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根の滲出液の分泌は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルでは、非標的メタボローム分析 を介して アルファルファに対する生体異物の影響を評価する方法について説明します。
根の滲出液は、植物の根と周囲の環境との間の情報通信とエネルギー伝達の主要な媒体です。根の滲出液の分泌の変化は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルは、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入して、フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)が代謝産物産生に与える影響を研究することを目的としています。まず、水耕栽培実験においてアルファルファ苗をDEHPストレス下で生育させる。次に、植物を50mLの滅菌超純水を含む遠沈管に6時間移し、根の滲出液を採取します。次いで、溶液を真空凍結乾燥機中で凍結乾燥する。凍結サンプルを抽出し、ビス(トリメチルシリル))トリフルオロアセトアミド(BSTFA)試薬で誘導体化します。続いて、誘導体化された抽出物は、飛行時間型質量分析計(GC-TOF-MS)と組み合わせたガスクロマトグラフシステムを使用して測定されます。取得した代謝物データは、バイオインフォマティクス手法に基づいて分析されます。根の滲出液を考慮してアルファルファに対するDEHPの影響を明らかにするために、異なる代謝産物と有意に変化した代謝経路を深く調査する必要があります。.
フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)は、可塑性と強度を向上させるための可塑剤としてさまざまなプラスチックやポリマーに広く使用されている合成化合物です。過去数年間で、DEHPが内分泌かく乱物質であり、人間や他の動物の呼吸器系、神経系、生殖器系に悪影響を与えることを示唆する研究が増えています1,2,3。その健康リスクを考慮して、米国環境保護庁、欧州連合、および中国環境モニタリングセンターはすべて、優先汚染物質のリストにDEHPを分類しています。土壌は、プラスチックマルチングと有機肥料の適用、廃水による灌漑、および汚泥農場の適用により、環境中のDEHPの重要なシンクと見なされてきました4。予想通り、DEHPは農地の土壌で遍在的に検出されており、その含有量は中国の一部の地域では乾燥土壌1キログラムあたり最大ミリグラムにまで達しています5,6。DEHPは主に根を介して植物に入り、土壌生態系のさまざまな栄養レベルで生物濃縮を受けることができます7。したがって、ここ数十年にわたって、植物におけるDEHP誘発ストレスについて重....
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このプロトコルの目的は、水耕栽培実験からメタボローム分析までの一般的なパイプラインを提供し、アルファルファの根の滲出液に対するDEHPの効果を定量化することです。
1. 水耕栽培実験
注:このプロトコルは、さまざまな濃度のDEHPのストレス下でアルファルファ(メディカゴサティバ)の苗を得るために設計されたアルファルファ水耕栽培実験の例を示しています。3つの処理が設定されました:無添加のコントロール、および1 mg kg-1および10 mg kg-1のdi(DEHP)をスパイクした栄養溶液。DEHPの濃度は、土壌23中のDEHPの実際の含有量に従って設定されました。各処理には6回の反復がありました。
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この実験では、アルファルファの根の滲出液を上記の方法に従って収集、抽出、および分析しました(図1)。対照、低濃度のDEHP(1 mg L−1)、および高濃度のDEHP(10 mg L−1)の3つの治療群が設定されました。
コントロールのクロマトグラフで合計778のピークが検出され、そのうち314の代謝産物がマススペクトルに従って識別できました。
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このプロトコルは、DEHPストレス下でアルファルファの根の滲出液を収集および測定する方法、およびメタボロームデータを分析する方法に関する一般的なガイダンスを提供します。このプロトコルのいくつかの重要なステップに細心の注意を払う必要があります。水耕栽培実験では、アルファルファの苗木を、異なる濃度のDEHPを含む栄養溶液で満たされたガラス瓶で水耕栽培しました。ガ?.......
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著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある競合する金銭的利益や個人的な関係は知られていないと宣言しています。
この研究は、中国国家自然科学基金会(41877139)、中国国家自然科学財団の主要プロジェクト(41991335)、中国国家重点研究開発プログラム(2016YFD0800204)、江蘇省自然科学基金会(No. BK20161616)、「135」計画、および中国科学院のフロンティアプログラム(ISSASIP1615)。
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
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