エンフェイス マウス胚の平面形態形成解析のための心内膜クッション作製

要約

古典的には、マウス胚性弁原基の心内膜は、横切片、冠状切片、または矢状切片を用いて分析されてきた。弁形成領域の心内膜の 顔面2次元イメージングのための私たちの新しいアプローチは、弁発生中の心内膜の平面極性と細胞再配列分析を可能にします。

要約

哺乳類の心臓の発達の根底にある細胞および分子メカニズムの研究は、ヒトの先天性心疾患に対処するために不可欠です。原始心臓弁の発達には、局所誘導性心筋および心内膜信号に応答して、心臓の房室管(AVC)および流出路(OFT)領域からの心内膜細胞の上皮から間葉への移行(EMT)が含まれます。細胞が層間剥離し、心内膜と心筋の間に位置する細胞外マトリックス(心臓ゼリー)に浸潤すると、原始心内膜クッション(EC)が形成される。このプロセスは、心内膜が剥離された細胞によって残されたギャップを埋めなければならず、軸に沿って収束(狭く)または伸長(延長)するためにそれ自体を再編成しなければならないことを意味する。現在の研究では、このプロセスに関与する因子の細胞内局在の調節に平面細胞極性(PCP)経路が関与しています。古典的には、心臓弁発生の初期段階は、胚性心臓の断面またはコラーゲンゲル上で培養された ex vivoAVC またはOFT外植片で研究されてきました。これらのアプローチは、アピコ基底極性の分析を可能にするが、上皮の平面内の細胞挙動または移動する細胞の形態学的変化の分析は可能ではない。ここでは、弁形成領域の心内膜を細胞の平面場として可視化できる実験的手法を示す。この実験的アプローチは、弁の発達中のOFTおよびAVCの心内膜内のPCP、平面トポロジー、および細胞間コミュニケーションを研究する機会を提供します。心臓弁の形態形成に関与する新しい細胞メカニズムの解読は、心内膜クッションの欠陥に関連する先天性心疾患の理解に貢献する可能性があります。

概要

心臓は哺乳類の胚の最初の機能的な器官です。マウスの胚期(E)7.5日目頃、両側前心臓中胚葉細胞は腹側¹に心臓三日月を形成する。心臓三日月には、心筋と心内膜2の前駆細胞を含む前心臓細胞の²つの集団が含まれています。E8.0付近では、心臓前駆体が正中線で融合し、外側心筋と、心臓ゼリーと呼ばれる細胞外マトリックスによって分離された特殊な内皮である内心内膜の2つの上皮組織からなる原始的な心臓管を形成します。その後、E8.5で、心臓管は右向きにループします。ループ心臓には、流出路(OFT)、心室、房室管(AVC)など、特定の分子シグネチャを持つさまざまな解剖学的領域があります³。最初は細胞⁴の添加により心臓管はその流入側で拡張するが、E9.5では集中的な心臓増殖により、心腔のバルーニングと小柱網⁵の確立が生じる。弁形成は、AVC(将来の僧帽弁および三尖弁)およびOFT(将来の大動脈弁および肺弁)で行われます。

心内膜は弁の発達に重要な役割を果たします。心内膜細胞は、AVCおよびOFTで上皮間葉転換(EMT)を受けて、弁の発達の開始時に現れる構造である心内膜クッションを形成します。異なるシグナル伝達経路がこのプロセスを活性化します。マウスのE9.5では....

プロトコル

動物実験は、Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares(CNIC)動物実験倫理委員会およびマドリッド共同体によって承認されました(PROEX 155.7/20参照)。すべての動物の手順は、Real Decreto 201/63に基づいてスペインの法律で制定された、実験およびその他の科学的目的で使用される動物の保護に関するEU指令2007/63EUおよび勧告2007/526 / ECに準拠しています。

1. AVCおよび/またはOFTのオブテンション(Xiaoらから適応。²⁵)

1. 午後にメスの mTmG とオスの VE-カドヘリン-Cre-ERT/+の間に交配を設定します。
2. 翌朝、膣栓をチェックします。膣栓がある場合は、半日(E0.5)として数えます。関心のある実験に応じて、8日または9日を数えます。
3. 解剖の24時間前に、コーン油で希釈した5 mg / mL 4-OH-タモキシフェン50 μLで妊娠中の女性を経口投与します。.
   注:この用量は、GFP陽性クローンの存在によって明らかにされた限られた量のCRE媒介組換えを誘発します。適切な用量は、4-OH-タモキシフェンの新しいバッチごとに決定する必要がありま....

結果

このプロトコルを使用して生成されたデータは、AVCの心内膜の顔面イメージングを実行することが可能であることを示しています。最初の目的は、弁形成中の心内膜の細胞形状を細胞分解能で解析することでした(図1)。E9.5の個々の心内膜細胞を強調するために、2つのトランスジェニックマウス系統を使用しました。(1)ROSA mT/mGは、細胞膜で蛍光が検出される2色の.......

ディスカッション

心内膜は、胚性心臓管の内面全体を覆う上皮単層である。弁の発達中、将来の弁領域の心内膜細胞はEMTを受けるため、心内膜細胞は細胞骨格を形質転換および再配置して、心内膜から心臓ゼリーに向かって剥離します。私たちらは、心内膜が細胞の列として示されているE8.5およびE9.5胚性心臓の横断切片を分析することにより、マウス胚の弁発生に関する関連データを取得しました

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OH-Tamoxifen	Sigma Aldrich	H-6278
16 % Paraformaldheyde	Electron Microscopy Sciences	157-10	Dilute to 4% in water
anti-GFP	Aves Labs	FGP-1010
anti-VECadherin	BD Biosciences	555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	115-605-174
DAPI	AppliChem	A4099,0005
Slides Superfrost PLUS	VWR	631-0108	25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML
Tween 20	A4974,0500	AppliChem
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10