脱細胞化気管移植片のための低線量ガンマ線滅菌

要約

気管組織移植には滅菌が不可欠です。ここでは、臓器に完全に耐えられる低線量ガンマ線照射を使用した滅菌プロトコルを提示します。

要約

移植が正しく進化することを確実にするための主な重要な側面の1つは、培地の無菌性です。脱細胞化気管移植では、もともと環境と接触していた臓器を移植するため、最初から無菌ではありません。脱細胞化プロトコル(洗剤博覧会[2%ドデシル硫酸ナトリウム]、連続攪拌、浸透圧ショックによる)は無菌対策に沿って実施されますが、滅菌は提供されません。したがって、主な課題の1つは、 in vivo 移植前の無菌性を確保することです。無機材料には確立されたガンマ線滅菌プロトコルがありますが、有機材料にはそのような対策はありません。さらに、確立された放射線量(25 kGy)はインプラントを完全に破壊するため、無機材料に対して実施されているプロトコルを有機材料に適用することはできません。この論文は、脱細胞化ウサギ気管における放射線量の増加の影響を研究しています。用量範囲(kGy)を維持し、滅菌が達成される最小用量が見つかるまで、漸増用量をテストしました。用量を決定した後、組織学的および生体力学的に臓器への影響を研究しました。0.5 kGyは無菌性を達成しなかったが、1 kGyと2 kGyの両方の用量は無菌性を達成し、したがって1 kGyが滅菌を達成するために必要な最小用量であると判断した。顕微鏡研究では、滅菌されていない臓器と比較して関連する変化は示されませんでした。軸方向の生体力学的特性はまったく変化せず、臓器が放射状に耐えることができる単位長さあたりの力のわずかな減少のみが観察されました。したがって、1 kGyは、臓器への影響が最小限であるとしても、脱細胞化ウサギ気管の完全な滅菌を達成すると結論付けることができます。

概要

インプラントの滅菌は、その実行可能性の基本的な必要条件です。実際、成功していることが証明されているプロテーゼは、無菌領域(血管、心臓、骨など)に埋め込まれたものです。¹.気管には、外部環境と接触する表面(したがって無菌ではない)と縦隔に向かう表面(無菌)の2つの表面があります。したがって、気管が抜去された瞬間から、それは無菌臓器ではありません。その後の脱細胞化プロセスが最大の無菌条件下で行われているにもかかわらず、それは滅菌工程²ではない。異物の移植自体は、^{それが生成する}細菌微小環境による感染のリスクを伴います3 そして、材料が滅菌されていても、ドナーからレシピエントへの病気の伝染のリスクは最大0.014%^です4。気管の正しい血管新生を確実にするために、ほとんどすべての実験的移植プロトコルにおいて、それは最初に無菌領域(筋肉、筋膜、大網、皮下など)に異所性インプラント^5,6,7を受ける。これは、この培地に非滅菌要素を移植すると、領域³の感染につながるためです。

プロトコル

実験動物の世話と使用に関する欧州指令20170/63 / EUが遵守され、研究プロトコルはバレンシア大学の倫理委員会によって承認されました(スペインのバレンシア政府の法律86/609 / EECおよび214/1997およびコード2018 / VSC / PEA / 0122タイプ2)。

1.気管脱細胞化

注:脱細胞化法は他の場所で報告されている²⁰。

1. 辺縁耳静脈からの200 mg / mL注射を使用して、体重3.5〜4.1 kg、133 mg / kgのペントバルビタールナトリウムでドナーのオスの成体ニュージーランド白ウサギ(Oryctolagus cuniculus)を安楽死させます。
2. 無菌状態を確保しながら、中央縦頸部切開を行い、頸部筋を解剖し、気管にアプローチします。臓器を円周方向および縦方向に解剖します。最後に、最初のリングの下とカリーナのすぐ上を通過します。
3. メスで、気管を2 cmの小片に分割します。ハサミで周囲の結合組織と粘膜内層⁶を取り除く。
4. 2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、5%ペニシリン-ストレプトマイシン、および5%アムホテリシンBを含む12mLのリン酸緩衝生理食塩水(PB....

結果

脱細胞化
DAPI染色はDNAの不在を示し、電気泳動によっていずれの気管においても50ngを超えるDNA値は検出されず、すべての断片が200bp^{未満であった20}。

微生物培養
0.5 kGyに供した8個のうち2個は1週間以内に色変化を示した。1 kGyと2 kGyで照射された破片はいずれも色の変化を示さなかった(図1)。

ディスカッション

存在するいくつかの滅菌戦略があります。超臨界_CO2は組織に完全に浸透し、培地を酸性化し、インプラント^の減圧による単純な除去で細胞リン脂質二重層を分解する8、^14、25。紫外線も使用されており、げっ歯類の気管におけるその有効性は発表されているが、文献¹⁰には少数の報告しかない。使.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 nylon monofilament suture	Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA	SN-5698G
Amphotericin B 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15290018
Bioanalyzer	Agilent, Santa Clara, CA, USA	G2939BA
Buprenorphine	Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido	N02AE01
Compression desktop UTM	Microtest, Madrid, Spain	EM1/10/FR
Cryostate	Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania	CM3059
DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole)	DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA	D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich; MO, USA	D2650
DMEM	Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA	11965084
DNA extraction kit	DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany	4368814
Enrofloxacin, 2.5%	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	0035-0002
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain	SH20898.03IR
Fluorescence microscope	Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany)	DM2500??
Freezing Container	Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain	5100-0001
Isofluorane	Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain	8.43603E+12
Ketamin	Imalgene. Merial; Toulouse, Francia	BOE127823
Linear accelerator	"True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA	H191001
Magnetic stirrer	Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia	BS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/ml	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	6283-MV
OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Fischer Scientific, Madrid, Spain	12678646
Penicillin-streptomycin 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15140122
Pentobarbital sodium	Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España	3.60587E+12
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	P2272
Propofol	Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania	G 151030
Proteinase K	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA	S3020
PVC hollow tubes	Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy	hhdddyyZ
PVC stent	ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey	019 5305 1
R software, Version 3.5.3 R Core	R Foundation for Statistical Computing	R 3.5.3
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	8,17,034
Spectrophotometer	Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands	ND-ONEC-W
Spreadsheet	Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA	2864993241
Traction Universal Testing Machine	Testing Machines, Veenendaal, Netherlands	84-01
UTM Software	TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA	100-093-627 F
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Labs, Burlingame; CA; USA	H-1000-10
Xylacine	Xilagesic. Calier; Barcelona, España	20102-003