インビトロおよびインビボでの鼻自己組織化ナノエマルジョン腫瘍ワクチンの調製、特性、毒性、および有効性評価

要約

ここでは、インビトロおよびインビボでの鼻自己組織化ナノエマルジョン腫瘍ワクチンの調製および評価のための詳細な方法を提示する。

要約

エピトープペプチドは、その安全性、高い特異性、および便利な製造のために、腫瘍ワクチンの分野で広く注目を集めています。特に、一部のMHC I制限エピトープは、腫瘍細胞を除去するための効果的な細胞傷害性Tリンパ球活性を誘導することができます。さらに、経鼻投与は、その利便性と患者のコンプライアンスの向上により、腫瘍ワクチンの効果的かつ安全な送達技術です。しかしながら、エピトープペプチドは、免疫原性が低く、送達効率に乏しいため、経鼻送達には不適当である。ナノエマルジョン(NE)は、抗原を負荷し、鼻粘膜表面に直接送達することができる熱力学的に安定したシステムである。Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV)は、ヒト呼吸上皮細胞によって発現されるインテグリン結合ペプチドであるラミニンのコアペンタペプチドです。本研究では、合成ペプチドIKVAV-OVA_{257-264(I-OVA} )を含む鼻腔内自己組織化エピトープペプチドNE腫瘍ワクチンを低エネルギー乳化法により調製した。IKVAVとOVA_257-264 の組み合わせは、鼻粘膜上皮細胞による抗原取り込みを増強することができる。ここでは、透過型電子顕微鏡(TEM)、原子間力顕微鏡(AFM)、動的光散乱(DLS)による物理化学的特性を研究するためのプロトコルを確立します。ムチンタンパク質の存在下での安定性;BEAS-2B細胞およびC57BL/6マウスの鼻および肺組織の細胞生存率を調べることによる毒性;共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)による細胞取り込み; 生体内の小動物を画像化することによってプロファイルを放出する。E.G7担癌モデルを用いたワクチンの保護および治療効果。このプロトコルは、新しいT細胞エピトープペプチド粘膜ワクチンの将来の開発のための技術的および理論的な手がかりを提供すると期待しています。

概要

最も重要な公衆衛生上の革新の1つとして、ワクチンは人間の病気の世界的な負担と戦う上で重要な役割を果たします¹。たとえば、現在、COVID-19疾患の120を超えるワクチン候補がテストされており、そのうちのいくつかは多くの国で承認されています²。最近の報告によると、がんワクチンは、がん患者の免疫系に抗原を体外異物として認識させるため、臨床がん治療の進歩を効果的に改善しました³。さらに、腫瘍細胞の内側または外側に位置する複数のT細胞エピトープを使用してペプチドワクチンを設計することができ、放射線療法および化学療法に関連する有意な毒性がないため、転移性癌の治療に利点が示されています^4,5。1990年代半ば以降、主に抗原ペプチドワクチンを用いた腫瘍治療の前臨床試験や臨床試験が行われてきましたが、^{がん患者に対して}十分な治療効果を示すワクチンは少ない6。さらに、ペプチドエピトープを用いたがんワクチンは、免疫原性が低く、送達効率が不十分であり、これは投与部位から急速に拡散する細胞外ペプチドの急速な分解が原因であり、免疫細胞による抗原の取り込みが不十分である可能性がある⁷。したがって、ワクチン送達技術でこれらの障害を克服する必要があります。

OVA 257-264は、融合タンパク質として発現されるMHCクラスI結合_257-264エピトープの、頻繁に使用されるモデルエピトープ⁸である。さらに、OVA_257-264は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答に依存する腫瘍に対する適応免疫応答に極めて重要である。これは、OVA_257-264ペプチドによって誘導される腫瘍内の抗原特異的CD8⁺ T細胞によって媒介される。これは、細胞傷害性T細胞によって放出される不十分なグランザイムBによって特徴付けられ、標的細胞のアポトーシスをもたらす⁸。しかしながら、遊離OVA_257-264ペプチド投与は、これらの抗原の取り込みが抗原提示細胞(APC)ではなく非特異的細胞で起こるため、CTL活性をほとんど誘導しない可能性がある。適切な免疫刺激の欠乏はCTL活性をもたらす⁵.したがって、効果的なCTL活性の誘導には、かなりの進歩が必要です。

上皮細胞によって提供される障壁と粘液の継続的な分泌により、ワクチン抗原は鼻粘液から急速に除去されます^9,10。抗原提示細胞は粘膜上皮9の下にあるため、粘膜組織を通過できる効率的なワクチンベクターの開発は^{非常に重要です。}ワクチンの鼻腔内注射は、理論的には粘膜免疫を誘導して粘膜感染症と戦う¹¹.さらに、経鼻分娩は、その利便性、腸管投与の回避、および患者のコンプライアンスの向上により、ワクチンの効果的かつ安全な投与方法です⁷。したがって、経鼻送達は、ナノワクチンの新規ペプチドエピトープに対する良好な投与手段である。

細胞-組織のエピトープと細胞-細胞相互作用を組み合わせるために、いくつかの合成生体材料が考案されています。Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV)などの特定の生理活性タンパク質は、生物活性を付与するためにヒドロゲルの構造の一部として導入されています¹²。このペプチドは、細胞の付着、遊走、および伸長に寄与する可能性が高く¹³ 、インテグリンα_3β1 およびα_6β1 に結合して、異なる癌細胞型と相互作用する。IKVAVは、もともと神経微小環境をモデル化し、神経分化を引き起こすために使用されたラミニン基底膜タンパク質α_1鎖 に由来する細胞接着ペプチドです¹⁴。したがって、この新しいワクチンの効率的な送達手段を見つけることは、疾病管理にとって重要です。

W805ECやMF59などの最近報告されたエマルジョン系も、不活化インフルエンザワクチンまたは組換えB型肝炎表面抗原の鼻腔送達のために配合されており、粘膜免疫と全身免疫の両方を引き起こすことが示されています¹⁵。ナノエマルジョン(NE)は、粒子状粘膜送達系と比較して、容易な投与および効果的なアジュバントとの便利な共形成の利点を有する¹⁶。ナノエマルジョンワクチンは、従来の脱感作とは異なる持続的な方法でアレルギー表現型を変化させることが報告されており、長期的な抑制効果をもたらします¹⁷。他の人は、Mtb特異的免疫優性抗原と組み合わせたナノエマルジョンが強力な粘膜細胞応答を誘導し、有意な保護を与える可能性があることを報告しました¹⁸。そこで、合成ペプチドIKVAV-OVA_{257-264(I-OVA} 、OVA_257-264に結合したIKVAVからなるペプチド)を用いた新規鼻腔内自己組織化ナノワクチンを設計した。この新しいナノワクチンを体系的に評価することが重要です。

このプロトコルの目的は、ナノワクチンの物理化学的特性、毒性、および安定性を体系的に評価し、技術的手段を使用して抗原の取り込みと防御および治療効果が増強されているかどうかを検出し、主要な実験内容を詳しく説明することです。この研究では、物理化学的特性と安定性を研究し、CCK-8によるBEAS-2B細胞に対するI-OVA NEの毒性の大きさを決定し、共焦点顕微鏡を使用してワクチンに対するBEAS-2B細胞の抗原提示能力を観察するための一連のプロトコルを確立し、この新しいナノワクチンの放出プロファイルをin vivo および in vitroで評価しました、およびE.G7-OVA担癌マウスモデルを用いてこのワクチンの保護および治療効果を検出する。

プロトコル

動物実験は、実験動物—動物福祉の倫理審査のためのガイドライン(GB / T 35892-2018)に従って実施され、第三軍事医科大学の実験動物福祉および倫理委員会によって承認されました。マウスは、100 mg / kgの1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によって安楽死させました。.

1. I-OVA NEの準備

1. 1 mgのモノホスホリルリピドA(MPLA)を100 μLのDMSOと混合し、5分間ボルテックスし、室温(RT)で4時間静置して完全に溶解させます。
2. トゥイーン80とI-OVAを定量的に添加し、混合します。
   注:Tween 80とI-OVAは25:1¹⁹の質量比で混合した。
3. ステップ1.2で調製した混合物にスクアレンを加える(7:3、Smix:スクアレン)。
4. ステップ1.3で調製した混合物に100 μLのMPLA溶液(10 mg/mL)を加えます。
5. 低エネルギー乳化法を用いてナノエマルジョンワクチンを調製する¹⁹:混合溶液を全体積の約70%で水滴に加え、穏やかに攪拌して透明で容易に流動する混合物を得る。
   注:BNEコントロール(ブランクエマルジョン)を同じ方法で調製し、水をI-OVAに置き換えました。

2.物理化学的特性評価と安定性

注:ステップ2.1〜2.3に従って、I-OVA NEワクチンの液滴サイズ分布、ゼータ電位、およびその他の物理化学的データを評価します。ステップ2.4-2.7に従ってI-OVA NEワクチンの形態学的特徴付けを実行します。ステップ2.8-2.9に続いてI-OVA NEワクチンの3D構造を調べます。

1. 50 mgのムチンタンパク質を注射用水100 mLとブレンドして、0.05%ムチン溶液を調製します。
2. 4 mg/mL I-OVA NE を0.05 mg/mLのムチンタンパク質または脱イオン水で200倍に希釈します。
3. ナノアナライザ^ー19を用いて25°Cにおける粒径、ゼータ電位、多分散指数(PDI)、および電気泳動移動度を観察する。
4. 10 μLのI-OVA NEを2 mLの脱イオン水で200倍に希釈します。
5. 5 μLの予め希釈したI-OVA NEワクチン(ステップ2.4)をカーボンコーティングされた銅グリッド上に置き、10 μLの1%リンタングステン酸で3分間覆います。
6. ろ紙で余分なリンタングステン酸を取り除きます。
7. TEMを用いて画像を取得します。50倍に希釈した10 μLのサンプルを100メッシュのカーボン銅グリッドに置き、室温(RT)で5分間放置してから、10 μLのリンタングステン酸(1%、pH 7.4)を加えます。120 kVの電圧でTEMですべてのサンプルを調べます。
8. 高分解能原子間力顕微鏡を用いてI-OVA NEの分子形態を解析します。以下の条件下でI-OVA NEのカラー画像を取得します:タングステンプローブ用(力定数:0.06 N·^m-1);スキャン範囲:450 nm x 450 nm;タッピングモード:イメージングモード;スキャン方法:RTでのポイントバイポイントスキャン。

3. インビトロ および インビボ 毒性アッセイ

注:I-OVA NEワクチンの インビトロ 毒性はステップ3.1-3.9に従って評価され、I-OVA NEワクチンの インビボ 毒性はステップ3.10-3.13に従って評価されました。

1. ステップ3.1.1-3.1.4に従ってヒトBEAS-2B上皮細胞を復活させ、5%_CO2 インキュベーター内の37°Cの完全増殖培地で培養します。
   注意: 完全な増殖培地を調製するには、ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシンをRPMI-1640培地にそれぞれ最終濃度10%と1%で加えます。
   1. ウォーターバスをオンにして、温度を37°Cに調整します。 液体窒素で凍結した細胞バイアルを取り出し、37°Cの水浴中で素早く解凍する。
   2. 解凍後、細胞を15 mLの滅菌遠心チューブにすばやくピペットで入れ、2 mLの完全増殖培地を加え、129 x g で5分間遠心分離します。
   3. 上清を除去し、2 mLの完全増殖培地を加えて細胞を再懸濁し、129 x gで5分間遠心分離します。
   4. 上清を除去し、6mLの完全増殖培地を加えて細胞を再懸濁し、細胞をT25培養フラスコに移し、5%_CO2 インキュベーター内で37°Cで細胞を培養した。
2. 細胞密度が80%〜90%に達したら、培養液を廃棄し、細胞を2 mLのPBSで2回洗浄します。1 mLの0.25%トリプシンを加えて、細胞を1〜2分間消化します。細胞の丸みが観察されたら、直ちに4 mLの完全増殖培地を加えてトリプシンを中和します。
3. サンプルを混合して15 mLの滅菌遠心チューブに吸引し、129 x g で5分間遠心分離します。
4. 上清を除去し、細胞を1 mLのRPMI-1640完全培地に再懸濁します。細胞計数に20 μLを使用し、細胞を1 x 10⁵ 細胞/mLに希釈します。
5. BEAS-2B細胞を100 μLのRPMI-1640完全培地中の96ウェルプレートに1 x 10⁴ 細胞/ウェルの密度でプレートし、5%_CO2 インキュベーター内で37°Cで24時間プレートをプレインキュベートします。
6. 上清を捨て、100 μLのI-OVA NE、100 μLのI-OVA+BNE(物理的に混合)、および100 μLのI-OVAをさまざまな最終濃度(0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL)で完全増殖培地で予め希釈し、BNEを対照として加えます。37°Cで24時間インキュベートします。
   注:陰性対照群に100 μLの完全増殖培地を、陽性対照群に100 μLの細胞懸濁液(1 x 10⁵ / mL)を追加します。
7. 培地を取り出し、90 μLの完全増殖培地と10 μLのCCK-8溶液をプレートの各ウェルに加えます。
8. プレートを5%_CO2 インキュベーター内で37°Cで2時間インキュベートします。
9. 酵素標識プレートリーダーを用いて450 nmにおける各ウェルの吸光度を測定します。
10. BEAS-2B細胞の生存率を以下の式に示すように計算します。
    (OD450_サンプル−OD450陰性対照/OD450陽性対照−OD450_陰性対照)×100%
11. 6週齢のC57BL/6マウスを5つのグループ(各グループでn = 5)にランダムに分け、誘導のために4%イソフルランで麻酔します。2%イソフルランで麻酔を維持する。乾燥を防ぐためにマウスの目にネオマイシン硫酸軟膏を使用してください。
12. 10 μLのピペットチップを使用して、10 μL/鼻孔のI-OVA、I-OVA + BNE、およびIOVA NEを4 mg / mLで3日間マウスに鼻腔免疫します。実験対照としてBNEおよびPBSを使用する。
    注意: 動物が麻酔から回復するまで、熱サポートを提供します。
13. 4日目に100 mg / kg 1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により、すべてのマウスを安楽死させます。
14. 鼻組織のサンプルをハサミで約3 mm厚に切り取り、肺組織を取り除きます。
15. 鼻組織と肺組織全体を4%パラホルムアルデヒドで24時間固定します。連続アルコールとキシレンの勾配で組織を脱水し、パラフィンに埋め込みます。完成したワックスブロックをパラフィンスライサーで厚さ4μmでスライスします。
16. 切片をヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色します。次に、充血、浮腫、好中球浸潤、鼻粘膜および肺組織の構造的損傷などの粘膜毒性を顕微鏡(100倍および200倍)⁷で観察します。

4. in vitro 細胞内取り込み

1. カバーガラス付き12ウェルプレートにBEAS-2B細胞を5 x 10⁵ 細胞/ウェルの密度でプレートし、カバーガラス付きで2 mLの完全増殖培地に入れ、5%_CO2 インキュベーター内で37°Cでプレートを一晩プレインキュベートします。
2. FITC標識I-OVA NE(純度98.3%、同社製造、4 mg/mL)またはI-OVA(4 mg/mL)を900 μLの細胞懸濁液に100 μL加え、37°Cで90分間放置します。
   注: ステップ 4.1 の説明に従って、FITC ラベルの付いた I-OVA NE を準備します。1 mLの完全増殖培地を対照群に加えます。
3. 処理後、0.1 M PBS(1 mL/ウェル)で37°Cで30分間3回洗浄します。
4. これらのサンプルを4%パラホルムアルデヒドで暗所で20分間固定します。固定後、パラホルムアルデヒドを除去し、0.1 M PBS(1 mL/well)で37°Cで30分間3回洗浄します。
5. サンプルをDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)とともに最終濃度10 μg/mLで暗所で10分間プレインキュベートし、処理後、0.1 M PBS(1 mL/ウェル)で37°Cで30分間5回洗浄します。
6. 次のパラメータ設定を使用して、CLSMによるセルラー取り込みを取得します:フレームサイズ:512 px x 512 px、スキャン速度:8;ラインステップ:1;平均化: 2.

5. 生体内 放出

1. ヌードマウスを4%イソフルランガスで麻酔し、麻酔を2%イソフルランで維持する。ヌードマウスに、各鼻孔に4 mg / mLのPE標識I-OVA10 μLまたは4 mg / mLのPE標識I-OBA NEを鼻腔内免疫します。.
2. 0時間、0.5時間、1.5時間、3、6時間、9時間、12時間、および24時間に、IVISシステムによる麻酔下にあるすべてのマウスを捕獲します。
3. 鼻腔内投与の直前にバックグラウンドスキャンを実行して、閾値(Min = 1.06 x 10⁶)を提供し、すべての時点で収集された画像を調整します。
4. Living Imageソフトウェアをクリックしてシーケンスを開始し、初期化をクリックしてIVISシステムを初期化します
5. 初期化されると、IVIS取得コントロールパネルの温度ステータスライトが赤になります。温度ステータスライトが緑色に変わると、イメージングを実行できます。
6. [ イメージング ウィザード ] をクリックし、表示されるダイアログ ボックスで [ 蛍光 ] を選択します。
7. 次のパラメータを調整します: 露出時間:自動秒、 ビニング:8、 F /ストップ:2、 視野:D。
8. 620 nm励起フィルターと670 nm発光フィルターを選択します。 [シーケンスの取得 ]をクリックして画像を取得します。
9. すべてのマウスのライブ画像と放射輝度データをLiving Imageソフトウェアで処理します。
   1. 画像を取得したら、ツールパレットのROIツールをクリックし、[円]を選択して ROI 円を作成します。
   2. [ ROI の測定 ] をクリックして、ROI 領域の定量値を取得します。

6. 生体内 抗腫瘍効果

1. マウスリンパ腫E.G7-OVA細胞をEL4からリフレッシュし、ステップ2.1.1-2.1.4に続く完全増殖培地で培養する。
   注:E.G7-OVA細胞完全増殖培地を調製するには、RPMI 1640培地を2 mM L-グルタミンと混合し、1.5 g / L重炭酸ナトリウム、4.5 g / Lグルコース、10 mM HEPES、および1.0 mMピルビン酸ナトリウムを含むように調整し、0.05 mM 2-メルカプトエタノールおよび0.4 mg / mL G418、90%、およびウシ胎児血清10%を添加します。
2. 細胞が1 x 10⁶ 細胞/mLと1 x 10⁷ 細胞/mLの間の密度に達したら、1:2の比率で細胞を継代培養します。
3. 手順6.3.1-6.3.4で説明されているように、マウスに対する予防的保護効果を評価します。
   1. 6週齢のC57BL/6マウスを5つのグループに無作為に分ける(各群でn = 8)。ヌードマウスを4%イソフルランガスで麻酔し、2%イソフルランで麻酔を維持します。乾燥を防ぐために、マウスの目の上の背中の毛と硫酸ネオマイシン軟膏を部分的に剃ります。
   2. 各鼻孔に1 mg/mL I-OVA、BNE + I-OVA、またはI-OVA NEの10 μL、BNE(PBSで4倍希釈)、またはPBSコントロールを各免疫の間に7日間の間隔で3回鼻腔内免疫します。
   3. 最終免疫後7日目に、すべてのマウスを5 x 10⁵ E. G7-OVA細胞を右背中に皮下注射します。
   4. 最終免疫後0、6、9、12、15、および18日目に、デジタルノギスを使用して腫瘍の2軸を測定して腫瘍体積を監視し、マウスの30日間(最終免疫後)の生存率を記録します。
4. ステップ6.4.1-6.4.3に記載されているように、E.G7-OVA細胞を接種した後のマウスに対する治療的保護効果を評価します。マウスのグループ化と取り扱いについては、手順6.3.1を参照してください。
   1. 0日目に、C57BL / 6マウスをE.G7-OVA細胞(5 x 10⁵ 細胞/マウス)を右背中に皮下注射します。
   2. 注射後0、7、および14日目に、鼻腔内免疫したすべてのマウスに、10 μLのI-OVA、BNE + I-OVA、I-OVA NE(すべて1 mg / mLの濃度)、BNE、またはPBSを各鼻孔に3回免疫します。
   3. 注射後0、6、9、12、15、および18日目に、腫瘍体積を監視し、マウスの30日間の生存率を記録します。
      注:腫瘍体積が3,000 mm³を超える場合、マウスは人道的な理由で安楽死させる必要があり、これらのマウスは生存曲線で死亡したと見なされます。腫瘍体積は、次の式に示すように、修正された楕円体式によって計算されます。
      体積 = π/6 x 長さ x 幅²
      ここで、Lは腫瘍の長さを表し、Wは腫瘍の幅を表す(長さ単位:mm、体積単位:^mm3)。

7. 統計解析

1. 一元配置分散分析、テューキーの多重比較、またはスチューデントのt検定を備えた適切な統計ソフトウェアを使用して、異なるグループ間のデータの差を分析します。Kaplan-Meier 法を使用して生存結果を推定し、グループを対数ランク統計と比較します。すべての結果を平均±SDとして表します。P値P < 0.05、P < 0.01、およびP < 0.001の有意性は、プロット上でそれぞれ*、**、および***を使用して表されます。

結果

プロトコールに従って、鼻腫瘍ナノワクチン送達の調製ならびにインビトロおよびインビボの実験的評価を完了した。TEM、AFM、およびDLSは、ナノワクチンの表面ゼータ電位と粒子サイズの基本特性を評価するための効果的な手段です(図1)。BEAS-2B上皮細胞は、鼻ワクチンのin vitro毒性試験のための有用なスクリーニングモデルである(図...

ディスカッション

免疫細胞膜で機能化されたナノワクチンは、疾患標的治療において大きな利点があり、副作用は、独特の腫瘍向性、特定の標的の同定、長期循環、細胞間相互作用の増強、および低い全身毒性などの特性によって最小限に抑えられます。また、他の治療モジュールと簡単に統合して、がんを共同で治療することもできます^16,20。望ましい属性は、測...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC-labeled I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	NA
HPLC	Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.	E2695
Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, China	NA
IVIS system	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. Co.	tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment	Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.	H31022262
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope	Zeiss, Germany	Zeiss LSM800