代謝産物生産に対するフタル酸ジ(2-エチルヘキシル)の影響を研究するためのアルファルファ根滲出液の収集

要約

根の滲出液の分泌は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルでは、非標的メタボローム分析 を介して アルファルファに対する生体異物の影響を評価する方法について説明します。

要約

根の滲出液は、植物の根と周囲の環境との間の情報通信とエネルギー伝達の主要な媒体です。根の滲出液の分泌の変化は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルは、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入して、フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)が代謝産物産生に与える影響を研究することを目的としています。まず、水耕栽培実験においてアルファルファ苗をDEHPストレス下で生育させる。次に、植物を50mLの滅菌超純水を含む遠沈管に6時間移し、根の滲出液を採取します。次いで、溶液を真空凍結乾燥機中で凍結乾燥する。凍結サンプルを抽出し、ビス(トリメチルシリル))トリフルオロアセトアミド(BSTFA)試薬で誘導体化します。続いて、誘導体化された抽出物は、飛行時間型質量分析計(GC-TOF-MS)と組み合わせたガスクロマトグラフシステムを使用して測定されます。取得した代謝物データは、バイオインフォマティクス手法に基づいて分析されます。根の滲出液を考慮してアルファルファに対するDEHPの影響を明らかにするために、異なる代謝産物と有意に変化した代謝経路を深く調査する必要があります。.

概要

フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)は、可塑性と強度を向上させるための可塑剤としてさまざまなプラスチックやポリマーに広く使用されている合成化合物です。過去数年間で、DEHPが内分泌かく乱物質であり、人間や他の動物の呼吸器系、神経系、生殖器系に悪影響を与えることを示唆する研究が増えています^1,2,3。その健康リスクを考慮して、米国環境保護庁、欧州連合、および中国環境モニタリングセンターはすべて、優先汚染物質のリストにDEHPを分類しています。土壌は、プラスチックマルチングと有機肥料の適用、廃水による灌漑、および汚泥農場の適用により、環境中のDEHPの重要なシンクと見なされてきました⁴。予想通り、DEHPは農地の土壌で遍在的に検出されており、その含有量は中国の一部の地域では乾燥土壌1キログラムあたり最大ミリグラムにまで達しています^5,6。DEHPは主に根を介して植物に入り、土壌生態系のさまざまな栄養レベルで生物濃縮を受けることができます⁷。したがって、ここ数十年にわたって、植物におけるDEHP誘発ストレスについて重....

プロトコル

このプロトコルの目的は、水耕栽培実験からメタボローム分析までの一般的なパイプラインを提供し、アルファルファの根の滲出液に対するDEHPの効果を定量化することです。

1. 水耕栽培実験

注:このプロトコルは、さまざまな濃度のDEHPのストレス下でアルファルファ(メディカゴサティバ)の苗を得るために設計されたアルファルファ水耕栽培実験の例を示しています。3つの処理が設定されました:無添加のコントロール、および1 mg kg-1および10 mg ^kg-1のdi(DEHP)をスパイクした栄養溶液。DEHPの濃度は、土壌²³中のDEHPの実際の含有量に従って設定されました。各処理には6回の反復がありました。

1. アルファルファの種子を0.1%次亜塩素酸ナトリウムで10分間、75%エチルアルコールで30分間殺菌します。
   1. 滅菌した種子を蒸留水で数回すすぎ、暗所で30°Cの滅菌ペトリ皿で湿ったろ紙で発芽させます。
2. 20個の均一で発芽した大きなふっくらとした種子を、(μM単位):Ca(NO 3)₂、3,500で構成される栄養溶液で満たされた培養ボトルの生着バスケットに移します。NH....

結果

この実験では、アルファルファの根の滲出液を上記の方法に従って収集、抽出、および分析しました(図1)。対照、低濃度のDEHP(1 mg L⁻1)、および高濃度のDEHP(10 mg L⁻¹)の3つの治療群が設定されました。

コントロールのクロマトグラフで合計778のピークが検出され、そのうち314の代謝産物がマススペクトルに従って識別できました。

ディスカッション

このプロトコルは、DEHPストレス下でアルファルファの根の滲出液を収集および測定する方法、およびメタボロームデータを分析する方法に関する一般的なガイダンスを提供します。このプロトコルのいくつかの重要なステップに細心の注意を払う必要があります。水耕栽培実験では、アルファルファの苗木を、異なる濃度のDEHPを含む栄養溶液で満たされたガラス瓶で水耕栽培しました。ガ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adonitol	SIGMA		≥99%
Alfalfa seeds	Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance	Sartorius	BSA124S-CW
BSTFA	REGIS Technologies		with 1% TMCS, v/v
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Fresco17
Chromatographic column	Agilent	DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate	Dr. Ehrenstorfer
FAMEs	Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC)	Agilent	7890A
Grinding instrument	Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd	JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS)	LECO	PEGASUS HT
Methanol	CNW Technologies		HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride	TCI		AR
Microcentrifuge tube	Eppendorf	Eppendorf Quality	1.5 mL
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd	DHG-9023A
Pyridine	Adamas		HPLC
R software			statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2			statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific	Forma 900 series
Ultrasound	Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd	YM-080S
Vacuum dryer	Taicang Huamei biochemical instrument factory	LNG-T98