Micro-C-XLによる哺乳類3Dゲノム相互作用のマッピング

要約

ゲノムワイド染色体コンフォメーションキャプチャー法Micro-C-XLを使用して、ヌクレオソーム分解能で三次元ゲノム構成をマッピングするためのプロトコルがここに示されます。

要約

3次元(3D)染色体構成は、ゲノム制御と細胞型指定の主要な要因です。例えば、エンハンサーとして知られるシス調節因子は、3次元空間での相互作用 を介して 遠位プロモーターの活性を調節すると考えられています。Hi-Cなどのゲノムワイドな染色体コンフォメーションキャプチャー(3C)技術は、ゲノムが細胞内でどのように組織化されているかについての理解を一変させました。3次元ゲノム構成の現在の理解は、3次元空間における染色体のトポロジカルな組織化を解像できる解像度によって制限されています。Micro-C-XLは、染色体コンフォメーションキャプチャプロトコル中にマイクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)を利用してゲノムを断片化することにより、クロマチンの基本単位であるヌクレオソームレベルで染色体フォールディングを分解能で測定します。これにより、測定におけるS/N比が向上し、他のゲノムワイドな3D技術と比較して、絶縁部位や染色体ループの検出が容易になります。本稿では、哺乳類細胞から高品質のMicro-C-XLサンプルを調製するための、視覚的に裏付けられた詳細なステップバイステップのプロトコルを紹介します。

概要

Micro-C-XLは、ヌクレオソーム分解能で3Dゲノムコンフォメーションを測定するゲノムワイド技術です。Micro-C-XLは、広く使用されている近接ライゲーションベースのHi-C技術に基づいて構築されており、3Dゲノムがどのように組織化されているかについての理解を一変させました¹。Micro-C-XLおよび最初の反復、Micro-Cは、最初に出芽酵母^2,3で開発され、プロトコルが染色体ループおよび絶縁材の場所のような3Dゲノムの短距離特徴の検出の完全な潜在性を、実証した哺乳類細胞システムに後で合わせられた。このバージョンは、最近の哺乳類Micro-C-XL出版物^4,5に基づいています。Micro-C-XLがMicro-Cに取って代わるため、以降、Micro-C-XLは原稿ではMicro-Cと呼ばれます。

Micro-CとHi-C⁶ の主な違いは、1)制限酵素と比較してミクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)によるゲノム断片化、2)ホルムアルデヒドのみと比較して反応基間の原子間隔が大きい追加の架橋剤です。どちらのステップも、従来のHi-Cと比較してMicro-CのS/N比の向上に大きく貢献しています。フラグメンテーションサイズは、近接ライゲーションプロトコル中に3Dゲノム構成を分離できる分解能を制限します。MNaseは、アクセス可能なDNAを優先的に消化し、ヌクレオソームで保護されたDNAをそのまま残すヌクレアーゼです。MNaseシーケンシングを用いたヌクレオソームフットプリントは、ヌクレオソームがほとんどの真核生物ゲノムを完全にカバーしていることを示しました⁷。ヌクレオソームは、種や細胞の種類にもよりますが、平均160〜220 bpの間隔でゲノム全体に分布しているため、MNaseはゲノム構造の高解像度マッピングに理想的な酵素です。

Micro-C法でホルムアルデヒド(FA)と組み合わせて追加の架橋剤を使用すると、S/N比がさらに向上します^2,8。反応基間に長い原子スペーサーを持つアミン特異的架橋剤は、タンパク質間架橋を促進します。これらは通常、ジスクシンイミジルグルタル酸(DSG)またはエチレングリコールビス-スクシンイミジルコハク酸塩(EGS)で、それぞれ7.7 Åおよび16.1 Åのスペーサーを備えています。EGSまたはDSGによるノイズの減少は、Micro-Cなどの高いフラグメンテーション速度の実験で特に顕著であり、おそらくランダムライゲ^{ーションイベントの速度}の低下が原因で発生します8。

ESG/DSG架橋と制限酵素の複数の組み合わせを利用する最近開発されたHi-C 3.0プロトコルは、Hi-C実験のノイズを低減し、染色体ループと^{絶縁部位の}検出を大幅に改善します^8,9。それでも、さまざまな相互作用データの特徴をサイトごとに比較したところ、Micro-Cは、Hi-C 3.0と従来のHi-C⁸の両方と比較して、染色体ループや絶縁部位などの短距離の特徴の検出に優れていることがわかりました。しかし、Hi-C 3.0は、従来のHi-Cと比較して、短距離の特徴の検出を改善し、ゲノム区画化の強力な検出を維持しています。要約すると、染色体コンフォメーションキャプチャー法の選択は、客観的および生物学的な問題によって決定されるべきです。

ここでは、3Dゲノム構成を解明できるMicro-C実験を成功させるためのステップバイステップのプロトコルを提供します。

プロトコル

1. 細胞培養と架橋

1. 実験による培養細胞は、最低1×10⁷細胞を得る必要がある。ここで、細胞をE14培地(ピルビン酸およびL-グルタミンを含むDMEM、15%FBS、1x LIF、1x NEAA、1%ペンストレプ、0.1 mM β-メルカプトエタノール[材料表参照])中で5%_CO2で37°Cで増殖させ、2日おきに継代しました。
   注:このプロトコルは多数の種からのさまざまなセルタイプに首尾よく、 Homo sapiensおよび Musのmusculusのような適用された。この例では、マウス胚性幹細胞(ES)を使用しました。
2. 培地を吸引することにより、70%〜80%のコンフルエントで細胞を回収します。5 mLのDPBSで1回洗浄し、37°Cで2〜3分間、10 cmディッシュあたり3 mLの予熱した0.25%トリプシンで細胞をインキュベートします。
3. トリプシンを7 mLの予熱したE14培地でクエンチし、剥離した細胞を50 mLのチューブに移します。
4. 室温(RT)で5分間、300 x g で遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を捨て、細胞ペレットを培地に再懸濁します。セルカウンターでセルをカウントします。
   注 プロトコルは細胞の集中のばらつきに対して強く、さまざまな細胞カウンターが細胞数を量量化するのに使用された;ただし、使用するセルカウンタのダイナミックレンジに注意してください。これは通常、1 x 10^5-1 x 10⁷ cells/mLです。この細胞タイプでは遠心分離の速度と時間がテストされていますが、異なる小さな細胞では、より高い遠心分離速度またはより長いスピン時間が必要になる場合があり、それに応じて遠心分離を調整する必要があります。
5. 300 x g で5分間の遠心分離により細胞を室温で回収し、最終濃度1 x 10⁶ cells/mLで細胞をDPBSに再懸濁します。例えば、収量が1 x 10⁷ 細胞の場合、10 mLのDPBSに細胞を再懸濁します。
6. 最初の架橋工程では、37%ホルムアルデヒド(FA)を最終濃度1%になるように細胞懸濁液に添加し、細胞懸濁液を回転(15〜20rpm)しながら室温で10分間インキュベートします。例として、収量が1 x 10⁷ 細胞の場合、10 mLの細胞懸濁液に270 μLのFAを添加します。
   注意: FA溶液は、通常、開封後最大3か月間RTで安定しています。
7. 2.5 Mグリシンを最終濃度0.25 Mに添加して反応をクエンチし、回転(15〜20 rpm)しながら室温で5分間インキュベートします。例えば、収量が1 x 10⁷ 細胞の場合、1.027 mLの2.5 Mグリシンを細胞懸濁液に添加します。
8. 室温で300 x g で5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を廃棄し、細胞を5 mLのDPBSに再懸濁します。遠心分離ステップを1回繰り返し、ペレット化した細胞をDPBSに4 x 10⁶ 細胞/mLに再懸濁します。例えば、収量が1 x 10⁷ 細胞の場合、細胞を2.5 mLのDPBSに再懸濁します。
9. 2 番目の架橋ステップでは、エチレングリコールビス-スクシンイミジルサハク酸(EGS)の 0.3 M ストック溶液を DMSO 中に調製します(100 μL の DMSO 中に 13.6 mg の EGS)。最終濃度3 mMのEGSを細胞懸濁液に添加し、室温で40分間回転(15〜20 rpm)インキュベートします。例えば、収量が1 x 10⁷ 細胞の場合、25 μLの0.3 M EGSストック溶液を2.5 mLの細胞懸濁液に加えます。
   注:ストック溶液を調製するために計量する前に、EGSをRTに少なくとも20分間平衡化します。
10. 2.5 Mグリシンを最終濃度0.4 Mに添加して反応をクエンチし、回転(15-20 rpm)しながら室温で5分間インキュベートします。例えば、収量が1 x 10⁷ 細胞の場合、400 μLの2.5 Mグリシンを細胞懸濁液に加えます。
11. 室温で1,000 x gで5分間遠心分離して細胞を回収し、ペレット化した細胞をDPBSで5 x 10⁶ cells/mLに再懸濁します。分取ライブラリー用に 5 x 10 6 cells/tube、MNase 消化用の滴定用に 1 x 10⁶ cells/tube を分配します。
    注:架橋された細胞バッチごとに最適な消化度を滴定することをお勧めします。理想的には、MNase滴定実験(ステップ2)では1 x 10 6細胞のアリコートを2〜3個、分取実験(ステップ3)では5 x 10⁶細胞のアリコートを2〜4個採取します。
12. 室温で1,000 x g で5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を除去します。細胞ペレットを液体窒素中で急速凍結し、-80°Cで保存します。
    注:正常なMicro-Cライブラリは、最大3か月間保存されたサンプルから調製できます。

2. MNase滴定

注:二重架橋細胞の分取ライブラリーを処理する前に、MNaseの最適濃度を決定するために、MNase滴定を実施する必要があります。

1. MNase滴定を行うには、1 x 10⁶ 細胞のペレット1個を氷上で10分間融解し、細胞を500 μLのDPBSに再懸濁します(細胞が壁に付着している場合は1x BSAを添加します)。細胞懸濁液を氷上で20分間インキュベートします。
2. 室温で10,000 x gで5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を除去します。ペレット化した細胞を500 μLのMB#1バッファー(50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、5 mM MgCl 2、1 mM CaCl 2、_0.2% NP-40、1xプロテアーゼ阻害剤[材料表を参照]、pH 7.4)に再懸濁します。
3. 10,000 x g で5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を除去します。細胞を200 μLのMB#1バッファーに再懸濁し、サンプルを4本のチューブに分割します。
4. MNase バイアル 1 本(20 U/μL)を融解し、10 mM トリス(pH 7.4)で 1:2、1:4、1:4、1:4 に希釈して、それぞれ 10 U/μL、2.5 U/μL、0.625 U/μL、0.1256 U/μL(消化条件ごとに 1 つ)の濃度にします。適切な時間間隔(10〜20秒)で、1 μLのMNase溶液を4つのサンプルの1つに添加し、ボルテックスし、サーモミキサーで37°Cで10分間(800rpm振とう)インキュベートします。残りの MNase 希釈液から 1 μL を残りの細胞アリコートに添加します。
5. 新たに調製したSTOPバッファー200 μL(150 μLの10 mM Tris、pH 7.4、25 μLの10 % SDS、25 μLの20 mg/mLプロテイナーゼK、2 μLの0.5 M EGTA)を、MNaseを添加したのと同じ順序で同じ時間間隔で各チューブに添加して、Mnase消化を停止します。65°Cで2時間インキュベートします。
6. 各サンプルに500 μLのフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール(PCI)を加え、ボルテックスで完全に混合します。室温で 19,800 x g で 5 分間遠心分離して相を分離し、水相を新しいチューブ(約 200 μL/サンプル)に移します。
   注意: PCIには多数の有毒成分が含まれているため、化学物質の安全フードでのみ取り扱ってください。詳しくはメーカーにご相談ください。
7. メーカーの指示に従って市販のDNA精製キット( 材料表を参照)を使用してDNAを精製し、12 μLの溶出バッファーにサンプルを溶出します。
   注:脱タンパク質化ステップ(ステップ2.5)のSDS濃度は、一部のDNA精製キットでは阻害的です。ここで使用するDNA精製キットは、エタノール沈殿と同等の性能を発揮します。
8. 2〜5μLのローディング色素を加え、1.5%アガロースゲル上で120Vで30〜50分間(適切に分離されるまで; 図1A)。
9. 実験に最適な消化度を選択し、分取 MNase 消化を続行します。最適な消化度は、サブヌクレオソーム断片がほとんどまたはまったくなく、モノヌクレオソームとジヌクレオソームの比率が70%〜90%です。
   注:この実験では、図1Aのレーン4の消化度は、2.5 x 10 5細胞に対して0.625-1.25 UのMnase(= 1 x 10⁶細胞に対して2.5-5 UのMnase)で得られた最適な消化であると判断されました。詳細な議論については、代表的な結果を参照してください。

3. 分取 MNase 消化

1. MNase 消化 によって クロマチンをモノヌクレオソームにフラグメント化するには、以前にダブルクロスリンクした 5 x 10⁶ セルアリコートを解凍し、1 mL の DPBS に再懸濁します。氷上で20分間インキュベートします(細胞がチューブ壁に付着する場合は、1x BSAを追加します)。
2. 室温で10,000 x g で5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を廃棄します。ペレットを500 μLのMB#1バッファーに再懸濁します。遠心分離ステップを1回繰り返します。ペレットを 1 mL の MB#1 バッファーに再懸濁し、200 μL のアリコート(アリコートあたり 1 x 10⁶ 細胞)を作ります。
3. MNase滴定(ステップ2で説明)に基づいて、各アリコートに適切な量のMNase(通常、1 x 10⁶ 細胞あたり2.5-10 U/μL)を添加してクロマチンを消化します。よく混合し(ボルテックスして素早く回転させ)、サーモミキサーで37°Cで10分間、800rpmの振とうでインキュベートします。
4. 各アリコートに 1.6 μL の 0.5 M EGTA (最終 4 mM) を加えて MNase 消化を停止し、サーモミキサーで 65 °C で 10 分間、800 rpm 振とうしながらインキュベートします。
5. 室温で10,000 x g で5分間遠心分離してサンプルを回収し、上清を廃棄します。細胞ペレットを500 μLの1x NEBuffer 2.1に再懸濁します。
6. 5 x 10⁶ セル以下の入力に相当するサンプルをプールして、さらに処理します。
   注:5 x 10 6 細胞以上を処理する場合は、酵素条件が 5 x 10⁶ 細胞に最適化されているため、これらのサンプルを並行して処理してください。
7. 近接ライゲーションステップに進む前に、サンプルの 10% をインプットコントロールとして移し、MNase 消化レベルをコントロールします。150 μLの10 mM Tris(pH 7.4)、25 μLの10% SDS、25 μLの20 mg/mLプロテイナーゼKをこのサンプルに加え、65°Cで一晩インキュベートします。

4. DNA末端プロセシングと近接ライゲーション

1. 残りのサンプルを10,000 x g で4°Cで5分間遠心分離して回収し、上清を廃棄します。ペレットを新たに調製したMicro-Cマスターミックス1(表1)90 μLに再懸濁し、サーモミキサーで37°C、800rpmの振とうで15分間インキュベートします。
2. 10 μL の 5 U/μL Klenow Fragment を添加し、サーモミキサー上で 37 °C で 15 分間、800 rpm の振とうでインキュベートします。
3. 調製したばかりのMicro-Cマスターミックス2(表2)100 μLを加え、サーモミキサーで25°C、800rpmの振とうで45分間インキュベートします。インキュベーション後、EDTAを最終濃度30 mMに添加して酵素反応をクエンチします。サーモミキサーで65°C、800rpmの振とうで20分間インキュベートします。
4. 4°Cで10,000 x g で5分間遠心分離してサンプルを回収し、上清を廃棄します。サンプルを新たに調製したMicro-Cマスターミックス3(表3)500 μLに再懸濁し、回転(15〜20 rpm)しながら室温で2.5時間インキュベートします。
5. 4°Cで10,000 x g で5分間遠心分離してサンプルを回収し、上清を廃棄します。サンプルを新たに調製した Micro-C マスターミックス 4 200 μL (表 4) に再懸濁し、サーモミキサーで 37 °C で 15 分間、800 rpm の振とうでインキュベートします。
6. 逆架橋および脱タンパク質化の場合は、25 μL の 20 mg/mL プロテイナーゼ K と 25 μL の 10% SDS をサンプルに加え、間欠混合しながら 65 °C で一晩インキュベートします。

5. ジヌクレオソームDNAの精製とサイズ選択

1. 500 μL の PCI をサンプルとインプットコントロールに添加し、ボルテックスで混合します。19,800 x g で 5 分間遠心分離して相を分離し、上部の水相を新しいチューブに移します。
2. DNA精製キットを使用するか、エタノール沈殿によってDNAを濃縮します。サンプルを 30 μL に溶出し(ステップ 5.3)、インプットコントロールに溶出(ステップ 3.11)を 15 μL に溶出し、1.5 % アガロースゲルを泳動させてモノヌクレオソームとジヌクレオソームを分離します(図 1B)。
   注:脱蛋白ステップからのSDS濃度は、一部のDNA精製キットでは阻害的です。ここで使用したDNA精製キット( 材料表を参照)は、エタノール沈殿と同等の性能を発揮します。使用する細胞の数に応じて、インプットは100 ngから10 μgの範囲になります。典型的には、5 x 10⁶ 細胞から1〜5μgのDNAが抽出される。
3. ジヌクレオソームサイズ(約300 bp)のDNA断片を切除します。市販のDNAゲル溶出キット( 材料表参照)を使用して、アガロースゲルからDNAを抽出し、150μLで溶出します。

6. ストレプトアビジンビーズの調製

1. サンプルあたり10 μLのストレプトアビジンビーズ( 材料表を参照)を反応チューブに移します。
2. 1.5 mLチューブ用の適切な磁石に入れます( 材料表を参照)。溶液が透明になったら(1〜2分)、上清を除去し、サンプルあたり300 μLの1x TBW(5 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.5 mM EDTA、1 M NaCl、0.05% Tween 20)にビーズを再懸濁します。この手順を 1 回繰り返します。
3. ステップ7で処理したサンプル1個あたり、150 μLの2x B&Wバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mM EDTA、2 M NaCl)にビーズを再懸濁します。

7. ストレプトアビジンプルダウンおよびオンビーズライブラリーの調製

1. 150 μLのサンプル(ステップ5.3)に150 μLの調製済みビーズを加えます(ステップ5.3)。回転(15〜20 rpm)で室温で20分間インキュベートします。
2. チューブを適切な磁石に入れ、溶液が透明になるまで待ちます(1〜2分)。上清を除去し、ビーズを300 μLの1x TBWに再懸濁します。この手順を繰り返します。
3. チューブを適切な磁石に入れ、溶液が透明になるまで待ちます(1〜2分)。上清を除去し、ビーズを 100 μL の 0.1x TE(1 mM Tris、0.1 mM EDTA、pH 8.0)に再懸濁します。
4. チューブを適切な磁石に入れ、溶液が透明になるまで待ちます(1〜2分)。上清を除去し、ビーズを 50 μL の 0.1x TE に再懸濁し、PCR チューブに移します。
   注:使用した0.1x TEの容量(50 μL)は、このプロトコルで使用されるDNAシーケンシングライブラリ調製キット( 材料表を参照)のインプット容量に対応します。別のキットまたはストラテジーを使用する場合は、それに応じて音量を調整してください。
5. シーケンシングライブラリ調製キットのDNA操作ステップを、メーカーのプロトコルに従って実行します。これらのステップには、通常、DNAブラント、Aテーリング、アダプターライゲーション、およびU切除が含まれます。最後のステップ(U切除)は、この研究で使用したキットに固有です。そのキットを使用する場合は、希釈されていないアダプターを使用して、キットプロトコルのステップ1からステップ2.6までの製造元の指示に従い、ステップ2.6以降は-20°Cの保管を考慮しないでください。
   注:シーケンシングキットに必要なバッファー交換は、DNAがまだストレプトアビジンビーズに結合しているため、ビーズを磁石に結合させて洗浄(ステップ7.3〜7.4)することによって交換する必要があります。さらに、DNAは磁気ビーズに結合しているため、キットプロトコルのアダプターライゲーション後の精製およびサイズ選択のステップは無視してください。ステップ 7.6 (このプロトコル) に進みます。
6. アダプターのライゲーションが完了したら、ステップ7.2の説明に従ってサンプルを洗浄します。上清を廃棄し、ビーズを 20 μL の 0.1x TE に再懸濁します。

8. 必要なPCRサイクルの推定

注:ライブラリ増幅に必要なPCRサイクルを推定することをお勧めします。通常、Micro-Cライブラリには8〜15サイクルのPCRが必要です。このステップは必須ではありませんが、過剰増幅を回避し、PCR重複のリスクを低減するのに役立ちます。

1. 必要な最小PCRサイクル数を定義するには、1 μLのストレプトアビジン-ビオチン-DNAサンプルでPCRを実施します(ステップ7.6)。これを行うには、PCRマスターミックス(3.2 μLのH₂O、0.4 μLのi5プライマー、0.4 μLのi7プライマー、および5 μLのQ5ハイフィデリティDNAポリメラーゼ)をサンプルに加えます。使用するDNAライブラリ調製キットの製造元の指示に従って、16サイクルでPCRを実施します。
   注:ここで使用するプライマーは、使用するライブラリ調製キットと互換性がある必要がある別のキット( 材料表を参照)で購入します。
2. PCR後、適当な磁石でビーズを採取し、高感度DNA定量装置( 材料表参照)を用いて上清1μLのDNA濃度を測定します。総DNA濃度を得るには、この値に10(PCR反応の総量)を掛けます。代表的な結果で説明されているように、必要なPCRサイクル数を推定します。
3. 残りの9 μLのPCR混合物に2 μLの6xローディングバッファーを加えます。PCR 増幅ライブラリを 1% アガロースゲルで分離し、アダプターライゲーションが成功したと判断すると、サイズは約 450 bp になります(図 1C)。
   注:ゲルは、約 420 bp の明確なバンドを示す必要があります(Micro-C ライブラリとアダプター)。120 bp のバンドはアダプターの二量体を表し、複雑度の低いライブラリを示します。低分子量のバンド(100 bp未満)が現れることがありますが、これらはPCR反応からの未使用のプライマーです。

9. シーケンシングライブラリ増幅

1. ストレプトアビジン-ビオチン-DNAサンプルの残りの19 μLにPCRマスターミックス(65 μLのH₂O、100 μLのQ5ハイフィデリティDNAポリメラーゼ、8 μLのi5プライマー、8 μLのi7プライマー)を加えます。反応混合物を50〜100μLのアリコートに分割します。
   注:PCRの最適な容量は、PCRマシンによって異なります。通常、50 μLは、一般的なPCRマシンで最も再現性の高い増幅を提供します。
2. DNAライブラリ調製キットの製造元の指示に従い、ステップ8で決定したサイクル数でPCRを実施します。ステップ8を省略した場合、PCRには14サイクルが推奨されます。
3. 常磁性ビーズ( 材料表を参照)で、メーカーのプロトコルに従って1:0.9の比率でDNAを精製します。20 μL の 0.1% TE に溶出します。
   注意: ステップ8.5でアダプターダイマーが検出された場合は、同じ比率で精製を2回行ってください。
4. DNA濃度を測定し、品質管理システムでサンプルを実行します( 材料表を参照)。Micro-Cライブラリの品質は、単一の正確なバンドが存在することで確保します(図1D)。
   注:アダプター二量体は、PCRの前にサンプルを洗浄するため、オンビーズライブラリ調製では一般的ではありません。したがって、アダプターダイマーの出現は、ライブラリの複雑さが低いことを示しています。アダプターダイマーが観察された場合は、低インプットシーケンシングでサンプルを品質管理することを強くお勧めします。

10. DNAシーケンシングとデータ処理

1. シーケンシングプロバイダーの要件に従って、ペアエンドシーケンシングでMicro-Cライブラリをシーケンシングします。
   注:理想的には、サンプルはプラットフォーム上でペアエンドモードで、リードあたり 50 bp でシーケンシングされます。2 x 35 bpなど、読み取り長が短い古いプラットフォームもうまく使用されています。重要なことは、反復ゲノム領域を研究する場合は、より長いリード長で配列決定することが望ましい場合があるということです。
2. Micro-C ライブラリの品質を評価するには、サンプルあたり 5 x 10⁶ から 1 x 10⁷ リードの低入力シーケンシングを実行します。
3. シーケンシングファイル(fastqファイル)をDistiller¹⁰で処理します。リードを適切な参照ゲノム(ここではmm10)にマッピングします。
   注: シーケンス ファイルは、ローカル コンピューターまたはコンピューティング クラスター上のさまざまなパイプラインを使用して処理できます。シーケンシング深度が浅いサンプルの場合、10,000 bp、50,000 bp、100,000 bp、500,000 bp などの大きなビンサイズにより、計算量とファイルサイズを削減できます。Distiller(この調査で使用)は、Micro-Cライブラリの品質を評価するために必要なすべてのファイルタイプを生成します。生成された *.stats ファイルには、マップレート、シストランス比、および読み取りペア間の距離によって層別化された読み取り方向に関する情報が含まれています。これらのパラメータを 図2に示し、代表的な結果でMicro-Cライブラリの品質評価について説明します。また、処理ソフトウェアは、相互作用行列^{を生成する}ためにHiGlass(https://docs.higlass.io/)に直接ロードできるmcoolファイルも生成する9。

結果

Micro-Cライブラリの調製の成功は、プロトコルのいくつかのステップで評価できます。最も重要なステップは、適切なMNase消化度を選択することです。したがって、MNase濃度は、すべてのサンプルについてジヌクレオソームに対して70%〜90%のモノヌクレオソームを一貫して得られるように滴定する必要があります。クロマチン消化はユークロマチンとヘテロクロマチンで異なり、MNaseはヘテロクロマチンを消化する効率が低いことに注意することが重要です。したがって、最適な消化度は、eu-クロマチンとヘテロクロマチンの相対的な割合が細胞タイプ特異的であるため、関心のあるクロマチン領域と研究対象の細胞タイプに依存します。したがって、必要なMNase濃度を慎重に滴定し、まず低インプットシーケンシングによってMicro-C実験の成功を評価することをお勧めします。

MNaseの量を減らして処理したクロマチンの典型的なMNase滴定パターンを 図1Aに示します。ここでは、1回の反応で250,000個の細胞由来のクロマチンを4倍希釈したMNaseで消化します。最高濃度(10 U の MNase、レーン 2)では、クロマチンが過剰に消化され、ほぼモノヌクレオソーム DNA(~150 bp)のみで構成されています。特に、モノヌクレオソームバンドの中心は、MNase濃度が低下したサンプルの対応するバンドと比較して、アガロースゲル内で低くなっており、ヌクレオソームDNAの過剰消化を示しています。過剰に消化されたヌクレオソームは、近接ライゲーション反応で非効率的にライゲーションされます。したがって、レーン 2 のサンプルは Micro-C 実験には最適ではありません。レーン 3(2.5 U の MNase)は、Micro-C 実験にほぼ適した消化度を示します。ここでは、モノヌクレオソームバンドが優勢な種であり、ヌクレオソームの過剰消化を示すサブヌクレオソーム塗抹標本が減少します。ただし、まだ存在します。レーン 4 の消化度(0.635 U の MNase)は、この滴定例の Micro-C 実験に理想的な条件です。サブヌクレオソームDNAを含まない透明なモノヌクレオソームバンドが存在します。モノヌクレオソームDNAとジヌクレオソームDNAのバンド強度はほぼ等しく、モノヌクレオソーム収量は66%以上であることを示しています。ジヌクレオソームDNAはモノヌクレオソームDNAの約2倍(~320 bp 対 ~150 bp)であるため、DNAのモルあたりのバンド強度はモノヌクレオソームDNAと比較して2倍高いことは注目に値します。レーン 5(0.156 U の MNase)の消化度は、ヌクレオソームDNAがほとんどない未消化のクロマチンを示しているため、これは最適ではないサンプルです。

結論として、この例では、2.5 x 10 5 マウス ES 細胞を 0.625 U の MNase (200 μL 中の 1 x 10⁶ 細胞の^2.5 U の MNase に相当)で消化することが、Micro-C 実験における分取消化の最も有望な出発点となります。ただし、レーン 3 とレーン 4 のサンプルに使用した条件の中間の MNase 濃度(200 μL 中の 1 x 10⁶ 細胞の MNase 5 U に相当)も考慮する必要があります。重要なことは、MNaseによるクロマチン消化は直線的にスケーリングできないため、分取消化を4倍以上にスケールすることは推奨されないことです。1 x 10 6細胞以上からMicro-Cライブラリーを調製するには、1 x 10⁶細胞のアリコートでクロマチンを消化し、MNase不活性化後にそれらをプールすることをお勧めします。

近接ライゲーションプロトコルの成功を評価するには、近接ライゲーションではなくMNase消化されたインプットコントロール(ステップ3.8)を、1.5%アガロースゲル電気泳動によって近接ライゲーションしたサンプル(ステップ5.3)と比較する必要があります(図1B)。近接連結モノヌクレオソームバンドのサイズは、ジヌクレオソームとほぼ同じ300 bpです。したがって、モノヌクレオソームからジヌクレオソームへのバンドシグナル比は、主にモノヌクレオソーム(レーン1)からジヌクレオソーム(レーン3およびレーン4)にシフトする必要があります。このステップのアガロースゲルは、切除および精製されるジヌクレオソームDNAであるため、過負荷を避けるためにサンプルを複数のレーンに分割することをお勧めします。

調製したシーケンシングライブラリの質と量を最小限のPCRで評価することが推奨されます。ここでは、1μLのビーズ(全サンプルの1/20)のDNAを10μLのPCR反応で16サイクル増幅します。最小PCRライブラリーの総濃度は、通常、16回のPCRサイクル後に50〜500ngの範囲です。理論的には、これは残りの19 μLサンプルからの1〜10 μgのライブラリーにも16サイクル増幅された場合に相当します。総DNAから約100 ngのライブラリを生成するために必要なPCRサイクルの最小数を使用することを推奨します。PCRでの対数増幅を仮定すると、16サイクルで19 μLのインプットから得られたDNAの理論濃度を2で連続して割って、100 ngのライブラリを生成するために必要なPCRサイクル数を計算できます。例えば、16サイクル後の1 μLからの収量100 ngは、19 μLから増幅された収量1,900 ngに相当します。このシナリオでは、12サイクルで全DNAから118 ngのシーケンシングライブラリを生成するのが理想的です(1,900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng)。その後、最小PCRで採取した残りの9 μLのサンプルを使用して、アガロースゲル電気泳動でライブラリの品質を評価します(図1C)。可視化では、420 bp で 1 つの異なるバンドが表示され、アダプター二量体(120 bp)のバンドは表示されません。より小さい片はまた現われることがあり、これらは未使用のPCRのプライマーに対応する。

次に、リソースを大量に消費するディープシーケンシングを行う前に、低インプットシーケンシングによる Micro-C サンプル調製の成功を解析し、確認することをお勧めします。典型的には、ライブラリは、5 x 10⁶〜1 x 10⁷のリード深度にシーケンシングされ、以下の基準に基づいて評価される:シーケンシングリード重複率、シス対トランス染色体相互作用率、およびシーケンシングリード配向頻度。Micro-Cライブラリは、cooler、pairtools、およびcooltools^10、11、12を使用して、シーケンシングリードファイル(Fastq形式)からリードペアファイル(Bedpe形式)およびスケーラブルインタラクションマトリックス(CoolおよびMcool形式)までのデータを処理するフルサービスパイプラインであるDistillerで処理されます。パイプラインは、Micro−Cライブラリ¹⁰(https://github.com/open2c/distiller-nf)の品質を評価するのに理想的な要約ファイルも生成する。PCR重複率は、シーケンシングライブラリの複雑さに関する情報を提供し、生成された*.statsファイルから抽出できます。高品質のMicro-Cライブラリは、500万個以上の細胞から生成された場合、PCR複製率が5%〜10%未満です。特に、一部のシーケンシングプラットフォームでは、シーケンシングライブラリの複雑さとは無関係に、クラスター形成中にPCR複製が生成されます。図2Aは、2つの実験(1つは良いサンプル、もう1つは悪いサンプル)の相対的な重複率を示しています。この例では、両方のサンプルが許容可能なマップ レートを表示しています。Micro-Cライブラリの品質を評価するための次の基準は、シス対トランス比と読み取り方位周波数です。核内では、染色体は個々の染色体領域に生息しているため、他の染色体と相互作用することはめったにありません。経染色体相互作用の検出率が高いということは、ランダムライゲーションの割合が高いことを示しています。このレベルの分析では、不良サンプルは良品サンプルと比較して高い割合で染色体間相互作用を示したことに留意する必要があります(図2B)。Micro-Cでは、シスと染色体相互作用率が70%以上であることが望ましい。

Micro-CライブラリーのフラグメントサイズはジヌクレオソームDNAバンドと同程度で、近接ライゲーションされたサンプルと共精製し、実験を汚染する可能性があります。これらの汚染物質は、常にシスと染色体間の相互作用です。したがって、読み取り方向率も評価することが重要です。ジヌクレオソームのコンタミネーション率は、低インプットシーケンシングによって推定できます。ジヌクレオソームDNAは、MNaseによって切断されていない2つの隣接するヌクレオソームに由来します。したがって、結果として得られるシーケンシングリードは、常に順逆リード方向(FおよびR)を示し、リードペア間の距離は約320bpになります。一方、近接ライゲーションされたフラグメントは、4つの配向でライゲーションすることができ、F-R、R-R、R-F、およびF-Fのリードペアを、理想的には等量で生成します(図2C)。さらに、2 つの読み取りペア間のさまざまな距離が表示されます。ジヌクレオソーム汚染物質の量を推定するには、distiller が生成した *stats ファイルから読み取り方向の頻度を計算できます(図 2D)。注目すべきは、この研究では、F-Rリードの割合(赤)が良品サンプルと比較して不良サンプルで高く、これはリードオリエンテーションを距離別に層別化するとより顕著になりました(図2E)。F-R画分は、リードペアが<562 bpまたは≥562 bpの距離を持つリードに層別化されている場合、Micro-Cライブラリと比較してジヌクレオソームフラグメントが支配的です。ここでは、距離が <562 bp のリードの割合が F-R リードが支配的であるのに対し、距離が ≥562 bp のリードの割合は、考えられる 4 つの方向の間で均等な分布を示しており、F-R リードの全体的な過剰表現がジヌクレオソーム汚染物質に起因していることを示しています。サブセット化のしきい値として 562 bp を選択するかどうかは、生成された *stats ファイルのビニングによって定義されます。この品質管理には必要ありませんが、distiller によって生成される *pairs ファイルから距離を抽出することで、より明確なサブセット化を実現できます。ジヌクレオソームリードは、データ処理中に同定および無視できるため、Micro-Cサンプルの品質を低下させないことに注意することが重要です。ただし、3Dインタラクションに関する貴重な情報が含まれておらず、有益な読み物が希薄化します。

したがって、慎重なMNase滴定と低インプットシーケンシングによる徹底した品質管理は、Micro-C実験の品質を最適化するための最良のツールです。

図1:Micro-Cプロトコルの中間段階 。 (A)さまざまなMNase濃度で消化した2.5 x 10⁵ 個のマウスES細胞からのクロマチンのアガロースゲル電気泳動。モノヌクレオソーム、ジヌクレオソーム、トリヌクレオソームバンドは矢印で示されています。M:DNAラダー(レーン1/6);250,000 細胞あたり 10 U の MNase(レーン 2)。250,000 細胞あたり 2.5 U の MNase(レーン 3);250,000 細胞あたり 0.625 U の MNase(レーン 4)。250,000 細胞あたり 0.156 U の MNase(レーン 2)。(B)Micro-C で調製したサンプルの 1.0% アガロースゲル電気泳動(レーン 3 およびレーン 4)と MNase 消化インプットコントロール(レーン 1)。レーン 1 とレーン 2(M:DNA ラダー)は、モノヌクレオソームからジヌクレオソームへのフラグメント強度の相対的な変化を強調するために強化されています。モノヌクレオソームバンドとジヌクレオソームバンドは矢印で示されています。近接ライゲーションサンプルのジヌクレオソームバンドは、ジヌクレオソームとMicro-CライブラリーDNAを組み合わせたものです。(C)1 μLのサンプルから増幅したMicro-Cシーケンシングライブラリの1.0%アガロースゲル電気泳動で品質を評価しました。レーン1(M):DNAラダー;レーン 2 (S): Mirco-C ライブラリ。(D)最終的な Micro-C ライブラリのフラグメントアナライザートレース。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:良品サンプルと不良品サンプルの低入力シーケンシングのサンプル統計。 (A)マッピングされた読み取り(緑)とマッピングされていない読み取り(赤)の割合の棒グラフ。(B)シスと染色体間相互作用をマッピングするリードの正規化された画分。データ・セットは、読み取りられた cis マッピングに正規化されました。シスマッピングリードは、ペアエンドシーケンシングされたサンプルの1回目と2回目のリード間の距離(≤1 kbp(黄色)、>1 kbpおよび≤10 kbp(オレンジ)、および>10 kbp(赤))によって層別化されました。(C)ジヌクレオソームサイズの潜在的な分子種の模式図。(D)良品サンプルと不良品サンプルのすべてのリードのリードペア配向率。(E)パネル(D)と同じだが、距離(左<562bp、右≥562bp)で層別化。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

コンポーネント	1倍速	4.4倍速
10倍速NEBuffer 2.1、	10 μL	44 μL
2 μL 100 mM ATP	2 μL	8.8μL
100 mM DTT (英語)	5 μL	22 μL
H2O	68 μL	299.2μL
10 U/μL T4 PNK	5 μL	22 μL
トータル	90 μL	396 μL

表1:Micro-Cマスターミックス1。 咀嚼反応終了のためのマスターミックスの組成。

コンポーネント	1倍速	4.4倍速
1 mM ビオチン-dATP	10 μL	44 μL
1 mM ビオチン-dCTP	10 μL	44 μL
dTTPとdGTPの10 mMミックス	1 μL	4.4μL
10x T4 DNAリガーゼバッファー	5 μL	22 μL
200倍速BSA	0.25μL	1.1μL
H2O	23.75 μL	104.5μL

表2:Micro-Cマスターミックス2。 末端標識反応のためのマスターミックスの組成。

コンポーネント	1倍速	4.4倍速
10x NEB T4 リガーゼ反応バッファー	50 μL	220 μL
H2O	422,5 μL	1859μL
T4 DNAリガーゼ	25 μL	110μL

表3:Micro-Cマスターミックス 3. 近接ライゲーション反応のためのマスターミックスの組成。

コンポーネント	1倍速	4.4倍速
10倍速NEBuffer 1.1	20 μL	88μL
H2O	180μL	792 μL
ExoIIIヌクレアーゼ	10 μL	44 μL

表4:Micro-Cマスターミックス 4. ビオチン除去反応のためのマスターミックスの組成。

ディスカッション

Micro-C実験の成功は、慎重に実行する必要があるプロトコルのいくつかの重要なステップにかかっています。まず、追加の架橋剤DSGまたはEGSとの架橋により、細胞の種類に応じて細胞の凝集につながる可能性があります。架橋反応に0.1%〜0.5%のBSAを添加すると、架橋効率に影響を与えることなく凝集が大幅に減少します。非効率的な架橋は、ランダムなライゲーションを示すトランス染色体相互作用の割合の増加につながる可能性があります。このプロトコルの第2、しかし最も重大なステップはMNaseのchromatinの消化力である。クロマチン消化が最適でないと、近接ライゲーションが非効率的になったり(過剰消化)、非近接ライゲーションされたジヌクレオソームの発現率が上昇したり(消化不足になったりします)。ライゲーション反応の効率は、アガロースゲル電気泳動(図1B)によって評価でき、さらに低インプットシーケンシングによって最もよく推定されます。低インプットシーケンシングにより、高い重複率(非効率的なライゲーション)またはジヌクレオソーム率の増加が明らかになった場合は、MNase消化度を再評価する必要があります。特に、プロトコル実行時にサンプルが失われると、ライブラリの複雑さが軽減される可能性があります。サンプルの濃度は、DNA精製後(ステップ5.3)または最小限のPCR(ステップ8)で評価するのが最適です。DNA精製後の5×106^個の哺乳 類細胞由来のDNAの総収量は、典型的には>2μgである。DNA濃度は、MNase消化、ExoIII消化、およびDNA精製後に制御する必要があります。内因性ヌクレアーゼは、その存在量が細胞タイプ特異的および種特異的であり、DNA分解の原因となる可能性があります。さらに、カラムベースのDNA精製では、脱タンパク質反応によるSDSとの相溶性がないため、サンプルの損失につながる可能性があります。このステップでDNA濃度が低い場合は、エタノール沈殿を考慮することができます。

Micro-Cはサンプル特異的なMNase滴定を必要とするため、さまざまなモデル生物、胚や単一細胞、オルガノイド、患者生検などの小さな細胞集団にMicro-Cを適用することは困難です。ここで、Hi-C 3.0は、配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる終末反応を用いた確立された代替手段を提供する^8,9。

Micro-Cは、広いダイナミックレンジと低いS/N比を備えた、広く適用可能な高分解能染色体コンフォメーション技術であり、染色体ループなどの短距離染色体の特徴^4,5,8の調査に特に適しています。Micro-Cの分解能は、Hi-Cの検出限界を超えるプロモーター-エンハンサーループを捕捉することを可能にし、ゲノム構成と制御の関係をより詳細に解析することを効率的に可能とする13,14,15。さらに、最近では、DNA捕捉戦略をMicro-Cと組み合わせることで、標的ゲノム遺伝子座の遺伝子座特異的分解能を前例のないレベルに引き上げ、3Dゲノムの超微細構造に関する新たな洞察を明らかにしています16,17,18。要約すると、Micro-Cとその誘導体は、転写制御、ひいては細胞型の分化と維持における3Dゲノムの役割を解剖するための重要な技術になると考えています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mM Biotin dATP	Jenna Bioscience	NU-835-Bio14-S
1 mM Biotin dCTP	Jenna Bioscience	NU-809-BioX-S
10 mM dGTP	NEB	N0442S
10 mM dTTP	NEB	N0443S
10 U/ml T4 PNK	NEB	M0201L
100 U/L Exonuclease III	NEB	M0206L
10x NEBuffer 1.1	NEB	B7001S
10x NEBuffer 2.1	NEB	B7202S
10x T4 DNA Ligase buffer	NEB	B0202A
1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+	ThermoFisher	14190144
1x LIF
2_Mercaptoethanol 50 mM	Gibco	31350010	0.1 mM b-mercaptoethanol
37% Formaldehyde	Sigma Aldrich	252549-500ML	Caution. See manufactures MSDS
400 U/ml T4 DNA Ligase	NEB	M0202L
5 U/ml Klenow Fragment	NEB	M0210L
Agarose	BIO-RAD	1613102	Caution. See manufactures MSDS
BSA 20mg/ml	NEB	B9000S
CaCl2
cell counter
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D8418-100ML	Caution. See manufactures MSDS
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Invitrogen	65001
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12321D	refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes
DynaMag-PCR Magnet	Invitrogen	492025	refered to as: magnet magnet for PCR tubes
EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0	Invitrogen	15575-038
EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0	BioWorld	40121266-1
Ethanol 96%	VWR Chemicals	20824365	quality control system
Ethidium Bromide	Invitrogen	15585-011
Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS)	ThermoFisher	21565
Fetl Bovin Serum	Sigma Aldrich	F7524	15% FBS
Gel Loading dye purple (6X)	NEB	B7024S
Glycine	PanReac AppliChem	A1067.0500
Halt Proteinase inhibitor (100x)	ThermoFisher	78430	Caution. See manufactures MSDS
IGEPAL CA-630 (NP-40)	Sigma Aldrich	18896-50ML
MgCl 1 M	Invitrogen	AM9530G
Micrococcal Nuclease (MNase)	Worthington	LS004798
mouse embryonic stem cells
NaCl	Sigma Aldrich	S9888-1KG
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers)	NEB	E7600S	amplification primers for sequencing libraries
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina	NEB	E7645L	sequencing library preparation kit
NEBNext Ultra II Q5 Master mix	NEB	M0544S	Caution. See manufactures MSDS
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	1x NEAA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	1% Pen-Strep
Proteinase K (40 mg/ml)	GoldBio	P-480-1	Caution. See manufactures MSDS
QIAquick Gel extraction kit	QIAgen	28706	refered to as: DNA gel elution kit
QIAquick PCR purification kit	QIAgen	28106	refered to as: commercial DNA purification kit
Qubit dsDNA HS Assay kit	Invitrogen	Q32854	high sensitivity DNA quantification instrument
Quick load purple 1kb plus DNA Ladder	NEB	N0550S
SPRIselect size selection beads	Beckman Coulter	B23319	paramagnetic beads
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015	refered to as: thermomixer
Tris	Merck	10708976001
Trypsin
Tween20	Sigma Aldrich	P7949-100ML
Ultrapure 10% SDS	Invitrogen	15553-035
Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI)	Invitrogen	15593-031
Fragment Analyzer