磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波生成温熱療法:マウス横紋筋肉腫モデルにおける実行可能な治療法

要約

ここに提示されるのは、横紋筋肉腫マウスモデルにおいて温度感受性リポソームからの薬物放出を引き起こすために、磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波によって生成される制御された温熱療法を使用するプロトコルです。

要約

磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波(MRgHIFU)は、局所温熱療法を生成するための確立された方法です。リアルタイムのイメージングと音響エネルギー変調により、このモダリティは定義された領域内で正確な温度制御を可能にします。温熱療法の生成など、この非侵襲的で非イオン化技術を使用して、熱感受性リポソームキャリアから薬物を放出するための多くの熱応用が検討されています。これらの薬物は、用量制限全身性副作用、すなわち心毒性のために標的放出が望まれるドキソルビシンなどの化学療法を含むことができる。ドキソルビシンは、さまざまな悪性腫瘍を治療するための主力であり、再発または再発横紋筋肉腫(RMS)で一般的に使用されます。RMSは、小児および若年成人において最も一般的な固形軟部組織頭蓋外腫瘍です。積極的なマルチモーダル療法にもかかわらず、RMSの生存率は過去30年間同じままです。この満たされていないニーズに対処するためのソリューションを探求するために、MRgHIFUを薬物放出の温熱療法の供給源として使用する免疫能の同系RMSマウスモデルにおける熱感受性リポソームドキソルビシン(TLD)の放出を評価するための実験プロトコルが開発されました。

概要

横紋筋肉腫(RMS)は、小児および若年成人に最も一般的に発生する骨格筋腫瘍^です1。限局性疾患は、化学療法、電離放射線、手術などの複合的な治療で治療されることがよくあります。多剤化学療法レジメンの使用は、小児患者でより一般的であり、成人の患者と比較して転帰が改善されています²。しかし、進行中の研究努力にもかかわらず、5年生存率は、最も攻撃的な形態の疾患で約30%のままです^3,4。化学療法の標準治療は、ビンクリスチン、シクロホスファミド、およびアクチノマイシンDを含む多剤レジメンです。再発または再発性疾患の場合、標準的な(遊離)ドキソルビシン(FD)およびイホスファミド¹を含む代替化学療法が使用されます。これらの化学療法はすべて全身毒性を持っていますが、ドキソルビシンの心毒性は生涯にわたる用量制限を課します^5-7。腫瘍に送達される薬物の量を増加させ、全身毒性を最小化するために、リポソームカプセル化を含む代替製剤が開発されている。これらは、乳がんおよび肝細胞がんの治療に承認されている非熱感受性ドキソルビシン、または臨床試験が進行中の熱感受性ドキソルビシンである可能性があります8,9,10,11,12,13。多胞リポソームおよびリガンド標的リポソームなどのリポソーム封入薬物を送達するための代替方法が評価されており、腫瘍の治療に有望である^9。この研究では、熱の追加は、薬物放出を含む多因子の影響をもたらします¹⁴。磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波(MRgHIFU)と熱感受性リポソームドキソルビシン(TLD)で生成された温熱療法(HT)の組み合わせは、用量制限毒性を最小限に抑え、腫瘍に対する免疫応答を潜在的に増加させながら、RMSを治療するためにこの毒性でありながら効果的な薬物を使用するための新しいマルチモーダル治療アプローチです。

ドキソルビシンは、>39°Cの温度でTLDから急速に放出され、人体の平均体温である37°Cをはるかに上回っていますが、組織の損傷やアブレーションを引き起こすほど高くはありません。これは43°Cで起こり始めますが、温度が60°Cに近づくにつれてより急速に起こります¹⁵。レーザー、マイクロ波、高周波アブレーション、集束超音波など、さまざまな方法が生体内でHTを生成するために使用されており、その多くは侵襲的な加熱方法です¹⁶。MRgHIFUは、非侵襲的で非イオン化加熱法であり、標的組織内の正確な温度設定を容易にします。磁気共鳴(MR)イメージングは、コンピュータソフトウェアを使用して、治療中の組織の温度測定測定値を計算できるリアルタイムイメージングを提供します。続いて、このデータを使用して、超音波治療をリアルタイムで制御し、所望の温度設定点¹⁷に到達および維持することができる。MRgHIFUはさまざまな組織タイプでテストされており、軽度のHTからアブレーションまで、幅広い温度治療に使用できるだけでなく、臨床的には痛みを伴う骨転移の治療に成功しています¹⁸。さらに、HTは腫瘍細胞毒性を引き起こし、タンパク質発現を調節し、腫瘍微小環境における免疫応答を変化させることが示されています19,20,21,22。ある研究では、相乗的なR1ラットモデル²³で軽度のHTとTLDを組み合わせ、続いてMRgHIFUでアブレーションを行い、腫瘍コアの壊死と末梢への薬物送達をもたらしました。伝統的に、放射線療法は、腫瘍細胞に損傷を与え、局所疾患の再発を減らすための補助療法として使用されてきました。ただし、その使用は、生涯投与とオフターゲット損傷によって制限されます¹。したがって、HTは、同じ毒性または制限なしに同じ効果のいくつかを引き起こすことができるという点で独特である。

RMSの前臨床動物モデルには、免疫不全宿主における同系免疫適格モデルおよび患者由来異種移植片(PDX)が含まれます。免疫不全モデルはヒト腫瘍の成長を可能にするが、適切な腫瘍微小環境を欠いており、免疫応答を研究する能力が制限されている²⁴。FGFR4活性化変異は、予後不良の有望なマーカーであり、成人および小児RMS1,25における潜在的な治療標的です。Gladdy研究室で開発された同系RMSモデルでは、腫瘍は免疫適格宿主で増殖することができ、腫瘍に対する自然免疫応答および適応免疫応答を発達させる²⁶。HTは免疫応答に影響を与えるため、マウス免疫応答の変化を観察することは、この腫瘍モデルの貴重な利点です。FDと比較したTLDに対する腫瘍応答、および化学療法とHTの両方に対する腫瘍の免疫応答の変化の両方をテストするために、この研究の焦点であるMRgHIFUおよびTLDを使用してin vivoで同系マウスRMS腫瘍を治療するためのプロトコルが開発され、採用されました。

プロトコル

研究は、フェノゲノミクスセンター(TCP)および大学保健ネットワーク(UHN)動物リソースセンター(ARC)の動物研究施設の監督獣医の下で、承認された動物使用プロトコルを備えた動物管理委員会に準拠して実施されました。動物が関与するMRgHIFUを除くすべての手順は、動物の外気への曝露または感受性感染を最小限に抑えるために、生物学的安全キャビネット(BSC)で行われました。

1.マウスの繁殖

注:合計65匹のマウス(系統B6.129S2-Trp53tm1Tyj / J)がパイロット研究に含まれました(男性:n = 23、女性:n = 42)。雄および雌の両方のマウスを7〜9週齢で使用した。彼らの子犬は離乳して遺伝子型を決定し、p53ヘテロ接合マウスを実験に使用しました。

1. 飼育ケージを作成するために、各オスのマウスと一緒に2匹のメスのマウスを収容します。子犬の誕生からの年齢を数えます(誕生= 0日目)。
2. 10日目に、耳の切り欠きで子犬を識別します。細胞株注射の前にジェノタイピング用のテールスニップを収集します。

2.マウスジェノタイピング

1. 製造元の指示に従って、市販のDNA抽出キット( 材料の表を参照)を使用して、収集した2mmテールクリッピングからDNAを抽出します。
2. 分光光度計で260〜280 nmの吸光度を測定することにより、DNA濃度と純度を決定します(材料の表を参照)。
3. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行します。
   1. 市販のPCRミックス(Taqポリメラーゼ、dNTPS、およびMgCl 2を含む;材料表を参照)、プライマー、およびdH₂Oを必要なサンプル数に対して12.5:0.25:10.75(μL)の比率で含むマスターミックスを作成します。各PCRチューブに1 μLのDNAサンプルを追加し、dH₂O、ヌルサンプル(p53変異の場合はホモ接合型)、ヘテロ接合型サンプル(p53変異の場合はヘテロ接合型)、および野生型(通常のp53の場合はホモ接合型)サンプルをPCRコントロールとして含めます。
   2. DNAを含む各PCRチューブに24 μLのマスターミックスを加えます。各PCRチューブの溶液を上下にピペットで動かし、マスターミックス全体にDNAを分配します。
   3. 反応管をサーマルサイクラーに入れ、次の仕様に従ってサイクルします:95°Cで2分間、95°Cで15秒間、60°Cで15秒間、72°Cで1分間のサイクル、次にゲルで分析する準備ができるまで4°Cに維持します。
4. PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析します。
   1. アガロースをTAE中で加熱し、溶解するまで混合することにより、2%ゲル(1x TAEの50 mLとアガロース1 g)を調製します。冷却して液体のままにしたら、2.5 μLのDNAゲル染色剤をアガロースに加えて混合します。櫛でゲルボックスに入れます。ゲルを電気泳動装置( 材料表を参照)に入れ、1x TAEで覆います。
   2. 10 μLの1 kB DNAラダーをゲルにロードします。各サンプルを12.5 μLロードします。ゲルを135 Vで25分間実行します。
   3. 製造元の指示に従って、ゲルイメージャー( 材料表を参照)で使用済みのDNAゲル染色剤の適切な設定を使用してゲルを画像化します。

3. 腫瘍モデル作製(図1)

1. 注射日の1週間前に、完全増殖培地(添加剤:10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および2 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチド)で、37°Cおよび5%CO2で、M25FV24C細胞株(継代_12-15)を75 mLフラスコで増殖させます。細胞が~80%コンフルエントになったら、培地を吸引し、5 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を1回洗浄します。
   注:M25FV24Cは、変異FGFR4^V550Eを過剰発現するように操作されたマウス細胞株であり、小児および成人のRMS ^1,26で観察されます。
2. プレートの側面に0.5 mLの0.25%トリプシン溶液を加え、室温で2〜3分間容器をインキュベートして細胞を持ち上げます。細胞が剥離したように見えたら、室温で2.5 mLの完全な増殖培地を加えてトリプシンを不活性化します。10 μLのサンプルアリコートを使用して、血球計算盤とトリパンブルー排除を使用して生細胞の細胞濃度を測定します。
3. 注射用のDPBS懸濁細胞の正しい容量を準備し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます:遠心分離する容量=(マウスの数×マウスあたりの細胞数)/(細胞の濃度)、ここで、マウスの数=注射されるマウス+エラーのために10匹の追加マウス、およびマウスあたりの細胞数= 10⁴。
4. 153 x gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを適切な容量(マウス×マウス数あたり10 μL)のmyo注射バッファー(F10培地+ 0.5%FBS)に再懸濁し、この懸濁液の調製から1時間以内にマウスを注射します。

4.筋肉内細胞注射

注:M25FV24C細胞は、4〜6週齢のマウスの右後肢に注射されます。4週間での注射は、HT分散のための周囲組織が少ないため、治療が困難な腫瘍を持つ小さなマウスを生成します。6週間待つとマウスが大きくなり、腫瘍の治療が容易になります。

1. 吸引の前に細胞懸濁液を数回反転させて、溶液内の細胞を均等に分散させます。マイクロリットルのシリンジを使用して10μL(10⁴ 細胞)を吸引します( 材料の表を参照)。マウスを首筋にします。拘束されると、後ろ足を伸ばすことで尾太ももの筋肉にアクセスできます。バリカンを使用して脚を剃り、70%エタノールで拭きます。
2. M25FV24C細胞懸濁液(10 μL、10⁴ 細胞)を、26s G針を備えた気密マイクロリットルシリンジを使用して、4〜6週齢のマウスの右後肢大腿筋組織に注入します。
   注意: 針は、坐骨神経に当たらないように注意しながら、大腿骨と平行に膝に向かって挿入する必要があります。後肢の筋肉量が少ないため、針の先端(約2 mm)のみを挿入します。
3. 安定した動きでソリューションを管理します。針を外し、出血が発生しないことを確認します。マウスを 2 つ目のケージに戻します。
4. 動物を毎日評価し、触診によって後肢の腫瘍の成長を監視します。次の初期エンドポイントのいずれかに遭遇した場合は、二酸化炭素を使用してマウスを安楽死させます:直径1.5 cmを超える腫瘍サイズ、腫瘍潰瘍、または病気の全身の兆候(勃起、猫背姿勢、不活動、または食物または水の摂取量の減少)。.

5.スクリーニングMRIスキャン

1. マウスを、足を絞って動きがないレベルまで麻酔し、以下のパラメータの下でイソフルランを使用します:1.5LPMで4%のチャンバーで誘導し、MRIスキャナースレッドのノーズコーンに移し、0.75LPMで1.5%〜2%のノーズコーンのイソフルラン維持を継続します。呼吸モニターを取り付けます。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
2. MRIスキャナーを使用して麻酔をかけたマウスを画像化します( 資料表を参照)。T2強調画像(Ax_Screen取得、 表1)で、面内寸法と腫瘍が現れる軸方向スライスの数に注意してください。超音波が入る大腿骨と大腿部の外側表面を基準とした腫瘍の位置に注意してください。
   注:腫瘍は、反対側から非対称の筋肉内の高強度の腫瘤として現れます。複数の治療に適した開始腫瘍サイズは、急性期または生存率のいずれかの研究で2 mm x 2 mm x 2 mmです。それがはるかに大きい場合、腫瘍は毎週3回の治療を完了する前にサイズのエンドポイントに達するため、急性期研究にのみ適しています。HIFU治療の除外基準には、大腿骨に巻き付けられている、大腿骨に近すぎる、マウスの後方すぎる、大腿骨の内側、直腸に近すぎるなどがあります。
3. スキャナーからマウスを取り外し、ベースラインウェイトを取得します。電気かみそりで麻酔下でマウスを中半身から足まで剃ります。
   注:理想的には、マウスがグルーミングを実行できるため、シェービングは治療の1日前に行われ、脱毛クリームがより効率的に機能します。
4. ケージの一端の下にある加熱パッドを使用して、BSCでマウスを回収します。マウスが胸骨横臥を取り戻したら、マウスをケージに戻します。

6.実験:HIFU治療日動物の準備

1. 小口径HIFU( 材料表を参照)システムを準備するには、発電機の電源を入れ、膜がトランスデューサーの下に膨張するまで十分な脱イオン水を入れますが、マウスを圧縮するほど硬くはありません。トランスデューサ回路内の水を30分間脱気して、媒体から溶存酸素を除去します。
2. 関連するコンピューター・システムを準備します。
   1. 制御コンピュータの電源を入れ、イーサネット経由でHIFUジェネレーターに接続し、USB経由でサーマルプローブディスプレイに接続されていることを確認します。ソフトウェアを起動し、[ホーム]をクリックしてトランスデューサをホームにしてから、マウスを挿入します。
   2. 光ファイバーサーマルプローブのキャリブレーション:ベースラインの室温を取得し、MRI室の温度変化を記録します。磁場強度による各プローブの温度ドリフトの大きさに注意してください。ドリフトチューブ温度プローブをガドリニウム充填ガラスチューブに挿入して、スキャン中の温度校正を行い、ドリフトチューブをテープで固定します。
      注意: ベースライン室温(ドリフトチューブ)は、ソフトウェアのGUIに温度測定パラメータとして手動で追加されます。MR画像のドリフトチューブ内に関心領域(ROI)が設定され、温度ドリフトを検出し、温度測定画像を自動的に補正します。
   3. 注射する薬物を1 mLシリンジに吸い上げ、自動送達ポンプに入れます( 材料表を参照)。自動送達ポンプの手動送達ボタンを押して、薬剤がラインを完全に満たすまでマウスの尾静脈カテーテルに接続するラインをプライミングします。
   4. ヒートランプを使用して、麻酔室に移す前にケージ内のマウスを~20分間温めます。
      注:予熱は血管拡張を促進し、マウスが麻酔されるとすぐに遭遇し、カテーテルの留置を助けます。
3. マウスをイソフルラン(誘導:1.5 LPMで4%、維持:0.75 LPMで1.5%-2%)で麻酔し、ノーズコーンに移します。麻酔下でまばたき反射の欠如による損傷を防ぐために、角膜潤滑剤を目に塗ります。
4. 右後肢全体を含む剃毛部分に脱毛クリームを塗り、脱毛については製造元の指示に従ってください。
   注意: BSCにいる間、マウスをヒートランプの下に置き、麻酔下での脱毛中の体温調節を支援します。
5. 脱毛クリームを温水で洗い流した後、マウスの体重をデジタルスケールで計量し、薬物投与を記録します。
6. MRIスレッドのMRI互換ノーズコーンにマウスを移動します。MRIの準備中にマウスを暖かく保つために、マウスにヒートランプを配置します。マウスを外側褥瘡の位置に配置し、非腫瘍ベアリング側を下にして、そりの3Dプリントされたマウスホルダー内に腫瘍を上に置きます(補足図1 および 図2)。腫瘍の適切な位置を確認します(つまり、コイルの中央に水平および垂直に、超音波トランスデューサーによる圧迫を考慮してマウスホルダーの端のすぐ上の高さにします)。
   注:必要に応じて、圧縮された超音波ゲルパッドセグメントをマウスの下に置いて、ホルダーの下部を裏打ちし、腫瘍をホルダーの上部まで水平にする厚さにします。
7. 関与していない脚を腫瘍脚から離すか、マウスの下に置くか、腫瘍脚を曲げた状態で伸ばします。足が腫瘍と超音波ビーム経路の近距離場または遠方場にないことを確認してください。ヒートランプを尾から15cmの位置に配置して、尾静脈にカテーテルを挿入できるように温めます。
8. 食道温度プローブを挿入します。
   1. 食道プローブをノーズコーンに通し、マウスの首を首筋にします。マウスの鼻を上に傾けて、頭を伸ばして口から胃までまっすぐに線を作ります。サーマルプローブを舌の上でマウスの食道に約0.5 cmスライドさせ、マウスの鼻の周りのノーズコーンを交換します。食道プローブとノーズコーンをそりの上部に固定します。
      注意: 気管に不適切に挿入される可能性があるため、挿入直後に呼吸困難の兆候がないか監視します。
9. 直腸温プローブを挿入します。
   注意: 直腸および食道温度プローブは、互いに3°C以内である必要があります。
10. 超音波トランスデューサーの配置を妨げないように、接続ケーブル付きの呼吸モニターをマウスの頭に向けて配置します。テープで固定します。
11. 27 Gのバタフライニードルテール静脈カテーテルを、20 μLのデッドスペースとテープでマイクロチューブに取り付けられた外側尾静脈に挿入します。テーピング後、カテーテルがまだ十分に洗い流されていることを確認してください。
12. 2人で準備したマウス、マウススレッド、麻酔ライン、呼吸ライン、尾静脈カテーテル、サーマルプローブコードをMRIスキャナーに運び、MRIスレッドホルダーに入れます。
13. HIFUソフトウェア( 材料表を参照)オペレータに、初期アライメント²⁷の目視検査により、トランスデューサのメニスカスを腫瘍上に直接移動させます。眼脂または脱気超音波ゲルを腫瘍の上の無毛皮膚に塗布し、HIFUトランスデューサーを腫瘍領域に結合します。
14. 自動ポンプからの薬物送達ラインを尾静脈カテーテルに接続します。尾静脈線と接続線のデッドスペースの量を計算します。MRIレール上のマウスHIFUスレッドをMRIの中央にスライドさせます。
15. 薬剤の種類や濃度、動物の体重に応じてポンプに薬剤を注入する量を設定し、デッドスペースの量を追加します。ポンプを200μL/分の注入速度に設定します。
    注:この研究では、FDとTLDを2 mg / mLの濃度と5 mg / kg体重の用量で使用しました。
16. ベースラインサーマルプローブの温度を記録します。
17. 空気対流加温装置( 材料の表を参照)を最も暖かい設定に配置します。MRIボアの中央にあるマウスに向かって空気を吹き付けるチューブを向け、テープで固定します。加温装置は、超音波処理中にマウスの過熱を防ぐために、後で最低設定(32°C)に回されます。
18. 調査MR画像(Ax_Loc、Sag_Loc; 表1)深さを含む超音波処理ターゲティングのための腫瘍位置を決定する。HIFUソフトウェアを使用して、画像に測定した目的の移動距離を挿入し、矢印方向をクリックして移動することにより、それに応じて探触子の位置を調整します(図3A)。ドリフトチューブの位置にも注意してください。必要に応じて繰り返します。
19. Test_Shot温度測定取得中に短い5秒x 50mV振幅連続「テストショット」超音波処理を行うことにより、コロナ面内のトランスデューサの焦点の位置を決定します(表1)。
20. MR調査画像をHIFUソフトウェア内の焦点のコロナビューに合わせます。骨の構造と直腸に対する腫瘍の位置の画像を確認し、必要に応じて探触子の位置を修正します。
21. 9回の繰り返しサームイメージング(表1)中にテストショット超音波処理を繰り返して、最小限のオフターゲット加熱で腫瘍体積に均一かつ正確な加熱があるかどうかを確認します。スライス位置、探触子の位置、ステアリングの深さを調整し、必要に応じて「テストショット」を繰り返して加熱性能を確認します。
22. HIFU処理監視ソフトウェアを使用して、移動する距離を測定し、プログラムでグリッド座標を変更することにより、最終的な加熱プロファイル内で温度測定監視のROIを定義します。ドリフト補正のためにドリフトチューブの周囲にROIを設定します。温度測定の直腸プローブ温度に基づいてベースライン温度を入力します。HIFUシステムは、HIFU治療超音波処理を開始し、温度測定モニタリングのために使用されます。
23. ソフトウェアで20分の温熱治療仕様を開き、参照MR画像が収集され、温度測定が開始されたら超音波処理を開始します。
24. 内蔵の比例積分微分(PID)コントローラソフトウェアを使用して、Thermイメージング(表1)中に20分間の治療(図3B)を実行します。ROIの温度が所望の温度(40°C)に温まった後、選択した薬物を1.5分で注射する。
25. 治療中はコア温度を監視します。治療中に直腸温が急速に上昇している場合は、10分または20分の治療期間にわたって直腸温を避けるためにマウスの位置変更が必要になる場合があります。.直腸温が>40°Cに上昇した場合は、治療を中止してください。

7.実験:急性期研究のためのマウスモデルイメージングおよび超音波処理手順

1. 治療終了後、マウスをMRI穴から取り外し、尾静脈カテーテル挿入部位の止血を確保します。マウスをBSCに移し、継続的な麻酔のためにノーズコーンに置きます。
2. 手足を拘束し、心臓を露出させた状態で、青い吸収パッドの上にマウスを仰向けに置きます。
3. 心臓穿刺 による 放血とそれに続く心臓の除去によってマウスを安楽死させる。すぐに血液を採取し、10,621 x g で10分間血漿分離のために遠心分離します。
4. 剖検を行い、分析に必要な臓器を保管します。臓器を液体窒素で凍結し、-80°Cで数か月または液体窒素タンクに長期間保管します。
5. 9倍過剰(w / w)の脱イオン水を加え、ビーズビートホモジナイザーを使用して組織を分解することにより、腫瘍組織を機械的に均質化します。75 μLの300 mg/mL硝酸銀、75 μLの10 mM硫酸、および2.5 mLの1:1イソプロパノール:クロロホルムを順次添加することにより、600 μLのホモジナイズ組織からドキソルビシンを抽出します。ボルテックスを20分間行い、-20°Cで一晩保存します。
6. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用のサンプルを調製するには、ステップ7.5の溶液を4,500 x gで遠心分離し、有機溶媒層を除去し、窒素ガスの流れ下でイソプロパノール:クロロホルムを乾燥させます。100 μLの2:1 MeOH:_H2Oに再懸濁します。 HPLC-MS/^{MS 28}を使用してドキソルビシン濃度を測定します。

8.実験:生存研究のためのマウスモデルイメージングおよび超音波処理手順

注:生存研究については、HIFU治療日の動物準備手順に従ってください(ステップ6.1から6.25)。

1. 治療が完了したら、マウスをヒートランプの下に置き、回復させ、胸骨横臥を取り戻すまで呼吸と動きを監視します。その後、動物をケージに戻します。
   注意: 動物の体温調節は麻酔とHT治療の影響を受けるため、ケージの半分がヒートランプと一致していることを確認してください。
2. マウスの行動、摂食パターン、呼吸数に苦痛の兆候がないか毎日監視します。
3. 手順6.1から6.25に従って週に1回、3週間連続して治療を行います。
4. 週2回、腫瘍測定用のマウスのMRI撮影を行う。治療中の数週間は、毎週1回のMRIスキャンと1回の超音波検査を行います。治療が完了したら、隔週で超音波画像診断を行います。
5. 一連の治療を完了してから60日後、または人道的エンドポイント(腫瘍サイズ>1.5cm³ または腫瘍からの罹患率)に達したときにマウスを安楽死させ、続いて分析のために腫瘍および臓器除去を伴う剖検を行う。

結果

MRgHIFUで生成された温熱療法プロトコルを使用すると、後肢の腫瘍は、治療期間中、一貫して所望の設定温度に加熱することができました(図4 は、代表的な治療法、10分または20分、n = 65を示しています)。治療が成功すると考えるには、ROIを治療全体を通して39°C以上に維持し、治療全体で<6°Cの変動があり、オフターゲット組織を加熱しない必要がありました。さらに、...

ディスカッション

本明細書で開発されたプロトコルは、軽度のHT治療のためにMRgHIFUを使用して後肢腫瘍を標的とし、 インビボ でリポソームから封入薬物を放出するために使用された。パイロット研究中にこのプロトコルでいくつかの重要なステップに遭遇し、これらの重要なステップを最適化することで、パイロット研究よりも治療の成功が向上しました。まず、超音波処理される領域の毛髪を完全?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 - 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08