ImageJを用いた サルモネラ菌 の細胞内表現型自動解析

要約

サルモネラ菌は、サルモネラ菌特異的液胞と細胞質ゾル中の遊離の両方で腸上皮細胞内に侵入して複製します(過剰複製)。ここでは、ImageJを介した2つの相補的な画像分析によってサルモネラ菌の細胞内表現型を定量化し、単一細胞の分解能とスコアリングを達成するためのハイスループット蛍光顕微鏡ベースのプロトコルについて説明します。

要約

サルモネラ菌は、腸上皮に侵入し、サルモネラ菌特異的液胞内および細胞質ゾル中の遊離体の両方で腸細胞内で複製することができる腸内病原体である(細胞質過剰複製)。細胞内複製のこれらの異なる表現型は、病因の異なる経路、すなわち、細胞質過剰複製は炎症性細胞死および腸管腔への押し出しを誘発し、液胞複製は経上皮浸透および全身拡散をもたらす。mCherryとGFPの発現差によって液胞と細胞質細菌の識別を可能にするpCHAR-Duo蛍光レポータープラスミドなど、侵入細胞内のサルモネラ菌の挙動を研究するための顕微鏡ツールを作成するために多大な努力が払われました。しかし、細胞内の表現型は手動でスコアリングされることが多く、解析を少数のサンプルや細胞に限定する時間のかかる手順です。これらの制限を克服するために、無料で入手できる画像解析ソフトウェアであるImageJを使用して、2つの補完的で自動化された画像解析が開発されました。ハイスループットプロトコルでは、96ウェルプレートを使用して、上皮細胞をpCHAR-Duoを運ぶサルモネラ菌に感染させました。イメージングは自動蛍光顕微鏡を用いて行った。次に、2つの画像解析方法を適用して、サルモネラ菌の細胞内挙動を異なる詳細レベルで測定しました。第1の方法は、全体的な細胞内細菌負荷および細胞質過剰複製の程度を測定する。高速で、多数の細胞やサンプルのスコアリングが可能なため、スクリーニング実験などのハイスループットアッセイに適しています。2番目の方法では、シングルセル分析を実行して、感染細胞の割合、サルモネラ菌の平均液胞負荷、および細胞質ゾル過剰複製率を決定し、上皮細胞内のサルモネラ菌の挙動に関する詳細を提供します。プロトコルは、サルモネラ菌と腸細胞相互作用の主要なステップのバッチ分析を自動的に実行するために特別に設計されたImageJスクリプトによって実行できます。

概要

サルモネラ 菌は、欧州連合で食品媒介性疾患の発生を引き起こす最も頻繁に報告されている細菌剤です¹。 サルモネラ 感染症の主な病理学的症状は腸炎であり、これは摂取後の腸内の病原体の行動とその結果としての局所炎症反応の結果です²。ただし、 サルモネラ菌 は腸外部位に播種し、特に免疫不全の個人で全身感染を引き起こす可能性があります。 サルモネラ 菌と腸上皮との間の相互作用のタイプは、感染の結果を調整します。腸管腔に入ると、 サルモネラ菌 は腸上皮細胞内に侵入して複製します。細胞内レベルでは、サルモ ネラ菌は 、 サルモネラ菌含有液胞(SCV)内の細胞質過剰複製と液胞内低速複製という2つの異なる複製表現型を示す可能性があります。細胞質増殖亢進は、炎症性宿主細胞死および腸内腔への サルモネラ 菌の押し出しを誘発する³;液胞複製は、経上皮浸透と全身広がりをもたらします⁴。したがって、浸潤および液胞対細胞質複製の程度は、感染の経過に影響を与える。

サルモネラ属は非常に多様であり、異なる宿主範囲と病気を引き起こす能力を持つ何千もの血清型を含みます。たとえば、S です。チフィムリウムは、複数の無関係な宿主に感染するため、ジェネラリスト血清型として定義され、ヒトサルモネラ症の主な原因の1つを表しています。別の言い方をすれば、S。ダービーは、ほとんどが豚から分離されているため、豚に適応した血清型と見なされますが、ヒト感染の原因となる血清型のトップ5にも報告されています¹。しかし、上皮細胞内の細菌の挙動に関する知識は、本質的にSとしていくつかの参照株の研究に限定されています。チフィムリウムSL1344は、サルモネラ病原性の広大な自然の多様性を表していません。サルモネラ菌のさまざまな株と上皮細胞との相互作用を特徴付けることは、それらの異なる病原性を理解するのに役立ちます。このため、多数の株の細胞内挙動を迅速かつ大部分自動化された方法で分析するために、ハイスループット蛍光顕微鏡ベースのプロトコルが開発されました。このプロトコルでは、上皮細胞の感染を96ウェルイメージングプレートで行い、自動蛍光顕微鏡を使用して画像取得を行いました。pCHAR-Duoプラスミドを使用して、上皮細胞内のサルモネラ菌の浸潤および複製表現型を蛍光顕微鏡で観察しました⁵。このプラスミドは、すべての形質転換細菌細胞によって構成的に発現される赤色蛍光レポーターmCherryをコードする遺伝子、および真核細胞の細胞質ゾルにのみ存在しSCVには存在しないグルコース-6-リン酸によって発現が活性化される緑色蛍光レポーターGFPをコードする遺伝子を持っています。したがって、プラスミドは、mCherryおよびGFPレポーターの発現差による液胞および細胞質細菌との間の識別を可能にする。

顕微鏡画像上の液胞および細胞質細菌は、通常、手動スコアリング⁶によって定量化されますが、これは分析を少数のサンプルに制限する時間のかかる方法です。そこで、自由に利用できる画像解析ソフトウェアであるImageJ⁷を用いた、領域解析とシングルセル解析の2つの補完的かつ自動化された画像解析が開発されました。エリア解析は、取得した各顕微鏡画像における上皮細胞、赤および緑の サルモネラ 菌が占める領域のデータを使用して、全体的な細胞内細菌負荷と細胞質過剰複製の程度を測定します。この方法は、低倍率で取得した画像に適用できます。そのため、少ない画像で多数の上皮細胞をスコアリングすることができ、取得時間を短縮することができます。シングルセル解析では、細胞セグメンテーションを使用して、感染細胞の割合、平均液胞負荷、および単一細胞分解能で細胞質過剰複製を受けている感染細胞の割合を決定します。

このプロトコルでは、画像解析のすべてのステップが手動で実行されるように詳細に説明されていますが、同じ分析は、特別に設計されたImageJスクリプトによって自動化できます。これらのスクリプトでは、バッチ分析を実行して複数の画像を自動的に分析し、メソッドの実行を高速化することもできます。

プロトコル

1. pCHAR-Duoレポータープラスミドを保有するサルモネラ 菌による上皮細胞の感染

注:マルチチャンネルピペットをお勧めします。

1. 使用直前に、黒い壁と平らなガラス底の96ウェルイメージングプレートにコラーゲンをコーティングします。
   1. 化学フードの下で氷酢酸(17.4 M)を滅菌脱塩水で希釈し、20 mM酢酸溶液を得た。無菌条件下では、孔径0.2μmのシリンジフィルターを通して溶液をろ過します。溶液を0〜4°Cのラックに5分間放置します。
   2. 3 mg/mL コラーゲンストックを予冷した 20 mM 酢酸溶液で 50 μg/mL に希釈します。10回反転させて混合し、ウェルあたり30 μLのコラーゲン溶液(5 μgのコラーゲン/ cm²)を分注し、コラーゲンのゲル化を避けるために溶液を0〜4°Cのラックに保ちます。
   3. ウェルの底部がコラーゲンで完全に覆われていることを確認してから、プレートを室温(RT)で1時間層流下に置きます。
   4. 溶液を静かに取り除き、30 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄します。マルチチャンネルの100 μLまたは50 μLピペットを使用して、コラーゲンの剥離を防ぎます。
2. INT407上皮細胞をコラーゲンコーティングイメージングプレートで培養し、感染の20〜24時間前に培養します。
   1. ペニシリン100 U/mLおよびストレプトマイシン100 μg/mL(Pen/Strep)を添加した10%のウシ胎児血清(FBS)を含む最小必須培地(以下、培養培地(CM))を含む25 cm² フラスコ内のINT407細胞を日常的に培養します。
   2. INT407フラスコを5 mLのPBSで2回洗浄し、次に1 mLのトリプシン-EDTA溶液で細胞を37°Cで3〜5分間、加湿した5%_CO2雰囲気で20〜24時間前に剥離します。細胞をカウントし、CM中に3 x 10⁵ 細胞/ mL懸濁液を調製します。
   3. 100 μLの細胞懸濁液/ウェルをコラーゲンコーティングイメージングプレートに分注し、100%コンフルエンスを得ます。細胞接着を促進するために、加湿した5%_CO2 雰囲気中で37°Cで1時間インキュベートします。次に、100μLのCMを添加し、加湿した5%_CO2 雰囲気中で37°Cで感染するまで20〜24時間インキュベートする(ステップ1.4)。
      注:細胞内細菌を画像化するために、 サルモネラ 菌株は、オリビア・スティール・モーティマー博士から提供されたpCHAR-Duoレポータープラスミドで形質転換されます。ここでテストされた株は、プロトコルでカバーされる表現型の多様性を表し、セクション4の画像分析を検証するために選択されました。本研究で使用した菌株の詳細については、代表的な結果を参照してください。
3. pCHAR-Duoレポータープラスミドを保有する サルモネラ 菌株の定常期培養液を調製します。
   1. 10 μLのピペットの先端で サルモネラ 菌グリセロールストックをサンプリングし、アンピシリン100 μg/mLを添加した1 mLのルリアベルターニブロス(10 gのトリプトン、5 gの酵母エキス、および10 gの塩化ナトリウム/リットル)に接種します。
   2. 感染前に接種材料を37°Cで20時間静置インキュベートし、~1 x 10⁹ コロニー形成単位(CFU)/mL⁸に相当する成長の定常期に到達します。
4. INT407上皮細胞に サルモネラ菌を感染させる。
   注:感染は三重に行われます。
   1. INT407細胞を200 μLのPBS/ウェルで穏やかに洗浄します。
   2. 細菌をCMで一晩培養して希釈することによりサル モネラ 種菌を調製し、感染多重度(MOI)として定義される上皮細胞あたりの所望のCFU数を取得します。ここではMOI 100を使用しました。
   3. 200 μL/ウェルを接種し、通気性のあるシーリングメンブレンでプレートを覆い、加湿した5%_CO2 雰囲気中で37°Cで1時間インキュベートします。接種は感染の時間ゼロと見なされます。
   4. 接種材料を取り出し、200 μLのPBS/ウェルで穏やかに洗浄してから、200 μLのCMとゲンタマイシン100 μg/mLを1ウェルあたり加えます。プレートを通気性のあるシーリングメンブレンで覆い、加湿した5%_CO2 雰囲気中で37°Cで1時間インキュベートします。
   5. ゲンタマイシン100 μg/mLでCMを取り除き、200 μLのPBS/ウェルで穏やかに洗浄します。ウェルあたり200 μLのCMとゲンタマイシン10 μg/mLを加え、プレートを通気性のあるシーリングメンブレンで覆い、加湿した5%_CO2 雰囲気中で37°Cで8時間インキュベートします。

2. サンプル固定と上皮細胞染色

注意: サンプルは直射日光から保護してください。容量は、96ウェルプレートのウェルについて示されています。異なる細胞培養プレートまたは支持体には、体積の最適化が必要です。

1. 感染後8時間でCMを除去し、200 μL/ウェルのPBSで3回穏やかに洗浄します。吸収紙のプレートを反転させてPBSを除去します。誤嚥は避けてください。
2. 感染した単分子膜を100 μL/ウェルのパラホルムアルデヒド(PFA)4%のPBSでRTで20分間固定し、PFA 4%を除去し、200 μL/ウェルのPBSで3回洗浄します。プレートは4°Cで最大16〜24時間保存できます。 次の手順に進みます。
3. 上皮細胞を染色する。
   注:DAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)DNA染色(ステップ2.3.1)は核のみを染色する領域分析に使用され、ハイコンテントスクリーニング(HCS)染色(ステップ2.3.2)は上皮細胞全体を染色する単一細胞分析に使用されます。他の細胞染色剤も使用できますが、画像の取得と分析の最適化が必要です。
   1. 面積分析:100 μL/ウェルのDAPI(PBS溶液300 nM溶液)を分注し、光から保護されたRTで5分間インキュベートします。
   2. シングルセル解析:100 μL/ウェルのトリトン0.1xをPBS中でRTで15分間透過処理し、PBSで3回洗浄し、PBSで1:2000に希釈した100 μL/ウェルのHCS染色剤を分注します。光から保護されたRTで30分間インキュベートします。
4. 染色液を除去し、200 μL/ウェルのPBSで3回洗浄します。50 μL/ウェルのPBSを追加して、自動画像取得を行います。

3. 自動蛍光顕微鏡による画像取得

注:ここでは、エリア分析用のステップ3.1.1の低倍率(10x/0.3 NA、1 μm/ピクセル対物レンズ)と、シングルセル分析用のステップ3.1.2の高倍率(40x/0.75 NA、0.255 μm/ピクセル対物レンズ)が取得プロトコルで使用されます。他の倍率も使用できますが、画像の取得と分析の最適化が必要です。利用可能な顕微鏡で許可されている場合は、タイルと呼ばれる連続したフィールドの「モザイク」であるタイル領域(TR)として画像を取得し、大きなサンプル領域を記録します。オートフォーカス手順中のサンプル露出を減らすために、タイルごとに1つずつ設定するのではなく、TRの中央にオートフォーカスを設定します。

1. 細胞染色チャンネル(HCS染色およびDAPI核染色の場合は青色チャンネル)でソフトウェアオートフォーカスを基準z位置として使用します。細胞染色チャンネル(465 nm、細胞または核)およびpCHAR-DuoレポーターチャンネルmCherry(610 nm、細胞内サルモネラ菌)およびGFP(509 nm、細胞質多複製サルモネラ菌)で画像を取得します。
   1. エリア分析:画像≥10⁴ セル/テクニカルレプリケート(つまり、テクニカルレプリケートに対応する4タイル/ウェルの少なくとも3つのTRが推奨されます)10倍の倍率で。
      注:液胞を含む細胞と細胞質ゾルの超複製サル モネラ菌 を含む細胞の両方を10倍の倍率で画像化するには、単一のz面で十分です。
   2. シングルセル解析:40倍の倍率で画像≥1,000細胞/テクニカルレプリケート(すなわち、テクニカルレプリケートに対応する16タイル/ウェルのTRを少なくとも2つ推奨)。液胞を含む細胞と細胞質ゾルの超複製 サルモネラ菌を含む細胞の両方を画像化するには、複数のz平面が必要です。最適なzスタックを定義する(8つのz平面を得るために0.55μm間隔で3.85μmのzスタックを40倍で細胞質過剰複製 サルモネラ菌 に感染したINT407細胞を画像化することが示されている)。各z平面は、以後n/8として識別され、nは1(下のz平面に対応)と8(上のz平面に対応)の間にあります。
2. 各集録の出力は、すべてのフィールド、チャンネル、Z プレーンの画像を含む Acquisition.czi という名前のファイルです。TR が取得された場合は、タイルを融合して、Stitching メソッドの入力として 1 つの Acquisition.czi ファイルを使用して、各 TR の全体像を取得します。

4. ImageJを用いた画像解析

注:ステップ4.1とステップ4.2は、上記の実験と取得のために特別に設計されています。他の実験設定では、分析の最適化が必要になる場合があります。単一の取得.cziファイルの分析について説明します。バッチ分析では、単一セル分析スクリプトと領域分析スクリプトを補足ファイル (補足ファイル 1 と補足ファイル 2) として見つけます。スクリプトおよび ImageJ コマンドで使用されるラベルは、以下のセクションで太字で示されています。

1. エリア解析
   1. ImageJ で Acquisition.czi ファイル (スクリプトでは AcquisitionTitle という名前のファイル) を開きます: File > Open > AcquisitionTitle.czi。すべてのチャンネルを表示するウィンドウが開きます。チャネルは、取得順序に応じてc:1-3/3として示されます。ここで、c:1/3は青色(DAPI)、c:2/3はmCherry(細胞内サルモネラ菌)、c:3/3はGFP(細胞質多複製サルモネラ菌)に対応する。
   2. ランダムノイズを減らして、手順4.1.6および4.1.7で面積測定用の画像を準備します。
      1. [画像] > [> [OK] の複製を使用して取得タイトル ウィンドウを複製し、取得タイトル 1 ウィンドウを取得します。
      2. ガウスぼかし>プロセス>フィルターを使用して、取得タイトル1にガウスぼかしを適用します。デフォルトのシグマ値を2のままにして、[OK]をクリックします。プロセススタックウィンドウが開き、[はい]をクリックしてすべてのチャネルを処理します。
      3. ガウス フィルター処理された AcquisitionTitle1 を元のファイル AcquisitionTitle by Process > Image Calculator から減算します。[AcquisitionTitle] を [Image1] として選択し、ドロップダウン リストで [Subtract] 操作を選択してから、AcquisitionTitle1 を Image2 として選択します。 OKをクリックします。プロセススタック? ウィンドウが開きます。[はい]をクリックして3つの画像(チャンネル)をすべて処理し、[取得タイトルの結果]ウィンドウを取得します。
   3. 画像>カラー>分割チャンネルを介してチャンネルを分割します。各チャンネル画像が個別のウィンドウに表示されるようになり、ImageJによって自動的にC-ResultsOfAcquisitionTitleという名前が付けられます。ここで、C1-ResultsOfAcquisitionTitleはDAPIに対応し、C2-ResultsOfAcquisitionTitleはmCherry(細胞内サルモネラ菌)、C3-ResultsOfAcquisitionTitleはGFP(細胞質溶解性高複製サルモネラ菌)に対応します。
   4. C1-ResultsOfAcquisitionTitle画像を処理して、上皮細胞核が占める面積を測定します。
      1. [プロセス] > [スムーズ ] に移動して、核領域内に穴として現れる核小体を均質化します。
      2. [画像] > [>しきい値の調整] を使用して背景を除外するには、C1-ResultsOfAcquisitionTitle 画像のしきい値を設定します。 [暗い背景] をオンにして、ドロップダウン リストで [赤] を選択します。三角形の自動しきい値を設定し、上部のスライダーを使用して、核が赤く表示され、背景が黒で表示される場合の最小しきい値を設定します(しきい値= 100、このプロトコルに適用されます)。
         注:手順4.1.4.2、4.1.7、4.2.3.6.1、および4.2.4.3で説明されている自動しきい値は、ユーザーが核/上皮細胞と細菌に最適なしきい値をそれぞれ手動で定義するためのガイドとして推奨されます。自動しきい値の値は、定義された手動しきい値によってスクリプト内でオーバーライドされます。定義された手動しきい値は、バッチ分析全体に適用されます。
   5. [測定を解析] > [測定値の設定: [しきい値に制限] をオンにして、測定値をしきい値ピクセルに制限して、目的の測定値を選択します。閾値ピクセルが占める総面積に対応するチェック領域(すなわち、C1-結果取得タイトルの核、C2-結果取得タイトルの細胞内サルモネラ、C3-結果取得タイトルの細胞質超複製サルモネラ)。[表示ラベル]をオンにすると、結果テーブルのすべての画像の取得タイトルとチャネルが記録されます。
   6. [ 分析] > [測定] を使用して、原子核が占める面積を測定します。測定値は、自動的に開く結果テーブルに記録されます。
   7. C2-ResultsOfAcquisitionTitleとC3-ResultsOfAcquisitionTitleを処理して、細胞内サルモネラ菌全体と細胞質ゾル高複製サルモネラ菌が占める面積をそれぞれ測定します。いくつかの変更を加えて、手順4.1.4-4.1.6に従ってください:手順4.1.4.1の平滑化ステップをスキップし、手順4.1.4.2の三角形の代わりに大津自動しきい値をガイドとして使用して、サルモネラ菌が赤く表示され、背景が黒く表示される場合の最小しきい値(上のスライダー)を設定します(しきい値= 200を推奨)。
   8. [ファイルに名前を付けて保存] > [すべてのファイル] を使用して結果テーブル>を保存します。
   9. スプレッドシートで結果テーブルを開き、解析された各 AcquisitionTitle ファイルの面積比を計算します。
      1. 感染率を計算する:細胞内サル モネラ菌 の総が占める面積(ここでは赤チャンネル、C2-)を上皮細胞核が占める面積(ここではDAPI、C1-)で割ります。
      2. 過剰複製率を計算する:細胞質ゾルの高複製サルモネラ菌が占める面積(緑チャネル、C3-)を、細胞内サルモネラ菌の総占有面積(赤チャネル、C2-)で割ります。
2. シングルセル解析
   1. ImageJ で Acquisition.czi ファイルを開き、スクリプトでは AcquisitionTitle と名付けられます: [ファイル] メニュー > > Acquisition.czi を開きます。 すべてのチャンネルとすべてのzプレーンの画像を表示するウィンドウが開きます。
   2. チャンネルを画像>色で分割>チャンネルを分割します。チャンネルは別のウィンドウに表示され、ImageJによって自動的にC-AcquisitionTitleという名前が付けられます。ここで、C1-AcquisitionTitleウィンドウは上皮細胞(青)、C2-AcquisitionTitleウィンドウは細胞内サルモネラ菌(mCherry)、C3-AcquisitionTitleウィンドウは細胞質多複製サルモネラチャネル(GFP)に対応しています。各C取得タイトルウィンドウには、取得したすべてのz平面が含まれます。
   3. プロセス C1-買収タイトル ウィンドウ, 上皮細胞に対応, 細胞をセグメント化します.
      1. セル セグメンテーションに使用する Z 平面画像を選択します。C1-AcquisitionTitleウィンドウを選択し、画像>複製を使用します:選択したz平面の番号を書き込み(つまり、z 1/8を選択するには1)、タイトルボックスにC1Zplaneと書き、スタックを複製チェックを外し、OKをクリックして選択したz平面画像のみを複製します。選択したZ平面画像を表示するC1Zplaneというウィンドウが開きます。
      2. 得られた C1Zplane 画像を処理して、画像のコントラストを高めます。 プロセス>コントラストを高める:飽和ピクセルを調整し(つまり、ここでは1%が使用されます)、 正規化をチェックします。次に、[ OK ]をクリックしてコントラスト強調手法を適用し、コントラスト正規化された C1Zplane 画像を取得します。
      3. コントラスト正規化されたC1Zplane画像を処理して、上皮細胞をセグメント化します。[プロセス] > [最大値の検索] を使用して FindMaxima メニューを開きます: まず、プレビュー ポイント選択にフラグを設定してノイズ トレランスを設定し、すべての上皮細胞に 1 つの最大値ポイントのみを帰属させます。エッジ最大値を除外するフラグ。出力タイプのセグメント化された粒子を選択し、[OK]をクリックして、マークされた最大値ごとに各セグメント化された粒子を示す新しいバイナリマスクのような画像であるC1ZplaneSegmentedを取得します。
         注: Find Maxima ImageJ アルゴリズムは、セルをセグメント化するために使用されます。極大点(ピクセル強度ピーク)が画像全体で検出され、細胞に対応する可能性があります。ノイズしきい値(ノイズ耐性)を設定し、最大値ポイントの周囲の連続した領域を解析して、最大値ポイントごとにセグメント化された各粒子、つまり各セルを定義するバイナリマスクのような画像を作成します。
      4. C1Zplaneセグメント化された画像を処理して、セグメント化されたセルのマスクを作成します。 「解析」>「パーティクルを解析」を使用:「 マスクを表示 して エッジで除外」オプションを選択します。マスクに含めるセグメント化されたパーティクルの領域範囲を調整し、[ サイズ ]パラメータに対応して、セルクラスターやセルフラクションなどの誤ってセグメント化されたオブジェクトを除外します。誤ってセグメント化されたオブジェクトの面積をスコアリングするには、ツールバーのワンドトレースツールを使用します:ワン ド でパーティクルを選択し、[ 分析]>[測定 ]を開いて、誤ったオブジェクトの面積を測定します。 サイズ 間隔(推奨範囲250〜1700ピクセル²)を設定し、[ OK ]をクリックして MaskofC1ZplaneSegmented バイナリマスクを取得します。
      5. デフォルトでは、 MaskOfC1ZplaneSegmented バイナリマスクには反転 LUT があります。 ツールバー> LUT を反転 LUT を使用します。
      6. MaskOfC1ZplaneSegmented バイナリマスクを処理して、セルセグメンテーションを修正します。
         1. ステップ4.2.3.2で得られたコントラスト正規化 C1Z平面 画像の閾値。 画像を使用して>しきい値を調整する>: 暗い背景をチェックします。 [既定の 自動しきい値] 設定を設定します。[赤]オプションを選択し、セルが完全に 赤 く表示され、背景が暗いままになるまで最小カットオフ値(上部のバー)を調整します(このプロトコルではしきい値= 8,000が適用されます)。次に、[ 適用 ]をクリックして、コントラスト正規化された C1Zplane 画像を、セルが白、背景が黒のバイナリ画像に変換します。
         2. MaskのC1Zプレーンセグメント化されたバイナリマスクのセルセグメンテーションを修正します。プロセス>画像計算機を使用:MaskOfC1ZplaneImage1としてセグメント化を選択し、ドロップダウンリストで操作とを選択してから、画像2としてしきい値のコントラスト正規化C1Z平面を選択します。OKをクリックします。出力画像は、ImageJによって自動的にC1Zプレーンセグメントのマスクの結果として名前が付けられます。
      7. セグメント化されたC1Zplaneのマスクの結果を処理して、すべての単一セグメントセルを関心領域(ROI)としてラベル付けします。 [解析]>[パーティクルを解析]を使用します。手順 4.2.3.4 のように [サイズ ] を調整し、[ 何も表示しない] オプションを選択します。[マネージャに追加]をオンにすると、すべてのパーティクル(セグメント化されたセル)がROI マネージャ ツールに追加されます。また、[ エッジで除外] をオンにします。 OKをクリックします。ROI マネージャーメニューには、ROI として定義されたすべてのパーティクル(セグメント化されたセル)のリストが表示され、それぞれのy座標とx座標で一意にラベル付けされます。
      8. ROIデータを ROIセル取得タイトル として保存し.zip ROIマネージャーメニューから [ 詳細]>[保存]をクリックします。 ROI-cells-AcquisitionTitle.zipは、 シングルセル解析のためにステップ4.2.4.6で開かれます。
   4. プロセス C2-買収タイトル 細胞内に対応するウィンドウ(ここでは赤チャンネル) Salmonellae、感染細胞数および細胞内液胞負荷を測定する。
      1. 赤チャンネル(C2-)から緑チャンネル(C3-)を差し引いて、細胞質多複製サルモネラ菌の焦点が合っていないピクセルを削除します。
         1. プロセス>画像計算機を使用します。[C2 - 画像 1 として取得タイトル] を選択し、ドロップダウン リストで [減算] 操作を選択してから、[C3 - 画像 2 として取得タイトル] を選択します。[新しいウィンドウの作成]をオンにして、[OK]をクリックします。
         2. プロセススタックで [はい ]をクリックして、zスタック全体に減算を適用します か? 窓。出力ウィンドウには、スクリプト内の ResultsOfC2AcquisitionTitle という名前が付けられます。
      2. 処理 結果のC2取得ランダム ノイズを低減するタイトル。
         1. [画像]メニューをクリックして[複製]ウィンドウ>[結果のC2取得]ウィンドウを複製します。[スタックの複製] をオンにして [OK] をクリックし、[C2 取得タイトル 1 の結果] ウィンドウを取得します。
         2. [ガウスぼかし] の [プロセス > フィルター] > [結果 OfC2AcquisitionTitle1] ウィンドウにガウスぼかしを適用します。シグマ値を2のままにするか、カスタマイズします(つまり、ここではシグマ:4が使用されました)。[OK]をクリックし、[プロセススタック]ウィンドウで[はい]をクリックして、zスタック全体にガウスぼかしを適用します。
         3. プロセス>画像計算機をクリックして、ガウスフィルタリングされたC2取得タイトル1を結果C2取得タイトルに減算します。[結果C2取得タイトル] を [画像 1] として選択し、ドロップダウン リストで [減算操作] を選択してから、[結果オブC2 取得タイトル 1] を [画像 2] として選択します。OKをクリックします。プロセススタックの[はい]ウィンドウをクリックしてzスタック全体に減算を適用し、C2-AcquisitionTitleの結果の結果としてImageJによって自動的に名前が付けられたウィンドウを取得します。
      3. C2-AcquisitionTitleの結果を処理して、 サルモネラ菌 をバックグラウンドから分離します。 画像を使用して>しきい値を調整する>: 暗い背景 にチェックを入れ、 大津 の自動しきい値を設定します。 サルモネラ菌 が完全に赤く表示され、背景が暗くなるまで、最小カットオフ値(上のバー)を調整します(このプロトコルではしきい値= 100が適用されます)。 [適用 ]をクリックすると、[ バイナリに変換 ]ウィンドウが開きます: 黒の背景にチェックを入れ、[ OK]をクリックします。これで、完全な z スタックがバイナリ画像に変換されます。
      4. ステップ4.2.4.3:画像>スタック>セットスライスのC2-AcquisitionTitleバイナリウィンドウの結果の結果で、液胞サルモネラ菌フォーカス面に対応する中央のZ平面を選択し、選択したz平面の数を書きます(たとえば、ここではz:4/8が使用されます)。OKをクリックします。
      5. ROI(セル)ごとに記録する測定値を設定します。 [分析>測定値の設定]を使用する:各ROIの合計面積に対応する[面積]をオンにします。[ 面積分率 ]と[閾値まで制限]をチェックして、各ROIの 閾値 ピクセル(細胞内 サルモネラ菌)が占める面積分率のみを記録します。[ 表示ラベル ] をオンにすると、すべての ROI に、結果テーブルの画像タイトル、チャネル、Z 平面、および x-y 座標のラベルが付けられます。
      6. 細胞内サルモネラ菌の選択されたz平面を処理して、ラベル、面積、およびすべての単一セル(ROI)のサルモネラ菌が占める%面積を記録します:手順4.2.3.8で保存したROI-cells-AcquisitionTitle.zipファイルをファイル>で開きます。 ROIマネージャーメニューの[測定]をクリックして開きます。出力は、選択した測定値を報告するテーブルです。
      7. 結果ウィンドウで [ファイル] > [名前を付けて保存] を使用して結果テーブルを保存します。
      8. スプレッドシートで ResultTable を開く:ラベル 細胞内 サルモネラ菌 が占める面積と%面積は、x座標とy座標で一意に識別される輪郭のある細胞に対応する各ROIに対して示されます。
      9. サルモネラ菌に対応する閾値ピクセルによって占められる%面積>0を示すROIに対応する感染細胞の数を測定する(すなわち、ここでは%面積>0.2%が感染細胞を識別すると考えられる)。次に、全細胞に占める感染細胞の割合を計算します。
      10. すべての感染細胞について液胞サルモネラ菌が占める平均%面積を計算することにより、サルモネラ菌/細胞の液胞負荷を測定します。
   5. グリーンチャネル(C3-AcquisitionTitle)を処理して、細胞質ゾルの過剰複製サル モネラ菌を示す細胞の数を測定します。手順 4.2.4.2 から 4.2.4.9 に従いますが、いくつかの変更があります。
      1. 細胞質が過剰複製する サルモネラ菌を示す 細胞が単層から突き出ているため、上部のz平面(ここではz:7/8)で作業します。したがって、それらは、 サルモネラ菌を過剰複製しない細胞とは異なる平面に焦点を合わせています。
      2. サルモネラ菌が占める高い%面積を示す細胞(ROI)をスコアリングすることにより、細胞質過剰複製サルモネラ菌(緑色)を含む細胞の数を測定します(例えば、20%>%面積は、細胞質質過剰複製サルモネラ菌を含む細胞を同定すると考えられています)。次に、ステップ4.2.4.9でスコアリングされた感染細胞の合計に対する細胞質過剰複製サルモネラ菌を含む細胞の割合を計算します。

結果

サルモネラ菌株による上皮細胞の感染
このプロトコルは、上皮細胞内のサルモネラ菌の細胞浸潤と細胞質複製(図1A)と液胞負荷(図1B)を分析するために開発されました。プロトコルは、以下の3つのサルモネラ菌株Sを使用して検証されました。チフィムリウムSL1344参照株(S.Tm)、S.ダービーER1175野生型(S。ダービーwt)およびSの同質遺伝子変異体。sipA遺伝子を持たないダービーER1175(S.ダービーΔsipA)。S. Derby ER1175株はブタから分離され、サルモネラ菌分離株のIZSLERサーベイランスコレクションに属しています。株は、プロトコルによってカバーされる表現型の多様性を表すために選択された。特に、これらの株が選ばれたのは、上皮細胞内での挙動が浸潤または複製の点で異なることがすでに知られているためです⁹。したがって、それらは、プロトコルが細胞内サルモネラ菌表現型の違いを定量的に区別することを可能にするかどうかを試験するための貴重な対照であった。特に、S.TmとS。ダービーwtが含まれたのは、以前にS.TmはSよりも高い浸潤および細胞内複製効率を有する。ダービー重量⁹ながらS。Derby ΔsipAは、病原性エフェクターSipAが過剰複製の開始に重要な役割を果たすため、ハイパーレプリケーション障害株として追加されました^10,11。以前にSについて報告されました。細胞質複製は浸潤の4時間後に開始し、その後、細胞質集団は急速に過剰複製して8時間までに上皮細胞を満たす^11,12。一貫して、8時間長の感染は、Sにおいても細胞質増殖過剰複製表現型を観察および定量するのに適していた。ダービーwtとS。ダービーΔsipA。

エリア解析
ステップ4.1の面積分析は、サルモネラ菌による上皮細胞の全体的なコロニー形成(感染率)の測定と、ハイパーレプリケーション(ハイパーレプリケーション率)の測定を提供します。図2で説明したエリア解析ワークフローでは、ランダムノイズが低減され、チャンネルが分割されて個別に処理されます。面積測定からバックグラウンドを除外するために、各チャンネルにしきい値が設定されます。次に、閾値ピクセルが占める面積がチャネルごとに測定されます。領域分析の出力は、取得ファイルごとに、mCherryとともにGFP(緑チャネル)を発現する細胞内mCherry発現サルモネラ菌(赤チャネル)、および細胞質超複製サルモネラ菌が占める領域の拡張を報告する表です。感染率は、mCherry発現サルモネラ菌が占める面積を宿主細胞核が占める面積で割ることによって計算されます。試験した株の結果は、S.Tmは両Sと比較して有意に高い感染率を示す。予想通りのダービー株(図3A)。したがって、これらの結果は、サルモネラ株が上皮細胞にコロニーを形成する能力の違いを検出する際の領域分析の有効性を示しています。サルモネラ菌の過剰複製率は、GFP発現サルモネラ菌が占める面積を細胞内mCherry発現サルモネラ菌が占める面積で割ることによって測定される。 ハイパーレプリケーションの決定におけるSipAの役割と一致して、Sのハイパーレプリケーション率が大幅に低下しました。ダービーΔsipA株をSと比較して測定した。ダービー重量、(図3B)。S間にハイパーレプリケーションの違いは観察されませんでした。TmとS。ダービー重量。全体として、領域分析により、アッセイされた株間で異なるハイパーレプリケーションレベルが効果的に明らかになりました。

シングルセル解析
シングルセル解析により、 サルモネラ 菌の浸潤と液胞負荷と上皮細胞内の細胞質複製をシングルセル分解能で定量化できます。ステップ4.2で説明したように、各集録ファイルについて、青、赤、緑のチャンネルを個別に処理しました(図4)。具体的には、上皮細胞に対応する青色チャネルをステップ4.2.3で処理して、細胞セグメンテーションを得た。次に、セグメント化されたセルを関心領域 (ROI) マネージャーに追加して、y-x 座標で一意にラベル付けされたすべてのセグメント化されたセルに対応する ROI のリストを取得します。GFP発現する高複製 サルモネラ菌の焦点ずれ画素を除去するために、赤チャンネルの画素から緑チャンネルの画素を差し引いた。シングルセル解析レポートの出力表は、ROIごとに、mCherry構成レポーターのみまたはGFPサイトゾル応答性レポーターを表す サルモネラ菌 が占める面積とROIの面積の割合です。mCherryのみ発現サル モネラ菌 が占める細胞の面積の割合をステップ4.2.4で処理して、感染細胞の割合と平均液胞負荷を計算しました(図5A)。液胞負荷の分析は、 S.ダービー株は、 Sよりも有意に低い平均液胞負荷を生成します。Tm(図5B)。逆に、 Sでは感染細胞の割合のわずかな有意な減少しか観察されなかった。 Sと比較したダービー株。Tm(図5A)。GFP発現サル モネラ菌 が占める細胞の面積の割合をステップ4.2.5で処理して、高複製率を求めた。 S間に差は認められなかった。Tmと S。ダービーwt、 S。Derby ΔsipA は、領域分析の結果(図5C)およびハイパーレプリケーションの誘導におけるSipAの役割と一致して、ハイパーレプリケーションの有意な減少を示しました。

図1:サルモネラ菌細胞質複製亢進と液胞負荷。(A)サルモネラ菌の過剰複製と(B)高倍率(40倍)で取得した液胞負荷の代表的な画像を示します。パネルBは、高複製サルモネラ菌(z:7/8)を含む細胞の異なる焦点面を、非高複製サルモネラ菌(z:4/8)と比較して示しています。白いスケールバーは10μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:エリア分析のワークフロー。pCHAR-Duoプラスミド(MOI 100)を有するサルモネラ菌に8時間感染させたINT407細胞の代表的な低倍率(10倍)取得について、面積分析のワークフローを示します。まず、ランダムノイズを低減し、次にチャネルをC1、C2、C3に分割して個別に処理します。測定領域から背景を除外するために、各チャンネルにしきい値が設定されます。次に、C1における細胞核のみに対応する閾値画素が占める面積、C2における全ての細胞内サルモネラ菌、およびC3における細胞質サルモネラ菌が、各チャネルについて測定される。ここで解析した画像は、10倍の倍率で取得した4枚のタイルをステッチングで融合させた結果です。白いスケールバーは100μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:エリア解析の結果。エリア解析の結果を示す。(A)感染率は、全ての細胞内細菌を表すmCherry発現サルモネラ菌(C2チャネル)の占有面積を宿主細胞核の占有面積(C1チャネル)で割って算出する。(B)過剰複製率は、細胞質増殖亢進菌のみを表すGFP発現サルモネラ菌(C3チャネル)の占める面積を、細胞内mCherryを発現するサルモネラ菌の全てが占める面積で割って測定した。各ドットは反復を表します。分析は3つの生物学的複製で実施され、それぞれが3回でテストされました。黒い線は平均値を示す。有意性は両側t検定を使用して計算され、p値が報告されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:シングルセル解析のワークフロー。 pCHAR-Duoプラスミド(MOI 100)を有する サルモネラ菌 に8時間感染させたINT407細胞の代表的な高倍率取得(40倍)について、単一細胞解析のワークフローを示します。まず、チャネルはC1、C2、C3に分割され、独立して処理されます。上皮細胞に対応する青チャネル(C1)を処理して細胞セグメンテーションを取得し、次に各セグメント化された細胞をy-x座標で一意に標識された関心領域(ROI)として定義します。赤チャンネル(C2)は、緑チャンネル(C3)を差し引いて、焦点が合っていない細胞質多複製 サルモネラ菌を除去し、mCherryのみを発現するすべての液胞サル モネラ菌 を残し、ランダムノイズを低減し、測定からバックグラウンドを除外するように閾値を設定します。最後に、各ROIの液胞 サルモネラ菌 が占める面積を測定します。全細胞質GFP発現 サルモネラ菌に対応する緑色チャネル(C3)も同様に処理される。ここで分析した画像は、16枚のタイルをステッチで融合させた結果です。白いスケールバーは100μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:シングルセル解析の結果。 シングルセル解析の結果を示す。(a)感染細胞の割合は、細胞数をmCherryのみ発現するサル モネラ菌が占める面積の割合で>0.2細胞の総数で割ったものです。(B)平均液胞負荷は、感染細胞における サルモネラ菌 のみを発現するmCherryが占める平均面積パーセントを計算することによって得られた。(C)過剰複製率は、GFP発現 サルモネラ菌が占める面積の割合≥20%の細胞数を感染細胞の総数で割って算出した。3回でテストされた3〜4回の生物学的複製からのデータが報告されています。バーは測定の標準誤差を示します。有意性は両側 t検定を使用して計算され、 p 値が報告されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1: エリア分析スクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:シングルセル解析スクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

サルモネラ菌が腸上皮細胞にコロニーを形成する方法は、感染結果に影響を与えます。浸潤すると、細胞質過剰複製は腸の炎症を誘発しますが³、液胞複製は全身の広がりにつながる可能性があります⁴。サルモネラ菌株は、腸上皮細胞の内部に侵入および複製する能力が異なる可能性があります⁹。確かに、サルモネラ菌は2,500以上の血清型からなる非常に多様な属であり、病気を引き起こすさまざまな能力を持っています。さらに、サルモネラ菌は欧州連合で最も頻繁に報告されている食品媒介の発生の原因であり、人口の大きな広がりを示しています¹。したがって、サルモネラ菌の細胞内表現型を定量化するための信頼性の高いハイスループットメソッドの利用可能性は、多数のサルモネラ菌株間の病原性の違いを評価し、最終的にこの病原体の正確で株固有のリスク評価を可能にするために非常に重要です。

ここで説明するプロトコルは、上皮細胞内の サルモネラ 菌の挙動を迅速かつ自動化された方法で測定します。上皮細胞の感染は96ウェルイメージングマイクロプレートで行われ、画像取得には自動蛍光顕微鏡が使用されるため、プロトコルはハイスループットアプリケーションに適しています。このプロトコルは、pCHAR-Duoプラスミドを利用しており、2つの蛍光レポーターの発現差を通じて液胞と細胞質 サルモネラ菌 を区別することができます⁵。 サルモネラ 菌の細胞内表現型は、多くの場合、手動スコアリングによって分析されますが、これは時間のかかる手順であり、多数の菌株や菌株ごとの細胞培養の分析には適さず、オペレーターのエラーやオペレーター間のばらつきが発生しやすいです。これらの制限を克服するために、領域解析とシングルセル解析の2つの補完的で自動化された画像解析が開発されました。無料で入手できるソフトウェアであるImageJを使用して、2つの分析を開発しました。プロトコルの実行を高速化するために、オペレータの介入なしに複数の集録ファイルをバッチ解析するためのImageJスクリプトが補足ファイルとして提供されています。

領域分析は、上皮細胞の核と、GFPと一緒にmCherryまたはmCherryのいずれかを発現する サルモネラ菌 によって特異的に占める領域を測定することにより、上皮細胞の全体的なコロニー形成(感染率)と過剰複製レベル(複製亢進率)を数ステップで定量化するように設計されました。 領域解析は、空胞と高複製 サルモネラ菌 の両方が同じz平面にピントを合わせ、顕微鏡視野ごとに多数の上皮細胞を表示する低倍率で取得した画像に適用され、取得ファイルのサイズと数を削減します。領域分析は、多数のサンプルの自動化された高速かつ軽い分析を可能にするため、スクリーニング実験などのハイスループットアッセイに適しています。

シングルセル解析は、細胞セグメンテーションと細胞面積の測定、および液胞および細胞質ゾルの高複製サルモネラ菌が占める面積の割合を測定することにより、上皮細胞内のサルモネラ菌表現型を単一細胞分解能で定量化するように設計されました。ここでは、領域分析によって特徴付けられた上皮細胞の全体的なコロニー形成を、感染細胞の割合、平均液胞負荷、および高複製率の3つの定量的パラメーターに分解し、各表現型の全体的なコロニー形成への寄与を評価および定量化できるため、領域分析の結果を補完します。シングルセル解析によって提供される詳細度は、画像の取得と解析が遅くなるという犠牲を伴います。実際、シングルセル解像度を達成するために、画像取得は高倍率で行われます。これは、空胞と細胞質の両方のサルモネラ菌に焦点を合わせて観察するために複数のz平面が必要であり、多数の上皮細胞をスコアリングするにはサンプルごとに多数のフィールドを取得する必要があることを意味し、面積分析と比較して取得時間が長くなります。さらに、複数の大きな集録ファイルの解析は計算量が多いため、適切なワークステーションが必要でした(6コア、32 GB RAMワークステーションを使用)。したがって、シングルセル解析は、限られたスループット条件でのスタンドアロンとして、または領域分析と組み合わせて第2レベルの方法として使用して、上皮細胞内のサルモネラ菌表現型をより深く理解することができます。

2つの相補的な解析は、 Sを用いて検証した。Tm、 S.ダービーwt、および S。ダービーΔsipAは、上皮細胞内でのそれらの挙動が浸潤または複製の点で異なることが既に知られていたために選択された^9、10。面積および単一細胞分析の結果は、プロトコルが試験された株の特性に従って細胞内 サルモネラ 菌表現型の違いを定量的に区別することを可能にしたことを示している。さらに、これらの結果は、単一細胞解析により、面積解析を使用してスコアリングされた全体的なコロニー形成に対する各細胞内表現型(浸潤、液胞負荷、および細胞質複製)の寄与を定量化できることを示しています。

このプロトコルは、サルモネラ菌のさまざまな株のin vitro病原性を研究するためにここで適用されましたが、上皮細胞内の浸潤および/または複製に関与する遺伝子を特定するためのランダム変異体の研究などの他のアプリケーションを持つことができます。さらに、このプロトコルは、INT407細胞以外の細胞株内のサルモネラ菌の挙動を分析するために適合させることができます。また、他の細胞内微生物の細胞-病原体相互作用を研究するための同様の方法を開発するための出発点としても使用できます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well imaging microplate	Eppendorf	30741030	Cell culture and infection
Ampicillin	Sigma-Aldrich	59349	Bacteria culture
Axio observer inverted microscope	ZEISS		Automated fluorescence microscope
Axiocam 305 Mono	ZEISS		Microscope Camera
Breathable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z380059	Infection assay
Colibrì 5/7	ZEISS		Led light source
Collagen I rat tail	Life Technologies	A1048301	Collagen coating
DAPI	Invitrogen	D3571	Cell staining
Fetal bovine serum	Gibco	10099-141	Cell culture and infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G12664	Infection assay
Glacial acetic acid	Carlo Erba	401391	Collagen coating
HCS CellMask Blue	Invitrogen	H32720	Cell staining
ImageJ	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)		Image processing software
Minimum Essential Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	M5650-500ML	Cell culture and infection
Paraformaldehyde 4%	Invitrogen	FB002	Cell fixation
Potassium chloride	PanReac AppliChem	131494.1211	PBS preparation
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	60220	PBS preparation
Sodium Chloride	PanReac AppliChem	131659.1214	Bacteria culture and PBS preparation
Sodium phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	71640	PBS preparation
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap	Euroclone	ET7025	Cell culture
Triton X-100	Biorad	1610407	Cell staining
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	Cell culture and infection
Tryptone	Oxoid	LP0042B	Bacteria culture
Yeast extract	Biolife	4122202	Bacteria culture