高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

要約

ここでは、単一分子全反射蛍光(smTIRF)顕微鏡を使用して、人工混雑した脂質膜上の単一分子の結合、移動度、および組み立てを実行および分析するためのプロトコルが提示されます。

要約

細胞膜は、生体分子反応とシグナル伝達のための非常に混雑した環境です。それでも、タンパク質と脂質との相互作用を調べる ほとんどのin vitro 実験では、裸の二重膜を使用しています。このようなシステムは、膜に埋め込まれたタンパク質や糖鎖によるクラウディングの複雑さを欠いており、細胞膜表面に遭遇する関連する体積効果を排除しています。また、脂質二重層が形成される負に帯電したガラス表面は、膜貫通生体分子の自由な拡散を妨げる。ここでは、混雑した脂質膜の模倣物として十分に特徴付けられたポリマー脂質膜を紹介します。このプロトコルは、クラウダーを支持脂質二重層(SLB)に組み込むための一般化されたアプローチとして、ポリエチレングリコール(PEG)結合脂質を利用します。まず、単一分子実験を行うための顕微鏡スライドとカバーガラスの洗浄手順を紹介します。次に、PEG-SLBの特性評価と、単一分子トラッキングとフォトブリーチングを使用した生体分子の結合、拡散、および組み立ての単一分子実験を実行する方法について説明します。最後に、このプロトコルは、単一分子光退色分析を使用して、混雑した脂質膜上の細菌の細孔形成毒素Cytolysin A(ClyA)のナノポアアセンブリを監視する方法を示しています。サンプルデータセットを含むMATLABコードも含まれており、粒子追跡、拡散挙動の抽出、サブユニットカウントなどの一般的な分析の一部を実行します。

概要

細胞膜は非常に混雑した複雑なシステム^です1。分子クラウディングは、タンパク質や脂質などの膜結合エンティティの拡散に大きな影響を与える可能性があります^2,3,4。同様に、受容体二量体化や膜複合体のオリゴマー化のような脂質膜上の二分子反応は、クラウディングの影響を受けます^5,6,7。クラウダーの性質、配置、および濃度は、いくつかの方法で膜結合、拡散性、およびタンパク質間相互作用を制御することができます^8,9。細胞膜上の膜クラウディングを制御し、埋め込まれた生体分子への影響を解釈することは困難であるため、研究者は代替のin vitroシステムを確立しようと試みてきました¹⁰。

人工混雑膜の一般的なアプローチは、二重膜にポリマー(ポリエチレングリコール、PEGなど)グラフト脂質をドープす....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1. 1分子実験用スライド・カバーガラスの洗浄

1. イメージングチャンバーを組み立てる前に、カバーガラスとスライドの両方を清掃して準備します。ダイヤモンドコーティングされたドリルビット(直径0.5〜1 mm)を備えたボール盤を使用して、スライドガラスに複数のペアの穴を開けます。アクリル板を使用する場合は、 図1に示すように、レーザーカッターを使用して正確な穴(0.5mm)を開けます。
   注:穴の各ペアは、個々のマイクロ流体チャンバーのフロー交換の入口と出口として機能します。アクリルスライドの穴の代表的なCADファイルは、 補足コーディングファイル1にあります。スライドガラスに開けられた穴は、通常、ドリルビットサイズの1.5倍から2倍大きくなります。
2. スライドとカバーガラスを洗剤で拭きます。脱イオン水でよくすすいでください。スライドとカバーガラスを水で別のスライド染色(コプリン)ジャーに入れ、バス超音波処理器で30分間超音波処理します。すべての超音波処理手順では、70 Wの電力設定を使用します。
3. 水を取り除き、スライドガラスとカバーガラスを含むコプリンジャーにアセトンをつばまで満たします(ジャーの容量に応じて50〜100 mL)。アクリルシートの場合、同じ量の予備混合された50%(v / v)アセトン溶液を使用すると、スライドが冷ややかになります。....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

PEG化メンブレンへのClyAタンパク質の結合のモニタリング
ステップ4.5の後、結合速度論は、膜表面に結合する粒子の数を経時的にプロットすることによって推定される(ビデオ1)。ClyAタンパク質が5mol%のPEG2000脂質を含む膜に結合すると、粒子密度が増加し、飽和に達します(図5)。結合粒子(シアンの円)への指数関数的減衰適合は、膜結合の時定?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

ここでは、膜埋め込み生体分子の混雑した環境を示す支持脂質二重層(SLB)の単一分子実験を示します。混雑した環境は排除された体積効果を生成し、生体分子反応の増強につながります1,2,39,40。ポリマーが主に二重層の外側の体積を占めるPEG脂質系の場合、この効果は大きなエクトドメインを持?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 ml Syringes	HMD Healthcare	Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin	Plastic syringe
Acetone	Finar Chemicals	10020LL025
Acrylic Sheet			2 mm thick
Acrylic Sheet	BigiMall		2 mm, Clear
Bath Sonicator	Branson	CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform	Sigma	528730	HPLC grade
Cholesterol	Avanti	700100
Coplin Jar	Duran Wheaton Kimble	S6016	8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips	VWR	631-1574	24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand	IDT		GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3)	Cytiva Life Sciences	PA23001
DiI	Invitrogen	D3911	Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1	Sigma Aldrich		GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T
DNA Connector Strand 2	Sigma Aldrich		CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand	Biomers		Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000	Avanti	880130	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape	3M	LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated)			0.5 - 1 mm
Drilling Machine	Dremel	220	Workstation
EMCCD	Andor	DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads	Invitrogen	F10720
Glass Slides	Blue Star		Micro Slides, PIC-1
Glass Vials	Sigma	854190
Hydrogen Peroxide	Lobachemie	00182	30% Solution, AR Grade
Labolene	Thermo-Fischer Scientific		Detergent
Laser 532 nm	Coherent	Sapphire
Laser Cutter	Universal Laser Systems	ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE	Avanti	810150	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol	Finar Chemicals	30932LL025
Microscope	Olympus	IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS)			1X
Plasma Cleaner	Harrick Plasma Inc	PDC-002
POPC	Avanti	850457	1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE1010	High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps	Sigma	27141
PTFE Tubing	Cole-Parmer	WW-06417-21	Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid	SD Fine Chemicals		98%, AR Grade
TIRF Objective	Olympus	UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator	Tarsons
Vortex Mixer	Tarsons