長距離繊維配向によるマイクロエンジニアリング3Dコラーゲンヒドロゲル

要約

このプロトコルは、流体の流れ方向に沿って形状を変化させるマイクロ流体チャネルを使用して、3Dコラーゲンヒドロゲル(厚さ<250 μm)内の繊維を整列させるための伸長ひずみ(伸張)を生成する方法を示します。結果として得られるアライメントは数ミリメートルにまたがり、伸張ひずみ速度の影響を受けます。

要約

整列コラーゲンI(COL1)繊維は、腫瘍細胞の運動性を導き、内皮細胞の形態に影響を与え、幹細胞の分化を制御し、心臓および筋骨格組織の特徴です。 in vitroで整列した微小環境に対する細胞応答を研究するために、磁気的、機械的、細胞ベース、およびマイクロ流体法を含む、定義されたファイバー整列を有するCOL1マトリックスを生成するためのいくつかのプロトコルが開発されている。これらのうち、マイクロ流体アプローチは、流体の流れや細胞の微小環境を正確に制御するなどの高度な機能を提供します。しかし、高度な in vitro 培養プラットフォーム用に整列したCOL1マトリックスを生成するためのマイクロ流体アプローチは、500 μm未満の距離に伸びるCOL1繊維の薄い「マット」(厚さ<40 μm)に限定されており、3D細胞培養アプリケーションに役立ちません。ここでは、マイクロ流体デバイス内で定義されたファイバーアライメントのミリメートルスケール領域を持つ3D COL1マトリックス(厚さ130〜250 μm)を作製するためのプロトコルを紹介します。このプラットフォームは、細胞培養用のマイクロエンジニアリングマトリックスへの直接アクセスを提供することにより、構造化された組織の微小環境をモデル化するための高度な細胞培養機能を提供します。

概要

細胞は細胞外マトリックス(ECM)と呼ばれる複雑な3D線維ネットワークに存在し、その大部分は構造タンパク質コラーゲンI型(COL1)^1,2で構成されています。ECMの生物物理学的特性は細胞にガイダンスの手がかりを提供し、それに応じて、細胞はECMマイクロアーキテクチャを再構築します³、^4、5。これらの相互細胞-マトリックス相互作用は、腫瘍環境7,8,9における血管新生および細胞浸潤を促進し、細胞形態10,11,12、分極13、および分化¹⁴に影響を与える整列した^COL1ファイバ....

プロトコル

1. 2ピースチャンネルとモジュラープラットフォームベースの製作

注:マイクロ流体チャネルは、定義された厚さのポリジメチルシロキサン(PDMS)シートからかみそりでカットされたマイクロ流体チャネル「カットアウト」と、カットアウトに可逆的に結合してチャネルを形成するチャネルカバーの2つの部分で構成されています。チャネルは、媒体リザーバーとして機能するポリメタクリル酸メチル(PMMA)フレームに囲まれています(図1)。PMMAフレームは、機能を追加するために特殊なモジュールを磁気的にラッチするためにも使用できます。

1. PDMSシートからのカミソリ切断チャンネル:
   注:この手順のマイクロ流体チャネルの設計は、 補足図1に記載されています。チャネルは、それぞれ長さ5 mm、幅10 mm、5 mm、2.5 mm、1.25 mm、および0.75 mmの5つのセグメントで構成されています。一定の流速(50-400 μL·min⁻¹)で注入されたコラーゲン溶液の速度は、チャネル幅が小さくなって伸長流を生成するにつれて、チャネルに沿って局所的に増加します。
   1. 厚さ250μmのPDMSシートをプラスチックキャリアシートに取り付け、クラフトカッターを使用して刃深さ0.5mm、速度1cm・s⁻¹....

結果

自己組織化COL1溶液が断面積の減少を伴うチャネルを流れると、COL1溶液の流れ方向の速度(v x)は、2つのセグメント間のくびれの長さ(∂x)に沿って局所的に大きさ∂v x増加し、ε̇=∂v x/∂_xの伸長ひずみ速度(ε̇)になります。伸張ひずみ速度は、図2に示すように、粒子画像速度測定(PIV)を使用して測定される流体速度から計算できます。

ディスカッション

整列したファイバーでCOL1マトリックスを生成するためのプロトコルは、磁気的方法、機械的ひずみの直接適用、およびマイクロ流体技術を使用して説明されています⁴⁷。マイクロ流体アプローチは、生化学的微小環境を正確に制御できる、明確に定義された流れと輸送特性により、マイクロ生理学的システムを作成するために一般的に使用されます。整列したCOL1ファイバー.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)	Sigma Aldrich	440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip	Jensen Global	JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet	KJ Magnetics	D31
3M (TC) 12X12-6-467MP	DigiKey	3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5%	Signa Aldrich	179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER	Electro-Technic Products	12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar	VWR	AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested	VWR	45000-666
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
CT-FIRE software	LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL	Lonza	CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL	VWR	VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50	Graphtec	CE LITE-50
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer	McMaster-Carr	87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells	Thermo Fisher Scientific	C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T10282
Isopropanol	Fisher Scientific	A4154
Laser cutter	Full Spectrum	20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump	New Era Syringe Pumps	NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E	Gilson	FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen	Advanced BioMatrix	5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4	VWR	70011044.00
PBS pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100	Alfa Aesar	J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20	USCUTTER	GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip	Restek	22766.00
Silicon wafer	University wafer	452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g	VWR	BDH9292-500G
Sylgard 184	VWR	102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352.00