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Summary

ここでは、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)をモデルとして、ダニの唾液や哺乳類の肉の消費に対するアレルギー反応を評価することにより、α-Gal症候群(AGS)に関連するアレルギー反応と免疫応答を研究しています。

Abstract

ダニは、病原体の伝染によって病気を引き起こす節足動物のベクターであり、その咬傷は世界中の人間の健康に影響を与えるアレルギー反応に関連している可能性があります。一部の個体では、グリカンGalα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R(α-Gal)に対する高レベルの免疫グロブリンE抗体がダニ刺されによって誘導されています。.ダニの唾液中に存在する糖鎖α-Galを含む糖タンパク質と糖脂質によって媒介されるアナフィラキシー反応は、α-Gal症候群(AGS)または哺乳類の肉アレルギーに関連しています。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、さまざまな病状の研究に広く使用されている脊椎動物モデルとなっています。この研究では、ゼブラフィッシュは、人間のようにこの糖鎖を合成しないため、α-Galおよび哺乳類の肉の消費に反応するアレルギー反応の研究のモデルとして使用されました。この目的のために、 Ixodes ricinus ダニ唾液および哺乳類肉の消費に応答した行動パターンおよび出血性アナフィラキシー型アレルギー反応を評価した。この実験的アプローチは、AGSを含むダニ媒介性アレルギーの研究のためのゼブラフィッシュ動物モデルを支持する有効なデータの観察を可能にする。

Introduction

ダニは病気を引き起こす病原体の媒介者であり、アレルギー反応の原因でもあり、世界中の人間や動物の健康に影響を与えます1,2。ダニの摂食中、ダニの唾液中の生体分子、特にタンパク質と脂質は、これらの外部寄生虫の摂食を促進し、宿主防御を回避します3。グリカンGalα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R(α-Gal)修飾を有する一部の唾液生体分子は、ダニ咬傷後に高い抗α-Gal IgE抗体レベルを産生し、一部の個体でのみ、これはα-Gal症候群(AGS)4として知られています。これは、ダニ刺されに対するアナフィラキシー、非霊長類の哺乳類の肉の消費、およびセツキシマブ5などの一部の薬物を引き起こす可能性のあるIgEを介したアレルギーに関連する疾患です。α-Galに対する反応はしばしば重篤であり、時には致命的となる可能性があります6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。

α-Galは、旧世界のサル、類人猿、およびα-Gal13を合成する能力を持たない人間を除くすべての哺乳類に見られます。しかし、細菌や原生動物などの病原体は、その表面にこの糖鎖を発現し、大量の抗α-Gal IgM / IgG抗体の産生を誘導する可能性があり、これらの病原体に対する保護メカニズムである可能性があります16,17。しかし、抗α-Gal抗体の産生は、IgEを介した抗α-Galアレルギーを発症するリスクを高めます7,13。主にIgM / IgGサブタイプのヒトで産生された天然の抗α-Gal抗体は、腸内細菌叢の細菌に存在するこの修飾に関連している可能性があります16。現時点での主な診断方法は、特に食物アレルギー(すなわち、そう痒症、限局性じんましん、またはアナフィラキシー、じんましん、および胃腸症状に対する再発性血管浮腫)およびIgE抗α-Gal抗体レベルの測定に関連する遅延性アレルギー反応の病歴に基づいているため、AGSは困難な臨床診断になる可能性があります9。現在の知見は、ダニ咬傷がAGS18,19の出現における主要なリスクの1つを構成することを示唆しており、ダニ咬傷後のIgEレベルのα-Galへの20倍以上の増加19、AGS20,21,22患者のダニ咬傷の病歴、AGS患者におけるダニ抗原に反応する抗体の存在19、 抗α-Gal IgEは抗ダニIgEレベル19,23と強く関連していますが、どの生体分子が実際に関与しているかを評価するにはさらなる研究が必要です。

さらに、別の考えられるシナリオは、ダニ刺されおよび高レベルの抗α-Gal IgE抗体に対して強いアレルギー反応を示すが、哺乳類の肉の消費に耐性がある患者です12。したがって、哺乳類の肉アレルギーは、特定のタイプのダニ咬傷関連アレルギーである可能性があります。AGSに関連する主なダニ種には、Amblyomma americanum(米国)、Amblyomma sculptum(ブラジル)、Amblyomma testudinariumおよびHaemaphysalis longicornis(日本)、Ixodes holocyclus(オーストラリア)、およびIxodes ricinus(ヨーロッパにおけるライムボレリア症の主なベクター)が含まれます11,24。

マダニ刺されに関連するIgE産生を評価するために使用された唯一のモデルは、他の哺乳類と同様に、マウスもタンパク質および脂質上にα-Galを発現し、α-GalにIgEを産生しないため、α−1,3−ガラクトース転移酵素ノックアウト(α−Gal KO)マウス25,26の遺伝子で遺伝子改変されたマウスモデルである。しかし、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、哺乳類と解剖学的に多くの類似点を共有し、人間と同様にα-Galを合成することができないため、哺乳類に適用される生物医学研究に有用なモデルです。α-Galはゼブラフィッシュで自然に生成されないため、手頃な価格のモデルであり、操作が容易で、α-Gal関連のアレルギー反応の研究に高いサンプルサイズを可能にします。

この研究では、ゼブラフィッシュをモデル生物として使用して、局所アレルギー反応、行動パターン、およびダニ唾液26,27およびその後の哺乳類肉消費に対する経皮感作への反応に関連する分子メカニズムを特徴付け、説明しています。この目的のために、魚は皮内注射によってダニの唾液にさらされ、次にα-Gal27を含む動物の使用に適した哺乳類の肉由来製品を含む犬の飼料を与え、次に関連するアレルギー反応の可能性を評価します。この方法は、アレルギープロセスに関連する他の生体分子、特にAGSに関連する生体分子の研究に適用できます。

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Protocol

ここに記載されているすべての方法は、カスティーリャラマンチャ大学の動物実験に関する倫理委員会によって、「不活化M. ボビス ワクチンに対する免疫応答の評価とゼブラフィッシュモデル番号PR-2017-05-12の M.マリナム への挑戦」の研究の下で承認されています。

ダニは実験室コロニーから得られ、コロニー内のダニの代表的なサンプルは、病原体の不在を確認するために一般的なダニ病原体についてPCRによってテストされ、チェコ共和国のチェコ科学アカデミー生物学センター(IP BC CAS)の寄生虫学研究所で維持されましたすべての動物実験は、チェコ共和国の動物保護法第246/1992 Sb(倫理承認第34/2018号)に従って実施されました。

1.ゼブラフィッシュ治療

注:この試験は、哺乳類の肉の消費に反応してダニの唾液で処理されたゼブラフィッシュのアレルギー反応と免疫反応を評価するように設計されています。

  1. 魚を(セクション4で説明したように)ダニの唾液、市販のGala1-3Gal-BSA 3(α-Gal)( 材料の表を参照)で処理し、ポジティブコントロールとして使用し、ネガティブコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用します。成体のゼブラフィッシュは、性別のバランスのとれた3つのグループにランダムに分布しています(図1)。
    注:AGSに関連するその他の望ましい化合物は、このモデルを使用して評価できます。

2. イクソデス・リシナス ・ダニ唾液抽出

  1. モルモットに6〜7日間給餌された半充血した病原体のない雌ダニを使用する。
  2. ダニを5μLの塩酸ピロカルピン溶液( 材料の表を参照)でpH 7.4でヘモコエルに処理し、前述のように0.33 mmの針を備えた50 μLシリンジを使用してヘモコエルに入れます28 ダニの唾液産生を誘発します。.
    注:ティックは鉗子を使用して処理されます。それらを握るときに力を入れすぎないように注意してください。
  3. マイクロピペットに取り付けられた10μLのチップを使用して唾液を採取します。
    1. ダニのハイポストームの内側に先端を慎重に導入します。
    2. 唾液を氷上の1.5mLチューブに入れてプールし、前述のように-80°Cで保管します27。
  4. 唾液タンパク質濃度を決定し、製造業者の推奨に従ってBCAタンパク質アッセイキット(材料の表を参照)を使用して、以前の研究27のように魚に注入されるタンパク質の量を確立します。

3.ゼブラフィッシュの維持

  1. ゼブラフィッシュを27°Cのフロースルー水系で14時間/10時間の明暗サイクルで維持します(図2)。
  2. 2日目まで、午前9時30分と午後1時30分に1日2回、干魚の餌(50〜70μg/魚)を与えます。
  3. 午前9時30分と午後1時30分に、治療注射後2日目から実験終了まで、ドライドッグ飼料(50〜70μg/魚)を毎日2回給餌します。

4.ゼブラフィッシュ注射

  1. 雌/雄の比率が似ており、体重が似ているグループごとに10匹の魚を選択します。
    注:グループ1にはPBSを注入した魚が含まれ、グループ2にはダニの唾液を注入した魚が含まれ、グループ3にはα-Galを注入された魚が含まれます。
  2. 0.02%メタンスルホン酸トリカイン(MS-222)に浸して魚を短時間麻酔します(動画1)。
    注:適切に麻酔をかけられた魚は、通常の呼吸を示し、水泳はありませんが、水槽の底に置くか、浮かぶ可能性があります。起こりうる生理学的損傷を避けるために、各魚は個別に麻酔をかけなければなりません。
  3. 漁網を使用して麻酔をかけた魚を捕獲します。
  4. 病変を制御するために、鉗子または手を使用して魚を慎重に、湿ったスポンジの上に尾びれを右側に置き、同じ方向に化合物を注入します。
  5. 以前の研究26と同様に、魚のグループを尾びれまで5 mm、魚の体に対して45°の角度で筋肉に皮内に注射します(動画2)。前述のように、0、3、および8日目に適切な治療を使用します27、1 cm、29 Gの針を取り付けた100 μLの注射器で、10 μLのPBS(ダニの唾液)中の1 μLのリシナス唾液(9 μg/μLのタンパク質を含む)、10 μLのPBS(αダニの唾液)中の5 μgのα-Gal27、 および10 μLのPBSを使用します(図3)。
    注意: 動物への物理的な損傷を避けるために、取り扱いは迅速かつ慎重に行う必要があります。
    ダニの唾液中の他の生体分子は、このプロトコルに従って評価することができる。
  6. 処理した魚を回復のために麻酔なしで淡水タンクに戻します。
    注:同じグループのすべての魚は、回復のために同じ水槽に入れることができます。

5.ゼブラフィッシュの餌やり

  1. ドッグフードを乳鉢と乳棒でマッシュアップします。
  2. 50〜70μg/魚を午前9時30分と午後1時30分に1日2回、2日目まで乾いた魚の餌を与えます。
  3. 治療注射後2日目から8日目の実験終了まで、午前9時30分と午後1時30分に1日2回、マッシュドッグフィードで50〜70μg/魚を給餌します。
    注:さまざまな接種中の治療または飼料に反応したα-GalまたはIgE抗体に対する免疫マーカーまたは抗体価を評価する場合は、実験が終了するまで給餌が必要になります。

6.ゼブラフィッシュのアレルギー反応、病変、行動の評価

  1. 拡大鏡または実体顕微鏡を使用して出血性タイプのアレルギー反応(皮膚の発赤、変色、出血)を正確に調べ、 表1 に含まれる分類に従って魚に出現する場所を示します(図4A)。
    注: 図4 に示すアレルギー反応は、ダニの唾液の注射と赤身の肉を含む飼料の摂取後に現れました。したがって、記載された反応は、同様の反応が臨床状況に現れるので、AGSに関連する反応のタイプである。
    1. 魚が水槽にいる間、治療後および1日2回食物を投与している間に反応が現れないか観察してください。
  2. 表1に含まれる分類に従って、水泳パターンの変化27(移動性、速度、水槽の底に動かずに立っている、ジグザグに泳ぐ)を評価して、魚の行動を調べます。
  3. 累積死亡率を評価し、死亡時間/死亡日を含む死んだ魚の数を報告します(図4B)。
    注:すべてのパラメータは、処理直後または飼料の変更後に評価され、質的変数を分類する8日目の実験終了まで毎日追跡されます(表1)。推奨事項として、この評価は、ゼブラフィッシュに関する知識を持つ専門家が実施し、ゼブラフィッシュの背景とこの動物モデルを使用した経験に基づいて行動の変化を検討する必要があります。
  4. 各グループで報告されたアレルギー反応、異常行動、摂食変化を含む1日あたりのゼブラフィッシュの数を計算し、一元配置分散分析によってグループ間を比較します。

7.サンプル収集

  1. 8日目に0.04%MS-222に浸して魚を安楽死させます。
    注:試験中にアレルギー反応で死亡した魚からもサンプルを収集します。
  2. ピンでパラフィンプレートに魚を固定します。
  3. 安楽死直後、えらがまだ血液で洗浄されているときに、1cm、29Gの針を取り付けた0.5mLの注射器を使用して、魚のえら血管29 から血清を収集する。使用するまで-20°Cの1.5mLチューブに保存してください(動画3)。
  4. メスの刃で魚を矢状に切り、内部病変(出血性病変または肉芽腫)が現れた場合は評価します27,30。
    注:病変は必ずしも現れるとは限りませんが、現れる場合は登録する必要があります。
  5. 前述のように、各魚の腸(動画4)と腎臓(動画5)を別々の空の1.5 mLチューブに集め31、-80°Cで保存します(図4C)。
  6. RNA精製キットを使用して、ゼブラフィッシュの腸および腎臓サンプルからトータルRNAを抽出します(材料の表を参照)。
  7. ゼブラフィッシュにおける免疫応答に関連する遺伝子の発現を分析し30,32(プライマー配列については表2を参照)し、RT-qPCR用の逆転写ミックス(材料の表を参照)を用いて定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を行い、製造元の指示に従って。mRNA cT値をD. rerio GAPDHに対して正規化し、不等分散のスチューデントt検定を使用してグループ間(唾液で処理された魚、α-Gal、およびPBSで処理されたグループ)を比較します。
  8. 血清サンプル中のゼブラフィッシュ中のα-Galを認識するIgM抗体価を、前述のようにELISAによって決定する27、30。プレートリーダーを使用して抗体価をO.D.450 nm 値として記録し、不等分散のスチューデントt検定を使用してグループ(唾液で処理された魚、α-Gal、およびPBS処理されたグループ)を比較します。
    注:IgM抗体価の測定および発現遺伝子解析は任意であり、免疫学的情報が必要な場合にのみ実施されます。RT-qPCRミックスは、リアルタイムqPCRを用いた遺伝子発現解析用の第一鎖cDNA合成キットです。

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Results

ここで提示されたプロトコルは、以前に発表された実験27,30のいくつかの側面と、ゼブラフィッシュモデルが確立され、AGSの研究とα-Galに対する免疫応答のために検証された私たちの研究室で実行された結果に基づいています。このモデルは、ダニの唾液に対する宿主の反応(図4)の結果としてのさまざまなア...

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Discussion

ゼブラフィッシュは費用対効果が高く扱いやすいモデルであり、免疫応答、病原体疾患、新薬検査、ワクチン接種および感染に対する防御の分子メカニズムの研究のための非常に実行可能なツールでもあります33,34,35。ゼブラフィッシュの行動に関する研究は、以前の研究では、ストレスがかかっても水槽の底で動かず、?...

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Disclosures

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

SaBioグループのメンバーが実験計画に協力し、魚類実験施設とゼブラフィッシュを提供してくれたフアンガルセランサエス(IN-CSIC-UMH、スペイン)との技術支援に感謝します。この作業は、スペインおよびEU-FEDERのMCIN/AEI/10.13039/501100011033のMinisterio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/(Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00)の支援を受けました。マリネラコントレラスは、スペインのイノバシオン大学シエンシア大臣から資金提供を受けており、IJC2020-042710-Iの助成金を受けています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubeVWR525-0990
All Prep DNA/RNAQiagen80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23225
Disection setVWR631-1279
Dog Food - Red ClassicAcana
ELISA plates-96 wellThermo Fisher Scientific10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) DextraNGP0203
iScript Reverse Transcription SupermixSupermix1708840
Microliter syringesHamilton7638-01
Plate readerany
Phosphate buffered salineSigmaP4417-50TAB
pilocarpine hydrochloride SigmaP6503
Pipette tip P10 VWR613-0364
Pipette tip P1000VWR613-0359
Premium food tropical fishDAPC
Sponge Animal Holder Made from scrap foam
Stereomicroscopeany
Thermal Cycler Real-Time PCRany
Tricaine methanesulphonate (MS-222)SigmaE10521

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