ライトシート蛍光顕微鏡による老化蝸牛のイメージング

要約

蝸牛全体を画像化してデジタル化するために、ライトシート顕微鏡が開発されました。

要約

難聴は最も一般的な感覚障害であり、世界保健機関¹によると、世界中で約5%または4億3000万人が罹患しています。老化または老人性難聴は感音難聴の主な原因であり、有毛細胞、らせん神経節ニューロン(SGN)、および脈理の損傷を特徴としています。これらの構造は、液体に吊り下げられ、骨に囲まれた膜組織の複雑ならせん状の解剖学的構造を有する蝸牛内に存在します。これらの特性により、組織病理学的変化の調査と定量化は技術的に困難になります。このニーズに対応するために、内耳の構造と機能の関係の研究を容易にするために、蝸牛全体を画像化およびデジタル化できるライトシート顕微鏡(TSLIM)を開発しました。蝸牛全体の整列した連続切片は、3次元(3D)ボリュームレンダリング用の画像のスタックと、3D視覚化と定量分析のための個々の構造(すなわち、長さ、幅、表面、体積、および数)のセグメンテーションをもたらします。蝸牛は最小限の処理ステップ(固定、脱灰、脱水、染色、および光クリアリング)を必要とし、これらはすべて、走査型および透過型電子顕微鏡によるその後の高解像度イメージングと互換性があります。すべての組織がスタック内に存在するため、各構造を個別に、または他の構造と比較して評価できます。さらに、イメージングは蛍光プローブを使用するため、免疫組織化学およびリガンド結合を使用して、特定の構造および蝸牛内のそれらの3D体積または分布を同定することができる。ここでは、TSLIMを使用して、有毛細胞とらせん状神経節ニューロンの喪失を定量化するために、老化マウスの蝸牛を調べました。さらに、高度な分析(クラスター分析など)を使用して、ローゼンタール管のらせん神経節ニューロンの局所的な減少を3Dボリュームに沿って視覚化しました。これらのアプローチは、蝸牛内および蝸牛間の構造と機能の関係を定量化するTSLIM顕微鏡の能力を示しています。

概要

蝸牛は、哺乳類の聴覚のための末梢感覚器官です。それは、音の振動を検出し、聴覚の知覚のためにそれらを脳に伝達するために解剖学的に特殊化された感覚細胞と支持細胞を繰り返す複雑ならせん状の解剖学的構造を持っています。主な感覚要素は、内有毛細胞と外有毛細胞、およびそれらの神経支配神経線維であり、その細胞体はローゼンタール管内に存在するらせん神経節を構成します(図1)。これらの感覚および神経構造は、高周波音が蝸牛基部で伝達され、低周波音が蝸牛頂点²で伝達されるようにトノトピック的に配置されています。支持脳底膜のらせん長に沿ったこの感覚細胞分布の解剖学的地図は、サイトコクレオグラム³ と呼ばれ、オージオグラムに描かれているように、周波数の関数としての難聴と比較することができます。

密な骨に囲まれた蝸牛の膜状の迷路は、一度に複数の蝸牛構造を調べることを技術的に困難にします。したがって、ライトシート顕微鏡を開発する理論的根拠は、すべての蝸牛構造を3D再構成で互いに相対的に検査できるように、完全な蝸牛の整列した連続切片を作成することです。Voieら⁴とVoieとSpelman5は、蝸牛全体を光学的に切片化する直交面蛍光光学切片顕微鏡(OPFOS)と呼ばれる最初のライトシート顕微鏡を設計しました。しかし、この顕微鏡は商業的に開発されたことはありません。そこで、薄膜レーザーイメージング顕微鏡(TSLIM;図2)。TSLIMの設計と建設の詳細は以前に公開されています⁸。TSLIMは、画像収集に低照度デジタルカメラとCCDカメラを使用する、ライトシートを通る標本の正確で再現性のある動きのための光学的にエンコードされたマイクロポジショナー、市販の光学的に透明な標本チャンバーの使用、および組織内の汚れの沈殿を防ぐための透明溶液ではなくエタノールでのローダミン染色など、OPFOSに対していくつかの改善を行いました。SPIM⁶などのライトシート顕微鏡の商業開発は、生きた小さな透明な標本の高解像度イメージングに重点を置いていますが、十分な作動距離がないため、全蝸牛イメージングには適していません。他のライトシート顕微鏡の開発のレビューがSanti⁷によって発表されました。蝸牛を検査するための他の組織学的方法に対するTSLIMの主な利点は、標本の完全性を維持しながら、他の組織学的方法で使用できるように、3D再建のために組織を光学的に切片化することです。TSLIMイメージングの別の利点は、共焦点顕微鏡のようにレーザーに露出する組織全体の厚さと比較して、レーザーによって生成された薄いライトシートのみが組織に露光されることです。光散乱を最小限に抑えるための組織透明化と、組織のごく一部のみがレーザーにさらされるという事実により、ライトシートレーザーイメージングによる蛍光色素の退色(光退色)が最小限に抑えられます。ただし、固定、脱水、および透明化のプロセスは、蝸牛構造の形態を変化させ、生体組織と比較して組織が収縮します。発生する組織収縮の実際の量は決定されていません。

TSLIMは、シェーン・ジョンソンと8人のドイツの光学工学の学生によって開発されました( 謝辞を参照)。TSLIMの構造の詳細はSantiら⁸ によって提供され、スキャンバージョン(sTSLIM)はSchröterら⁹によって提供された。TSLIMは、標本を光学的に切片化する非破壊ミクロトームとして、また蝸牛の全幅と厚さを通して2D連続切片を収集するための顕微鏡として機能します。TSLIMは、小さな(mm)と大きな(cm)厚い標本の両方を画像化することができます。レンズは空気で取り付けられており、解剖顕微鏡で1倍と2倍の収集対物レンズで長い作動距離を可能にします。解剖顕微鏡にはズーム光学系もあり、TSLIMは細胞上の細胞内およびシナプス構造を分解することができます。TSLIMには、照明用の青色(473 nm)と緑色(532 nm)の両方のレーザーが搭載されており、さまざまな蛍光プローブをイメージングに使用できます。TSLIMの目標は、蝸牛組織の完全なデジタル再構築のために、蝸牛全体を通して適切に整列した2D光学切片を作成することです。蛍光法であるため、リガンドおよび免疫組織化学を使用して、特定の蝸牛構造を同定することもできます。

当初、シリンドリカルレンズを使用して2つの対向するガウスライトシートを生成しましたが、吸収イメージングアーティファクトを生成しました。Kellerら¹⁰の作業により、固定されたシリンドリカルレンズを走査型検流鏡に置き換えてライトシート⁹を作製した。また、ライトシートの中央はビームウエストで最も薄いため、試料の幅を横切るX軸列のデータを合成してsTSLIM 2D画像を生成します(図3)。この方法は、BuytaertとDircks¹¹によって最初に記述されました。画像を駆動および収集するためのTSLIMカスタムソフトウェアは、機器制御用のグラフィカルプログラムを使用して開発されました。ライトシートは標本を通過し、組織内の蛍光面を照らします。この蛍光面は、透明な標本を通して直交的に投影され、解剖顕微鏡によって収集されます。光学的にエンコードされたマイクロポジショナーは、X軸のビームウエストをスキャンして単一の合成2D画像を収集し、その後、Z軸マイクロポジショナーが標本を組織内のより深い平面に移動して、連続した断面2D画像のスタックを取得できます(ビデオ1、 図4)。並進画像のスタックは、蝸牛の幅、厚さ、長さ全体にわたって収集され、画像のステッチは必要ありません(ビデオ2)。画像スタックは別のコンピューターに転送され、3D再構成と定量化のために3Dレンダリングプログラムにロードされます。画像スタックには、顕微鏡の解像度での蝸牛の形態に関するすべてのデジタル情報が含まれています。ただし、より高い分解能が必要な場合は、ミクロトーム切片、スキャン、透過型電子顕微鏡などの破壊的な組織学的方法によって、無傷の蝸牛をさらに処理できます。

3Dレンダリングプログラムは、3Dレンダリングと定量分析のためにさまざまな蝸牛構造をセグメント化するために使用されます。セグメンテーションでは、スタックのすべての2D画像の各構造が、グラフィックタブレットとペンによって異なる色を使用してトレースされます(図5)。現在までに、20の異なる蝸牛構造がセグメント化されています(図6)。セグメンテーション後、さまざまな3D解析を実行できます。たとえば、3Dレンダリングソフトウェアは、構造の重心に沿った任意の平面で蝸牛を仮想的に切除できます。 ビデオ3 は、コルティの器官に接する切片を示しており、脳底膜の長さに沿って有毛細胞を明らかにしています。このプロセスでは、まず、関心のある構造を手動でセグメンテーションする必要があります。次に、構造物の重心は、基部から頂点まで構造の中心に沿って配置されたスプライン点の最小二乗適合に基づいて計算され、構造の長さの近似が可能になります(ビデオ4)。スケルトン化と呼ばれる同様のプロセスを使用して、カラーマップを使用して、その長さに沿った構造の半径方向の幅を視覚化できます(ビデオ4)。各構造物の総体積は、セグメンテーション後にプログラムによって計算されますが、相対距離は、3Dレンダリングソフトウェアのカラーマップで定量化および視覚化することもできます(図7)。セグメント化された構造をエクスポートして、拡大されたソリッドプラスチックモデルのレンダリングを作成することもできます(図8)。さらに、3Dレンダリングソフトウェアを使用して半自動セルカウントを実行することもできます(図9)。免疫組織化学およびリガンド結合は、特定の蝸牛構造を染色するために使用でき、これらの構造は、サイトコクレオグラムの作成などの形態測定的評価のために他の蝸牛構造から単離することができます(図10)。すべての人工内耳構造の長さ、幅、表面、体積、および数は3Dモデルから決定できるため、このアプローチは人工内耳の損傷を機能障害にマッピングするのに理想的です。具体的には、加齢、騒音誘発性外傷、または他の侮辱による蝸牛損傷を、2D光学切片からの3D人工内耳再構成で示し、定量化することができる。蝸牛がデジタル化されると、解剖学的レジストリ内の蝸牛内の任意の組織の他の蝸牛組織への蝸牛損傷を評価するために使用できる多数のイメージングアルゴリズムがあります。

プロトコル

生きた動物のすべての手順と使用は、ミネソタ大学施設ケアおよび使用委員会(IACUC)によってレビューおよび承認され(プロトコルID #2010-38573A)、これらの動物を使用する研究者は、動物施設にアクセスする前に、研究動物資源(RAR)獣医によって徹底的に訓練およびテストされています。この研究では、雄と雌の両方のマウスを使用しました。

1.固定のための蝸牛除去とイメージングのための組織処理

1. CO₂ 吸入を使用してマウスを安楽死させる。マウスをハサミで斬首し、脳を通して背腹切開を行い、頭蓋骨を半解します。脳を取り除き、頭蓋骨の基底腹側の丸いブラを特定し、ロンジュールでブラを開き、蝸牛を視覚化して取り除きます。
2. 固定:この手順は、ヒュームフードの下で、5倍の倍率で解剖顕微鏡を使用して実行します。手袋と防護服を着用してください。楕円形の窓に穴を開け、鋭いピックでテープを取り除きます。丸い窓にピックを挿入して、メンブレンに穴を開けます。
3. 開いた丸い窓を、2 mLのホルマリンで満たされた1 mLシリンジに取り付けられた輸液セットのカットチップで覆います。ホルマリンが開いた楕円形の窓 から 蝸牛から出ていることに注意しながら、2分間にわたって蝸牛の外リンパ腔からホルマリンをゆっくりと注入します。蝸牛から余分な組織を取り除き、10%ホルマリンを含むボトルに浸し、ローテーターに一晩置きます。
4. 脱灰:蝸牛をPBS 3xでそれぞれ5分間すすぎ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)の10%溶液を含むボトルに4日間回転させて浸し、溶液を毎日交換します。
5. 脱水:蝸牛をPBS 3xで灌流し、変化の間に15分間浸します。エタノール10%、50%、70%、95%、95%、100%、100%の上昇濃度で蝸牛を脱水する。各濃度で30分間。
   注:EDTAはエタノール中に沈殿するため、脱水前にすべてのEDTAを除去することが重要です。また、蝸牛は一晩70%を超える任意の濃度のエタノールで放置することができる。
6. 染色:ローダミンBイソチオシネート溶液(100%エタノール溶液5 μg/mL)に一晩回転させて、蝸牛全体を染色します。100%エタノールを2回交換し、各交換を5分間行うことで、蝸牛から余分な染料を取り除きます。
7. 清澄化:染色した蝸牛をSpalteholz¹² 溶液(5:3サリチル酸メチル:安息香酸ベンジル)の2つの変化に移し、各変化を30分、回転しながら透明化溶液に一晩放置します。蝸牛はスパルテホルツ溶液に無期限に残すことができます。

2. 蝸牛のイメージング

1. 楕円形と円形の窓の膜端にある試料棒に蝸牛を取り付けて、透明化溶液が蝸牛内に留まり、気泡が形成されないようにします(図2)。蝸牛は除去が難しく、組織内に残ると画像アーチファクトを引き起こすため、蝸牛内に気泡が形成されないように注意する必要があります。
2. UV活性化接着剤を使用して、湿った蝸牛を乾燥した試料ロッドに取り付けます(図2)。楕円形と丸い窓の端に蝸牛を取り付けます。UV光で蝸牛の周りを移動して、UV接着剤を10秒間硬化させます。
   注意: 蝸牛が標本ロッドに緩く取り付けられていると、画像に欠陥が生じます。このロッドは、このプロトコル用に特別に製造されており(詳細についてはSanti et ^al.8 を参照)、当社のライトシート顕微鏡に固有のものです。
3. イメージング用のSpalteholz溶液で満たされたイメージングチャンバーに蝸牛を吊り下げます。試料室は光学的に透明な石英蛍光光度計セルです(ビデオ1)。
4. XZ並進ステージにも取り付けられている回転ホルダーに試料ロッドを取り付けます。ほとんどのスタックは、XZ平面で試験片を平行移動することによって得られますが、回転スタックも取得できます。
5. TSLIM光学セクショニング:蛍光色素染色の種類に応じて、励起に青色または緑色のレーザーを使用します。焦点を合わせるために組織の中央にライトシートを配置し、蝸牛の全幅を照らすために使用される倍率を決定します。次に、カスタム設計のプログラムを使用して、X軸(画像をステッチ)およびZステップで標本を横切ってライトシートを介して標本を移動し、蝸牛全体に2D画像のスタックを作成します。
6. 最初の画像では、ライトシートのビームウエストが標本の端に配置され、プログラムは標本の全幅をスキャンしてデータの列を収集します(画像ステッチを参照)。Santiら⁸)は、共焦点パラメータの幅(図3)であり、標本の幅全体にわたる最大解像度の合成2D画像を生成する。このプログラムは、標本が完全に画像化されるまで、Zステップごとに画像スティッチングを自動化します。
7. 画像処理:画像スタックを別のコンピューターに転送し、3Dレンダリングプログラムにロードして、3D再構成と定量化を行います。

結果

本特集号のテーマは蝸牛における老化の影響のイメージングであるため、若齢(3ヶ月齢、HS2479、CBA系統マウス)および高齢(23ヶ月齢、HS2521、C57系統マウス)の蝸牛を例に挙げます。TSLIMは、ヒト、哺乳類、他のげっ歯類、魚類、ならびに脳などの他の器官からの蝸牛を含む様々な標本を画像化することができることに留意すべきである。

Johnsonら ¹³ は、TSLIM?...

ディスカッション

蝸牛構造の検査のためのライトシート顕微鏡による光学切片作成は、他のより伝統的な組織学的方法のように機械的に破壊的ではなく、蝸牛構造の相互相対的な完全なデジタルビューを提供します。コルティ¹⁴ の器官の表面処理などの以前の方法では、脳底膜の長さに沿った有毛細胞の喪失のマップが提供されましたが、組織を解剖してコルティの臓器を明らかにしたため?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423