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要約

トマトの種子は、植物の繁殖中の遺伝学と発生生物学を研究するための重要なモデルです。このプロトコルは、さまざまな発生段階でトマトの種子をきれいにして、より細かい胚構造を観察するのに役立ちます。

要約

トマト(Solanum lycopersicum L.)は、世界中の主要な換金作物の1つです。トマトの種子は、植物の繁殖中の遺伝学と発生生物学を研究するための重要なモデルです。トマト種子内のより微細な胚構造の可視化は、種皮粘液、多細胞層外皮、および厚肉胚乳によって妨げられることが多く、これは面倒な埋め込み切片によって解決する必要があります。より簡単な代替案は、化学薬品を使用して種子をほぼ透明にする組織透明化技術を採用することです。従来のクリアリング手順では、より薄い種皮で小さな種子を深く洞察することができますが、トマトの種子のクリアは、特に発育後期段階では、技術的に引き続き困難です。

ここに提示されているのは、胚の形態がほぼ完了する開花後3日から23日までのトマト種子の発達を観察するための迅速で省力化のクリアリングプロトコルです。この方法は、 シロイヌナ ズナで広く用いられている抱水クロラール系清澄液に、ホルマリン-アセト-アルコール(FAA)固定の省略、種子の次亜塩素酸ナトリウム処理の添加、軟化した種皮粘液の除去、洗浄・減圧処理などの改良を加えたものです。この方法は、さまざまな発生段階でトマト種子を効率的に除去するために適用でき、良好な空間分解能で変異種子の発生過程を完全に監視するのに役立ちます。このクリアリングプロトコルは、ナス科の他の商業的に重要な種のディープイメージングにも適用できます。

概要

トマト(S. lycopersicum L.)は、世界で最も重要な野菜作物の1つであり、2020年には510万ヘクタールから1億8,680万トンの肉質の果物が生産されています1。ナス、ピーマン、ジャガイモ、タバコなどの多くの商業的に重要な作物を含む、約2,716種2の大きなナス科に属しています。栽培トマトは二倍体種(2n = 2x = 24)で、ゲノムサイズは約900 Mb3です。長い間、野生のナス属から望ましい形質を選択することにより、トマトの家畜化と育種に多大な努力が払われてきました。トマト遺伝学リソースセンターには5,000を超えるトマトのアクセッションがリストされており、世界中で80,000を超えるトマトの生殖質が保管されています4。トマト植物は温室内で多年生であり、種子によって繁殖します。成熟したトマト種子は、完全に成長した胚、残留細胞型胚乳、および硬い種皮の3つの主要な区画で構成されています5,6(図1A)。二重受精後、細胞型胚乳の発生は接合子の発生に先行する。開花後~5~6日(DAF)に、胚乳が6〜8個の核7からなるときに2細胞前胚が最初に観察される。Solanum pimpinellifoliumでは、胚は20 DAF後に最終サイズに近づき、種子は32 DAF8の後に発芽するために生存可能です。胚が成長するにつれて、胚乳は徐々に吸収され、少量の胚乳だけが種子に残ります。残留胚乳は、幼根先端を囲む小毛洞胚乳と、種子の残りの部分の外側胚乳9,10からなる。外側の種皮は、外皮の肥厚して木化した外側表皮から発達し、外皮の残骸の死んだ層とともに、胚と胚乳を保護するために硬い殻を形成します5。

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図1:ソラナム・リコペルシカムとシロイヌナズナの成熟種子の模式図。 (A)成熟トマト種子の縦断的解剖学的構造。(B)成熟したシロイヌナズナ種子の縦断的解剖学的構造。成熟したトマトの種子は、シロイヌナズナの種子の約70倍の大きさです。スケールバー = (A) 400 μm、(B) 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

高品質のトマト種子の生産は、胚、胚乳、および母体の種子成分間の調整に依存します11。種子発生における重要な遺伝子とネットワークを解剖するには、変異種子の深くフルトラックの表現型記録が必要です。半薄切片やパラフィン切片などの従来の包埋切片技術は、胚の局所的で微細な構造を観察するためにトマト種子に広く適用されています12、13、14、15。ただし、薄い切片からシードの発達を分析することは通常面倒であり、z軸の空間分解能が不足しています。それに比べて、組織クリアリングは、発生する可能性が最も高い胚の欠陥の発生段階を特定するための迅速かつ効率的な方法です16。透明化方法は、1つ以上の生化学物質16で屈折率を均質化することによって内部組織の不透明さを低減する。全組織クリアリングは、その完全性を損なうことなく植物組織構造の観察を可能にし、クリアリング技術と3次元イメージングの組み合わせは、植物器官の形態および発生状態に関する情報を得るための理想的なソリューションとなっている17,18。長年にわたり、種子除去技術は、シロイヌナズナ、尋常性ホルデウム、および尋常性ベータ19,20,21,22,23を含む様々な植物種で使用されてきた。これらのうち、ホールマウント胚珠除去技術は、サイズが小さく、種皮細胞の4〜5層、および核型胚乳24,25のために、シロイヌナズナの種子発達を研究するための効率的なアプローチでした。Hoyerの溶液26の出現など、さまざまな透明混合物の継続的な更新により、大麦胚珠の内部構造は、その胚乳が種子の大部分を占めているにもかかわらず、高度な明瞭さで画像化されました。テンサイの胚形成は、減圧処理と塩酸19を組み合わせた透明化によって観察できます。それにもかかわらず、上記の種とは異なり、トマト種子のプロトコルをクリアすることによる発生学的観察は報告されていません。これにより、トマトの胚発生と種子発生の詳細な調査が妨げられます。

抱水クロラールは、浸漬された組織および細胞を異なる光学面上に表示させることを可能にし、細胞または組織成分を実質的に保存する透明化溶液として一般的に使用される27、28、29。抱水クロラールベースのクリアリングプロトコルは、シロイヌナズナの胚と胚乳を観察するための種子のホールマウントクリアリングに使用されています21,28。しかし、この清澄化液は、シロイヌナズナの種子よりも不浸透性であるトマトの種子の除去には効率的ではありません。物理的障壁には、(1)トマトの外皮は3〜15 DAF 30,31で約20の細胞層を有する、(2)トマトの胚乳は核型ではなく細胞型である32、(3)トマト種子のサイズは約70倍大きい33,34、(4)大量の種皮粘液を生成し、透明化試薬の浸透をブロックし、胚細胞の可視化に影響を与える。

そこで本報告では、トマト種子をさまざまな段階で全マウントで除去するための最適化された抱水クロラールベースの透明化方法を提示し、胚発生過程の深部イメージングを可能にします(図2)。

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プロトコル

1.溶液の調製

  1. 50 mLの遠沈管に2.5 mLの37%ホルムアルデヒド、2.5 mLの氷酢酸、および45 mLの70%エタノールを加えて、FAA固定液を調製します。ボルテックスし、4°Cで保存します。 使用直前にFAA固定液を新たに調製してください。
    注意: 37%ホルムアルデヒドは腐食性であり、暴露または吸入すると発がん性がある可能性があります。固定剤は、適切な個人用保護具を着用しながら、ヒュームフード内で実行する必要があります。
  2. スズ箔で包んだ100 mLのガラス瓶に5 mLの100%グリセロール、40 gの抱水抱き水、および10 mLの蒸留水を加えて、透明溶液を調製します。マグネチックスターラーを用いて室温で一晩溶解する。調製した溶液は、4°Cで最大6ヶ月間保存できます。
    注意: 抱水クロラールは発がん性があり、刺激臭があります。ドラフトで実験を行い、適切な個人用保護具を着用してください。抱水クロラールは空気中で潮解しやすく、大量に保管しないでください。透明溶液は光にさらされると分解する可能性があるため、光から遠ざける必要があります。
  3. 50 mLの遠沈管に10 mLの6%次亜塩素酸ナトリウム、40 mLの蒸留水、および50 μLのTween-20を加えて消毒液を調製します。渦巻き、室温で保管します。使用直前に消毒液を新たに調製してください。
    注:長期間配置された次亜塩素酸ナトリウムの有効塩素含有量は減少し、実際の状況に応じて6%次亜塩素酸ナトリウムの含有量を増やすことができます。

2.種子収集

  1. トマトの種を蒔きます(S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom、 材料表を参照)花の栄養土壌と基質(v / v)の1:1の混合物で満たされた8 cm×8 cm×8 cmの正方形の盆地( 材料の表を参照)、24 ± 2 °C(日)および18 ± 2 °C(夜)で16/8時間の明暗期間の成長室で成長します。 60%〜70%の相対湿度、および4,000ルクスの光強度。 約6週間後、植物は開花期に入りました。
  2. 独立した花の開花日を開花時にタグ付けし(花びらの開口角度は90°)、開花の翌日(DAF)を記録します。
  3. 3〜23個のDAFトマト植物から果物を収穫し、すぐに氷の上に置きます。果物(種子または胚)を3〜23 DAFから初期(3〜10 DAF)、中期(11〜16 DAF)、および後期(17〜23 DAF)の果物(種子または胚)に分けます。
    注意: 一度に多くの果物を集めすぎず、各果物の種子がさらなる処理のために1時間以内に剥がされることを確認してください。
  4. 初期の果物の場合は、果物を割ってスライドに置き、実体顕微鏡( 材料の表を参照)の下で1倍から4倍の倍率で精密鉗子で新鮮な種子を注意深く収集します。中期および後期の果物の場合は、果物を壊し、精密鉗子を使用して新鮮な種子を直接収集します。

3.抱水クロラールベースの種子の除去

注:この研究では、従来の35 プロトコルと最適化されたプロトコルを、種子の除去効率について比較しました。

  1. 従来のプロトコルを使用したクリアリング
    1. 新鮮な種子(ステップ2.4で得られた)を1.5 mLのFAA固定液を含む2 mLの遠沈管に直ちに入れ、オービタルシェーカー(5 rpm、 材料表を参照)で室温で4時間インキュベートします。
    2. これらの種子を70%、95%、および100%エタノール(v / v)のエタノールシリーズで、オービタルシェーカー(5 rpm)でそれぞれ1時間脱水します。
    3. スライド上の3〜5滴の透明化溶液(~100 μL)にシードを置き、カバーガラスでサンプルをそっと覆います。スライドを、中期および後期の種子用の単一の凹型スライド( 材料表を参照)に置き換えます。
    4. これらのスライドまたは単一の凹型スライドを室温で30分間(3 DAF)、2時間(6 DAF)、1日(9 DAF)、3日(12 DAF)、または7日間(14〜22 DAF)シード材料の開発段階に応じて保管します(材料が若いほど、クリア速度が速くなります)。
    5. デジタルカメラを搭載した微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡( 材料表を参照)で、10倍、20倍、40倍の倍率でサンプルを観察します。透過光の明るさ、DICスライダー、コンデンサーの絞りをサンプルごとにリアルタイムで調整・最適化し、画像をキャプチャします。
  2. 最適化されたプロトコルを使用したクリア
    1. 新鮮な種子(ステップ2.4で得られた)を、1.5 mLの消毒液を含む2 mLの遠沈管に直接入れます(ステップ1.3)。
      注:2 mL遠心チューブに収集される種子の数は、種子の発育段階によって異なります。詳細を 表1に示します。
    2. サンプルをオービタルシェーカー(30 rpm)で室温で3〜50分間、最も内側の種皮の輪郭がはっきりと見えるまでインキュベートします。消毒液を廃棄します。
      注:必要なインキュベーション時間は、種子の発育段階によって異なります(シードが遅いほど、インキュベーション時間は長くなります)。詳細を 表1に示します。
    3. 中期および後期の種子の場合は、種子をスライドに移し、実体顕微鏡で1倍から4倍の倍率で鉗子と解剖針で種子粘液を取り除きます。鉗子を使用して種子を元の遠心チューブに戻します。
      注:この手順は、初期のシードには必要ありません。
    4. 種子を1.5 mLの脱イオン水で5回、毎回10秒洗浄します。脱イオン水を廃棄します。
    5. 種子の体積の2×の透明化溶液を加え、続いて真空ポンプで0〜50分間真空処理します(表1)。間欠真空処理は、各真空処理を10分間隔で10分間隔で行う。
    6. 種子の2×量の新鮮な透明化溶液と交換してください。種子を入れた2 mL遠沈管を室温に保ち、透明化を容易にするために30分から7日間光から保護します(表1)。孵卵中、後期胚の場合は、毎日透明化溶液を新鮮な溶液に交換し、種子を10分間真空処理します。
    7. クリアした種子をスライドまたは単一凹スライドに準備し、デジタルカメラを搭載したDIC顕微鏡で10倍、20倍、40倍の倍率で観察します。透過光の明るさ、DICスライダー、コンデンサーの絞りをサンプルごとにリアルタイムで調整・最適化し、画像をキャプチャします。

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結果

シロイヌナズナのように従来の方法でトマトの種子を駆除すると、密な胚乳細胞が3DAFと6DAFで初期トマト胚の可視化を妨げました(図3A、B)。胚の総体積が増加するにつれて、球状胚は9DAFでほとんど区別できませんでした(図3C)。しかし、種子のサイズが大きくなり続けるにつれて、その透過性は減少し、12 DAFでぼやけた心臓胚が?...

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ディスカッション

機械的切片化と比較して、透明化技術は、植物組織または器官の完全性を保持するので、三次元イメージングにとってより有利である16。従来の清澄処理プロトコルは、化学溶液の浸透が容易であるため、小さなサンプルに限定されることがよくあります。トマト種子は、シロイヌナズナの種子の約70倍の大きさで、透過性障壁が高いため、組織透明化に問題のあるサ...

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開示事項

著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

著者らは、微分干渉コントラスト顕微鏡法と従来の透明化法に関する有益な提案をしてくれたJie Le博士とXiufen Song博士に感謝しています。この研究は、中国国家自然科学財団(31870299)と中国科学院青年イノベーション振興協会から資金提供を受けました。図 2 は BioRender.com で作成されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,000 µL pipetteGILSONFA10006M
1,000 µL pipette tipsCorningT-1000-B
2 ml centrifuge tubeAxygenMCT-200-C
37% formaldehydeDAMAO685-2013
5,000 µL pipetteEppendorf3120000275
5,000 µL pipette tipsbiosharpBS-5000-TL
50 ml centrifuge tubeCorning430829
Absolute EthanolBOYUAN678-2002
Bottle glassFisherFB800-100
Chloral HydrateMeryerM13315-100G
CoverslipLeica384200
DIC microscopeZeissAxio Imager A110x, 20x and 40x magnification
DisinfectantQIKELONGAN17-9185
Dissecting needleBioroyee17-9140
Flower nutrient soilFANGJIE
ForcepsHAIOU4-94
Glacial Acetic AcidBOYUAN676-2007
GlycerolSolarbioG8190
Magnetic stirrerIKARET basic
Micro-TomTomato Genetics Resource CenterLA3911
Orbital shakerQILINBEIERQB-206
Seeding substratePINDSTRUPLV713/018-LV252Screening:0-10 mm
Single concave slideHUABODEYIHBDY1895
SlideLeica3800381
StereomicroscopeLeicaS8 APO1x to 4x magnification
Tin foilZAOWUFANG613
Tween 20SigmaP1379
Vacuum pumpSHIDINGSHB-III
Vortex meterSilogexMX-S

参考文献

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