マウス骨細胞における負荷誘発カルシウムシグナル伝達ダイナミクスを研究するための蛍光生体内イメージングアプローチ

要約

本稿では、マウス第3中足骨の組織レベルの機械的負荷に応答して、 in vivo で埋め込まれた骨細胞の機械的に誘導されるカルシウムシグナル伝達をリアルタイムで観察するための生体内イメージングアプローチの実施について説明しています。

要約

骨組織は、機械的負荷の大きさの違いに非常に敏感です。骨細胞は、骨全体に合胞体を形成する樹状細胞であり、骨組織の機械感覚機能に関与しています。組織学、数理モデリング、細胞培養、およびex vivo骨器官培養を用いた研究は、骨細胞メカノバイオロジーの理解を大きく前進させました。しかし、骨細胞が生体内で分子レベルで力学的情報にどのように応答し、コード化するかという根本的な問題は十分に理解されていません。骨細胞における細胞内カルシウム濃度の変動は、急性骨メカノトランスダクションメカニズムについてさらに学ぶための有用な標的を提供します。本稿では、骨細胞に発現する蛍光遺伝学的カルシウム指示薬をマウス系統に組み合わせ、インビボローディングおよびイメージングシステムを用いて、ローディング中の骨細胞カルシウムレベルを直接検出するin vivoでの骨細胞メカノバイオロジーの検討方法について報告します。これは、生きたマウスの第3中足骨に明確な機械的負荷を伝達すると同時に、2光子顕微鏡を使用して骨細胞の蛍光表示カルシウム応答を監視できる3点曲げ装置によって達成されます。この技術は、骨全体の負荷に応答した骨細胞カルシウムシグナル伝達イベントの直接in vivo観察を可能にし、骨細胞のメカニズムを明らかにする試みに役立ちます。

概要

骨マトリックスは、機械的な要求^1,2に従って編成され、変化する機械的要件^3,4,5を考慮して動的に変化することができる。骨の機械感覚メカニズムに関する独創的な研究は、約30年前にモデリング論文として発表されました^6,7,8、骨に埋め込まれた骨細胞は、局所環境での流体の動きを介して組織レベルの機械的変形を感知することが提案されました。このモデルは、in vitroおよびex vivo実験で実験的に検証され、骨細胞が非常に^機械感受性1,2,3,4,5,6であり、骨形成骨芽細胞<....

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プロトコル

すべての方法は、コーネル大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 資機材の準備

1. オーバーヘッド多光子顕微鏡で使用するための中足骨ローディングデバイスを設計および構築します。
   注:コンポーネントの仕様とデバイスの動作の詳細については、以前の研究²⁵の補足資料に記載されています。簡単に言えば、主要なコンポーネントは、ロードセルとローディングブラケット、ウォーターバス、および支点ピンと直列に接続されたアクチュエータで構成されています。アクチュエータとロードセルは市販されており、最大300gの荷重を収容できる必要があります。ウォーターバス、支点ピン、およびロードブラケットは、チタンまたはステンレス鋼で構成する必要があります。これらは、社内で製造することも、3D金属印刷 によって 商業的に製造することもできます。
2. 個々のマウスグループ(性別、治療、遺伝子型など)について、事前にアクチュエータの変位に対するひずみの大きさの値を較正します。これは、以前の研究²⁵で概説した手順で表面ひずみマッピングを使用して行われます。
3. 骨細胞に蛍光カルシウム指示薬コンストラクトを発現する1....

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結果

ここでは、急性期手術用調製物と多光子蛍光イメージングを用いて、 in vivo に埋め込まれた骨細胞におけるカルシウムシグナル伝達を研究する方法論について報告します。緑色蛍光シグナルは、DMP1-Creの発現 を介して 骨細胞の遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターから観察できます。 図4 は、埋め込まれた骨細胞の単?.......

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ディスカッション

骨細胞は硬組織マトリックスに埋め込まれた位置にあり、このニッチを取り除くと急速に劣化または脱分化するため、実験的に骨細胞を研究することは困難です。骨細胞の研究は、骨細胞様系統29,30,31の作成、初代骨細胞^32,33を分離するためのプロトコ?.......

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Handle scalpel	Electron Microscopy Sciences	72040-03	Surgical supplies
20x Water immersion objective	Olympus	XLUMPLFLN20XW	This is a 20x objective, but 40x can also be used for this protocol. We recommend water immersions because it needs to be dipped in the bath during imaging, so open-air objective may cause abberrations
A.M. Bickford Omnicon F/AIR	AM Bickford	80120	A sensible answer to anesthesia gas problems in the operating room, the F/AIR anesthesia gas filter was specifically designed to remove waste anesthesia gases such as Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. from the operating room environment.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit	AM Bickford	80000	An entire kit with tube and adaptors to connect F/AIR to setup
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJ	The Jackson Laboratory	28865	GCaMP6f Mice for cross-breeding with Dmp1-Cre mice
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJ	The Jackson Laboratory	23047	Dmp1-Cre Mice for cross-breeding with GCaMP6f  mice
Compression load cell	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	905898	LCM100 , 1000 g , Sub-miniature tension & compression load cell (Miniature/Inline Threaded) , RoHS lead free, Material - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-thread , 34 Awg 4 conductor braided polyester cable , 5 ft Long
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), 1x [+] calcium, magnesium	VWR International	21-030-CV	Ionically balanced bath that contains calcium submerges the metatarsal during imaging
Dental pick tool	Electron Microscopy Sciences		Surgical supplies
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagent >99.5%	Sigma Aldrich	SIAL-459844-500ML	Sterilization purposes
Fulcrum pin	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
High resolution and speed USB220 output kit	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	717435	Used to connect load cell to laptop
ImageJ 1.53t with Java 1.8.0_172 (for Windows 64-bit)	NIH	N/A	Install here https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal Critical Care	66794-013-25	100% inhalation vapour liquid
Loading bracket	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
MATLAB R2019a	MathWorks		For running the loading device
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isoflurane	Butler Schein Animal Health	14309	Vaporizer for anesthetic
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet		2500A Vet
Piezo servo controller	PI-USA	E-625	Electronic component recommended by the company to be used with the actuator
PiezoMove high-stiffness linear piezo actuator	PI-USA	P-602.5SL	Actuator for the loading device
Scalpel blades, No. 10 for handle No. 3, pack of 100	Electron Microscopy Sciences	72044-10	Surgical supplies
Stainless steel tweezers with sharp, fine tips. Length: 120 mm	Electron Microscopy Sciences	78326-42	Surgical supplies
Thorlabs Bergamo multiphoton microscope	ThorLabs	N/A	This is only the imaging system and does not have the laser included, although ThorLabs has laser options if desired
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX with Total Power Control (TPC)	Coherent	N/A	This system technically has two lasers, both a tunable and a fixed laser. However, for the protocol, only the tunable is needed.
Vannas spring scissors - 4 mm cutting edge	Fine Science Tools	15018-10	Surgical supplies
Water bath	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document