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Summary

このプロトコルは、流体の流れ方向に沿って形状を変化させるマイクロ流体チャネルを使用して、3Dコラーゲンヒドロゲル(厚さ<250 μm)内の繊維を整列させるための伸長ひずみ(伸張)を生成する方法を示します。結果として得られるアライメントは数ミリメートルにまたがり、伸張ひずみ速度の影響を受けます。

Abstract

整列コラーゲンI(COL1)繊維は、腫瘍細胞の運動性を導き、内皮細胞の形態に影響を与え、幹細胞の分化を制御し、心臓および筋骨格組織の特徴です。 in vitroで整列した微小環境に対する細胞応答を研究するために、磁気的、機械的、細胞ベース、およびマイクロ流体法を含む、定義されたファイバー整列を有するCOL1マトリックスを生成するためのいくつかのプロトコルが開発されている。これらのうち、マイクロ流体アプローチは、流体の流れや細胞の微小環境を正確に制御するなどの高度な機能を提供します。しかし、高度な in vitro 培養プラットフォーム用に整列したCOL1マトリックスを生成するためのマイクロ流体アプローチは、500 μm未満の距離に伸びるCOL1繊維の薄い「マット」(厚さ<40 μm)に限定されており、3D細胞培養アプリケーションに役立ちません。ここでは、マイクロ流体デバイス内で定義されたファイバーアライメントのミリメートルスケール領域を持つ3D COL1マトリックス(厚さ130〜250 μm)を作製するためのプロトコルを紹介します。このプラットフォームは、細胞培養用のマイクロエンジニアリングマトリックスへの直接アクセスを提供することにより、構造化された組織の微小環境をモデル化するための高度な細胞培養機能を提供します。

Introduction

細胞は細胞外マトリックス(ECM)と呼ばれる複雑な3D線維ネットワークに存在し、その大部分は構造タンパク質コラーゲンI型(COL1)1,2で構成されています。ECMの生物物理学的特性は細胞にガイダンスの手がかりを提供し、それに応じて、細胞はECMマイクロアーキテクチャを再構築します3、4、5。これらの相互細胞-マトリックス相互作用は、腫瘍環境7,8,9における血管新生および細胞浸潤を促進し、細胞形態10,11,12、分極13、および分化14に影響を与える整列したCOL1ファイバードメイン6を生じ得る。整列したコラーゲン線維はまた、創傷治癒15を促進し、組織発達において重要な役割を果たし16、および長距離細胞コミュニケーションに寄与する17,18。したがって、ネイティブCOL1ファイバーマイクロアーキテクチャをin vitroで複製することは、整列した微小環境に対する細胞応答を研究するための構造化モデルの開発に向けた重要なステップです。

マイクロ流体細胞培養システムは、マイクロ生理学的システム(MPS)を開発するための好ましい技術として確立されています19,20,21,22,23。有利なマイクロスケールスケーリング効果を活用して、これらのシステムは流体の流れを正確に制御し、機械的力の制御された導入をサポートし、マイクロチャネル21、24、25、26、27内の生化学的微小環境を定義します。MPSプラットフォームは、組織特異的微小環境をモデル化し、多臓器相互作用を研究するために使用されています28。同時に、ヒドロゲルは、インビボで観察されるECMの3D力学および生物学的影響を再現するために広く探求されてきた29,30。 3D培養とマイクロ流体プラットフォームの統合にますます重点が置かれているため、多くのアプローチがマイクロ流体デバイス31、32、33でCOL1ヒドロゲルを組み合わせることができます。しかし、COL1ヒドロゲルをマイクロ流体チャネルに整列させる方法は、幅<1 mmのチャネルの薄い2D「マット」(厚さ<40 μm)に限定されており、整列した3D微小環境で細胞応答をモデル化する可能性は限られています31,34,35,36。

マイクロ流体システムにおいて整列した3D COL1ヒドロゲルを達成するために、自己組織化COL1溶液が局所的な伸長流(流れ方向に沿った速度変化)にさらされると、得られたCOL1ヒドロゲルは、それらが経験する伸長ひずみ速度の大きさに正比例する繊維配向の程度を示すことが示されている37。38。このプロトコルのマイクロチャネル設計は、2つの点で独特です。第1に、セグメント化された設計により、COL1ソリューションに局所的な伸張ひずみが導入され、第2に、その「ツーピース」構造により、ユーザーはCOL1ファイバーを整列させてからチャネルを分解して、整列したファイバーにオープンフォーマットで直接アクセスできます。このアプローチは、秩序あるCOL1マトリックスを持つ微小生理学的システムを開発するモジュラーマイクロ流体プラットフォームの開発にさらに採用できます。以下のプロトコルは、セグメント化されたマイクロチャネルを作製するプロセスについて説明し、ウシアテロCOL1を整列させるためのチャネルの使用を詳述しています。このプロトコルでは、オープンウェル形式でCOL1上の細胞を培養するための手順も提供し、モジュール式の磁気ベース層を使用してプラットフォームに機能を追加する方法について説明します。

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Protocol

1. 2ピースチャンネルとモジュラープラットフォームベースの製作

注:マイクロ流体チャネルは、定義された厚さのポリジメチルシロキサン(PDMS)シートからかみそりでカットされたマイクロ流体チャネル「カットアウト」と、カットアウトに可逆的に結合してチャネルを形成するチャネルカバーの2つの部分で構成されています。チャネルは、媒体リザーバーとして機能するポリメタクリル酸メチル(PMMA)フレームに囲まれています(図1)。PMMAフレームは、機能を追加するために特殊なモジュールを磁気的にラッチするためにも使用できます。

  1. PDMSシートからのカミソリ切断チャンネル:
    注:この手順のマイクロ流体チャネルの設計は、 補足図1に記載されています。チャネルは、それぞれ長さ5 mm、幅10 mm、5 mm、2.5 mm、1.25 mm、および0.75 mmの5つのセグメントで構成されています。一定の流速(50-400 μL·min−1)で注入されたコラーゲン溶液の速度は、チャネル幅が小さくなって伸長流を生成するにつれて、チャネルに沿って局所的に増加します。
    1. 厚さ250μmのPDMSシートをプラスチックキャリアシートに取り付け、クラフトカッターを使用して刃深さ0.5mm、速度1cm・s−1 、高力でマイクロ流体設計をかみそりカットします。
    2. 超音波浴を使用して、マイクロ流体チャネルの切り欠きを5分間洗浄します。超音波処理されたチャネルを脱イオン(DI)水ですすぎ、5分間100°Cのきれいなホットプレートで乾燥させます。
    3. 使用するまで、チャネルを清潔で蓋をしたペトリ皿に保管します。
  2. PDMSカバーと表面パッシベーションの製作:
    注意: セクション1.1のチャネルカットアウトには、COL1溶液を注入できる密閉型チャネルを作成するために、その上に配置できるカバーが必要です(補足図1)。カバーは、COL1が自己組織化された後に取り外すことができます。チャネル内のCOL1がカバーに結合する可能性を最小限に抑えるために、ウシ血清アルブミン(BSA)を使用してカバーを不動態化します。PDMSカバーの金型設計を提供します。金型の厚さは少なくとも2 mmで、マイクロ流体チャネルカットアウトのフットプリントに等しいフットプリントが必要です。このプロトコルでは、金型フットプリントは35 mm x 15 mmでした。
    1. 金型を準備するには、厚さ2.5mmのPMMAシートに粘着剤(PSA)のシートを貼り付け、目的の金型形状をレーザーカットします。
    2. レーザーカットされたPMMAモールドを広告で清掃しますamp、糸くずの出ないワイプ、PSAフィルムから裏地を取り除きます。金型を直径100mmのシリコンウェーハbtにしっかりと押し下げます。
    3. PDMSを10:1の比率で調製します(ベース:架橋剤)。適切な混合を確実にするために1分間激しく混合し、真空チャンバー内で混合物を脱気して気泡を除去します。
    4. 脱気したPDMS溶液をPMMA/シリコンモールドに注ぎ、ホットプレート上で100°Cで20分間硬化させます。金型を冷まし、硬化したPDMSを取り外し、かみそりの刃で余分なものを取り除きます。
      注意: 以下のすべての手順で、PDMSカバーのシリコンウェーハの側面(平らな側)が上を向いていることを確認してください。
    5. 直径1mmの生検パンチを使用して、マイクロ流体チャネルの端に対応する入口穴と出口穴を作成します。ステップ1.1のチャンネルカットアウトは、穴の位置をガイドするためのテンプレートとして使用できます。
    6. カバーをイソプロパノール(IPA)で5分間超音波処理し、DI水ですすぎ、圧縮空気源で乾燥させてから、清潔で蓋をしたペトリ皿に保管します。ペトリ皿をUV滅菌チャンバー(蓋なし)に1分間入れて滅菌します。
    7. カバーしてバイオセーフティキャビネット(BSC)に移します。
    8. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の40 mg•mL-1 ウシ血清アルブミン(BSA)300 μLをPDMSカバーにピペットし、ピペットチップを使用して溶液を均等に広げます。使用前に4°Cの冷蔵庫に少なくとも4時間入れてください。
    9. カバーを冷蔵庫からBSCに移動し、1x PBSで5回洗浄し、空気中で10分間乾燥させます。
      注意: PDMSカバーは、BSAでコーティングした後、最大1週間冷蔵庫に保管できます。
  3. カバーガラスのグルタルアルデヒド処理
    注:カバーガラスをグルタルアルデヒドで機能化すると、COL1がカバーガラスに共有結合し、ヒドロゲルの剥離を防ぎます。
    1. 1 mLのAPTESを49 mLのアセトンに加えることにより、ガラスビーカー中の2%(v / v)アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)溶液を調製します。
    2. 25%グルタルアルデヒド溶液をDI水で5%に希釈します。24 mm x 50 mmのカバーガラスごとに2 mLの溶液を作ります。24 mm x 24 mmまたは22 mm x 22 mmのカバーガラスの場合は、それぞれ1 mLの溶液を作ります。
    3. IPAを使用してバス超音波処理器のカバーガラスを5分間清掃します。DI水を使用してカバーガラスからIPAを洗い流します。IPAは、カバーガラスに滑らかな水の膜が見られると完全にすすがれます。
    4. カバーガラスをホットプレートで100°Cで5分間乾燥させます。 乾燥したカバーガラスをきれいなペトリ皿に入れ、重ならないようにします。
    5. コロナ放電ワンドを使用して、カバーガラスをコロナ放電にそれぞれ1分間さらします。
      注意: この手順は、換気の良い場所または化学フードで実行する必要があります。
    6. ペトリ皿からカバーガラスを取り外し、コロナ曝露から10分以内に5秒間APTES溶液に浸し、カバーガラスが水没していることを確認します。
      注意: どちら側がプラズマで処理されたかを追跡し、上を向いていることを確認してください。
    7. 次に、カバーガラスをアセトンに10秒間浸し、圧縮空気で乾燥させます。乾いたカバーガラスをペトリ皿に戻し、処理面を上に向けて置きます。
      注意: すべてのカバーガラスに対して手順1.3.5〜1.3.7を繰り返します。
    8. グルタルアルデヒド溶液1 mLを各カバーガラスの表面にピペットで貼り付けます。溶液がカバーガラスの端からこぼれないように、できるだけ多くの表面を覆います。必要に応じてさらにグルタルアルデヒド溶液を添加することができる。ピペットチップで表面を傷つけないように注意してください。
    9. カバーガラスを溶液に30分間接触させてから、DI水で20秒間すすぎます。圧縮空気を使用してカバーガラスを乾燥させ、プラズマ処理された面を上にしてペトリ皿に戻します。
      注意: カバーガラスは、室温(RT)で最大1週間保存できます。
  4. モジュラー磁気ベースのレーザー切断
    注意: モジュラー磁気ベースの設計は、補足図1に記載されています。モジュラーベースは、メディアを保持するためのウェルとして機能し、以前に公開された作品22、37、38、39に記載されているように、特殊なモジュールを磁気的に取り付けるためにも使用できます。
    1. パス数や出力などの適切なレーザー設定を使用して、PMMA層からデザインを切り取ります。
      注意: 磁石をPMMA層に圧入できるように、レーザー設定を調整する必要があります。各レーザーは異なり、カットパラメータは実験的に最適化する必要があります。45 Wレーザーの場合、2 mmから2 mmの厚さのPMMAを切断するには、100%の速度、100%の出力、および3パスが推奨されます。
    2. 石鹸と水を使用してレーザーカット部分を洗浄し、レーザーカットプロセスから破片を取り除きます。
      注意: レーザーカット部品の洗浄に溶剤を使用しないでください。溶剤は、レーザーカットされたエッジにマイクロクラックの伝播をもたらす可能性があります。
  5. プラットフォームの組み立て
    1. 磁石(直径3/16、厚さ1/16)をレーザーカットされたベースに手で押し込みます。ソフトハンマーまたはドライバーの端を使用して、磁石を押し込むことができます。磁石の厚さは、磁石がベースの表面と同じ高さになるように、PMMAベースの厚さよりも小さくする必要があります。
      注意: 磁石を使用すると、ユーザーは追加のモジュールを取り付けることでプラットフォームに機能を追加できます。
    2. PSAシートから裏地をはがし、機能化された面を上に向けて、ベースをグルタルアルデヒド処理されたカバーガラスに取り付けます。
    3. PDMSチャンネルカットアウトをフレームで定義されたキャビティにそっと配置します。ワイドチップピンセットで押し下げて気泡を取り除き、コンフォーマルコンタクトを確保します。
    4. BSA 処理されたチャネルカバーを、BSA 側を下に向けてチャネルカットアウトの上に配置します。液体の入口ポートと出口ポートがチャネルと揃っていることを確認します。
    5. デバイスはCOL1インジェクションの準備ができています。

2. COL1溶液をマイクロチャネルに注入し、細胞培養アプリケーション用のカバーを取り外す

  1. COL1 ソリューションの準備
    1. 必要なすべての試薬(COL1ストック溶液[6 mg·mL−1]、超純水、10x PBS、0.1 M NaOH)をバイオセーフティキャビネット内の氷上に置きます。
    2. 次のように試薬の量を計算します
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4
      注:したがって、6 mg·mL-1ストックから1 mLの2.5 mg·mL-1中和コラーゲンを作るには、416.67 μLのコラーゲン、429.16 μLのDI水、100 μLの10x PBS、および54.16 μLの0.1 M NaOHを加えて、最終的なpHを7にします。0.1 M NaOHを20 μL添加し、pH 9.0を達成します。
    3. 試薬を空の 5 mL バイアルに次の順序で添加します:i) COL1 ストック、ii) DI 水、iii) 10x PBS、iv) 0.1 M NaOH。
      注:変位ピペットを使用してCOL1溶液を取り扱ってください。通常のピペットを使用すると、サンプルが大幅に失われ、最終溶液濃度が変動する可能性があります。
    4. 溶液のpHを目的のpH(通常は7〜9)に上げます。
  2. COL1溶液を注入する
    1. シリンジポンプ、冷却滅菌シリンジ、冷却中和COL1溶液、および滅菌20 G 90°角度チップルアーロックニードルをバイオセーフティキャビネットに入れます。COL1溶液をシリンジに入れ、気泡が発生しないように注意します。
    2. 90°20Gの針先をシリンジに取り付け、シリンジをシリンジポンプにロードし、針を下に向けて、COL1溶液で針をプライミングします。
    3. シリンジポンプを50〜2,000μL/minの必要な流量に設定します。
    4. 準備したPDMSチャンネル(セクション1)をラボジャックに置き、針と同じ高さにします。
    5. PDMSチャンネルの入口ポート(幅広側)に針を挿入します。~30 μLのCOL1滴が出口側に集まるまで、チャネルを注入します。
    6. ラボジャックを下げ、新しく充填されたチャネルから針をそっと分離します。
    7. すべてのチャネルがCOL1溶液で満たされるまで、手順2.2.5〜2.2.9を繰り返します。
    8. 新しく形成されたCOL1ゲルの脱水を防ぐために、DI水で飽和した清潔で糸くずの出ないワイプと一緒に、充填されたチャネルをペトリ皿に入れます。
    9. ペトリ皿を覆い、装填したチャンネルをインキュベーター(37°C、湿度95%)に2時間入れてから、剥離ステップを行います。
  3. ピールオフと培地平衡化
    1. ピンセットを使用してPDMSカバーを持ち上げて、重合したCOL1ゲルを露出させます。BSA処理により、COL1がカバーに付着するのを防ぎます。
    2. 650 μLのEGMをウェルに加えます。
    3. デバイスをインキュベーター(37°C、湿度95%)に最低4時間放置して、ゲルと培地を平衡化します。細胞を播種する前に培地を交換してください
  4. 細胞の播種
    1. 温かい0.25%トリプシンと培地を、必要な数の5 mLおよび10 mLピペットとともにバイオセーフティキャビネットに入れます。
    2. ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を内皮増殖培地(EGM)中で80%コンフルエントに培養し、37°C、湿度95%で培養する。HUVECsを含む組織培養フラスコを顕微鏡でコンフルエントを確認した後、BSCに入れます。
    3. T25フラスコ内の培地を廃棄し、1x PBSで細胞を2倍洗浄します。フラスコに1 mLのトリプシンを加え、インキュベーター(37°C、湿度95%)に3分間入れます。
    4. 3分後に顕微鏡下でフラスコをチェックして、細胞が表面から完全に剥離していることを確認します。
    5. 3 mLのEGM(血清を含む)をフラスコに加えて、トリプシンを中和します。次に、5 mLピペットを使用して細胞溶液を15 mLコニカルチューブに移します。細胞を含むコニカルチューブを150 x g で5分間遠心分離します。
    6. 円錐形のチューブをバイオセーフティキャビネットに入れ、細胞ペレットを乱すことなく上清を廃棄します。細胞を1 mLの新鮮な培地に再懸濁します。
    7. 15 μLのトリパンブルーと15 μLの再懸濁した細胞溶液を1 mLのコニカルチューブに入れて混合します。
    8. 細胞計数スライドの両側にトリパンブルーと細胞溶液を注入し、スライドを細胞計数デバイスに挿入します。
    9. 内皮増殖培地中の細胞溶液を、細胞計数装置から得られた細胞濃度に基づいて必要な濃度に希釈する。
      注:80%コンフルエントなHUVECのT25フラスコは、1 mLの培地で希釈した場合、~750,000細胞·ml−1 を生成します。播種する細胞懸濁液の体積は、培養面の面積×細胞密度/細胞懸濁液の濃度として計算されます。例:35 mm x 15 mmのウェルに20,000個の細胞・cm−2 を播種するには、~140 μLの細胞懸濁液が必要です。
    10. 設計されたCOL1マトリックス上の媒体を吸引します。
    11. 必要量の細胞溶液をCOL1基板に加え、細胞を最低4時間沈降させてからイメージングします。
  5. 細胞核と細胞骨格の標識
    1. 細胞から培地を吸引し、1x PBS、各洗浄で500 μLで3回洗浄します。細胞層を4%パラホルムアルデヒドでRTで15分間覆います。
    2. パラホルムアルデヒドを吸引し、1x PBS Tween-20で5分間洗浄します。
    3. PBS中の500 μLの0.1%Triton-X溶液を使用して15分間細胞膜を透過処理します。1x PBSトゥイーン-20で5分間洗浄します。
    4. 非特異的結合部位をPBS中の500 μLの4% BSAでRTで30分間ブロックします。
    5. ファロイジン-アクチン蛍光標識溶液を4%BSAで希釈します(400 μLのBSAに1 μLのストック)。
    6. BSA溶液を吸引し、ファロイジン溶液を細胞に加え、RTで30分間待ちます。
    7. 核染色を4%BSA(500μLで1μL)で希釈し、ファロイジンを吸引し、作動中の核染色液を加え、RTで15分間待ちます。
    8. 核染色作業溶液を吸引し、PBS Tween-20でそれぞれ5分間3倍洗浄し、イメージング前に1倍PBSと交換します。
    9. 40倍レンズを備えたFITCチャネル(例:491 nm/em 516 nm)およびDAPIチャネル(例:360 nm/em 460 nm)を使用したエピ蛍光顕微鏡を使用した画像。488 nmレーザーライン(15%パワー)と40倍の水浸対物レンズを使用した反射率モードで、レーザー走査共焦点を使用してコラーゲンを画像化します。

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Results

自己組織化COL1溶液が断面積の減少を伴うチャネルを流れると、COL1溶液の流れ方向の速度(v x)は、2つのセグメント間のくびれの長さ(∂x)に沿って局所的に大きさ∂v x増加し、ε̇=∂v x/∂xの伸長ひずみ速度(ε̇)になります。伸張ひずみ速度は、図2に示すように、粒子画像速度測定(PIV)を使用して測定される流体速度から計算できます。

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Discussion

整列したファイバーでCOL1マトリックスを生成するためのプロトコルは、磁気的方法、機械的ひずみの直接適用、およびマイクロ流体技術を使用して説明されています47。マイクロ流体アプローチは、生化学的微小環境を正確に制御できる、明確に定義された流れと輸送特性により、マイクロ生理学的システムを作成するために一般的に使用されます。整列したCOL1ファイバー...

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Disclosures

すべての著者は、競合する利益を宣言しません。

Acknowledgements

この研究の一部は、国立衛生研究所(授与番号R21GM143658)および国立科学財団(助成金番号2150798)によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも資金提供機関の公式見解を表すものではありません。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)Sigma Aldrich440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing TipJensen GlobalJG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated MagnetKJ MagneticsD31
3M (TC) 12X12-6-467MPDigiKey3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5%Signa Aldrich179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATERElectro-Technic Products12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa AesarVWRAAJ64100-09
Clear cast acrylic sheetMcMaster-Carr8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus TestedVWR45000-666
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CT-FIRE softwareLOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mLLonzaCC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mLVWRVWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50GraphtecCE LITE-50
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A DurometerMcMaster-Carr87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cellsThermo Fisher ScientificC0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher ScientificT10282
IsopropanolFisher ScientificA4154
Laser cutterFull Spectrum20x12 H-series
Microfluidics Syringe pumpNew Era Syringe PumpsNE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000EGilsonFD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Nutragen Bovine Atelo CollagenAdvanced BioMatrix5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4VWR70011044.00
PBS pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100Alfa AesarJ63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20USCUTTERGRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer SlipRestek22766.00
Silicon waferUniversity wafer452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 gVWRBDH9292-500G
Sylgard 184VWR102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352.00

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