

胎児の腸組織の使用は、成人の腸幹細胞または動物モデルと比較して早産児の腸上皮をより正確に描写します⁷。さらに、エンテロイドの極性は、頂端および基底外側の両方の曝露および測定を可能にする²³。エンテロイドは、より低い酸素化濃度を有する密閉された内腔を形成し、これは腸²⁴の酸素化濃度をより厳密に模倣する。より技術的に進んだプロトコル¹⁶とは対照的に、グロスメディア測定の使用は、この技術のより大きなアクセス可能性を可能にする。実験は、上皮漏出がLPSへの頂端曝露によって誘発される可能性があり、濃度に依存することを示しました。この方法は、デキストランのリーク濃度の変化を調べるため、タイトジャンクションの全体的な機能変化を検出するのに役立ちます。メッセンジャーRNAの収集と露出したエンテロイドのシーケンシング、およびウェスタンブロット分析は、全体的な機能変化の分析を補完することができます。このモデルは、早産環境に非常によく似たシステムで腸上皮の完全性を研究しているため、早産の腸の損傷やその他の病気の病状をよりよく理解するために使用できます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin 250 uL/mL	Gibco	15-290-026
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal	Biogenex	MU392A-5UC
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032)	abcam	ab53032
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102)	abcam	ab15102
Anti-LYZ antibody produced in rabbit	Millipore Sigma	HPA066182-100UL
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032	Santa Cruz	sc-515032
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal	Biogenex	NUA42-5UC
Bovine Serum Albumin (BSA)	Millipore Sigma	A8806
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates	USA Scientific Inc	50-754-1395
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates	USA Scientific Inc	50-754-1560
Centrifuge with 15 mL tube buckets	Eppendorf	05-413-110
CHIR 99021	Tocris Bioscience	4423
Confocal microscope	Olympus FV1200	N/A	Or a similar microscope
Conical centrifuge tubes, 15 ml	Falcon	05-527-90
Cover glass for microscope slides	Fisher Scientific	12-544-DP
Disposable scalpels	Mopec	22-444-272
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL)	Fisher Scientific	62248
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X)	Fisher Scientific	AAJ67802K2
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Millipore Sigma	E8145-10G
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa	Millipore Sigma	46944
Fuorescence microplate reader	Agilent BioTek	Synergy HTX
Gentamicin 50 mg/mL	Gibco	15-750-060
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling)	A-M systems	626500
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	Fisher Scientific	A32742
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Fisher Scientific	A32731
Goat Serum	Fisher Scientific	16210064
ImageJ software	NIH	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stem Cell  Technologies	06010
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4	Millipore Sigma	L4391-1MG
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL	Corning	354234	protein concentration > 9 mg/mL preferably
Micro forceps	Fisher Scientific	13-820-078
Micro scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Micropipette puller	World Precision Instruments	SU-P1000	Or a similar equipment
Microscope slides	Fisher Scientific	22-034486
Occludin Polyclonal Antibody	Fisher Scientific	71-1500
Paraformaldehyde 32% aqueous solution	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	RT 15714
Petri Dishes, 35x10 mm	Fisher Scientific	150318
Petri Dishes, 60x15 mm	Fisher Scientific	12-565-94
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	10010031
PicoPump foot switch	World Precision Instruments	3260
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL	Fisher Scientific	21-402-47
Pipette tips, non-filtered, 20 uL	Fisher Scientific	21-402-41
Pipette tips, non-filtered, 200 uL	Fisher Scientific	21-236-54
Pneumatic PicoPump system	World Precision Instruments	SYS-PV820	or a similar picopump system
Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial	InvivoGen	ant-pm-1
Steel base plate	World Precision Instruments	5052
Stereo microscope	Zeiss stemi 350		Or a similar microscope
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks	Sonoco	03-531-53
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Wall air supply	N/A	N/A
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	1254
ZO-1 Polyclonal Antibody	Fisher Scientific	61-7300