継代なしの正常および腫瘍乳腺組織からのマウスおよびヒト上皮オルガノイドの生成とイメージング

要約

このプロトコルでは、一次正常および腫瘍乳腺組織から差動遠心分離によって上皮オルガノイドを生成するためのアプローチについて説明します。さらに、包埋オルガノイドの3次元培養および免疫蛍光イメージングのための説明書が含まれています。

要約

オルガノイドは、その自己組織化特性と、初代組織または幹細胞からの増殖後の機能と構造の保持により、臓器組織をモデル化するための信頼できる方法です。このオルガノイド生成方法は、複数の継代による単一細胞分化を放棄し、代わりに差動遠心分離を使用して、機械的および酵素的に解離した組織から乳腺上皮オルガノイドを分離します。このプロトコルは、コラーゲンおよび基底細胞外マトリックスへのオルガノイド埋め込みの技術に加えて、マウスおよびヒト乳腺組織の両方から大小の上皮オルガノイドを迅速に生成するための合理化された技術を提供します。さらに、オルガノイドの形態と密度を視覚化する目的で、ゲル内固定と免疫蛍光染色の指示が提供されています。これらの方法論は、免疫細胞との共培養やコラーゲン浸潤アッセイによるex vivo転移モデリングなど、無数のダウンストリーム分析に適しています。これらの解析は、細胞間の挙動をよりよく解明し、腫瘍微小環境内の相互作用をより完全に理解するのに役立ちます。

概要

in vitroで上皮細胞をモデル化する能力は、in vivoではアクセスできない細胞の特徴を捉えるため、現代の生物医学研究の基礎となっています。例えば、2次元平面で増殖する上皮細胞株は、増殖中に上皮細胞で起こる分子変化の評価を提供することができます¹。さらに、シグナル伝達と遺伝子発現との間の動的調節を測定することは、in vivoシステム²において制限される。がん研究において、がん上皮細胞株モデリングにより、疾患進行の分子ドライバーと潜在的な創薬標的の同定が可能になり^ました3。しかし、2次元平面上で増殖する癌上皮細胞株には限界があり、ほとんどが遺伝的に不死化および改変されており、多くの場合、本質的にクローンであり、非生理学的条件で増殖する能力のために選択され、3次元(3D)腫瘍組織構造の評価に制限があり、現実的な組織環境内での微小環境相互作用を適切にモデル化していない⁴。これらの制約は、インビボで、遠隔臓器部位での浸潤、播種、循環、およびコロニー形成を含むいくつかの異なる生物学的段階を含む転移のモデリングにおいて特に明白^である5。

癌上皮オルガノイドは、腫瘍の3D環境および挙動をよりよく再現するために開発されてきた⁶、^7、8。オルガノイドは、単一のLRG5+腸陰窩細胞から最初に開発され、in vitroで小腸の階層構造を維持する陰窩絨毛ユニットの3D構造を表すように分化^{しました9。}このアプローチにより、恒常性およびストレス条件下での自己組織化組織構造のリアルタイムの視覚化と特性評価が可能になりました。自然な拡張として、結腸直腸癌¹⁰、膵臓¹¹、乳房12、肝臓13、肺14、脳15、および胃癌¹⁶を含む多くの異なる癌タイプをモデル化するために癌上皮オルガノイドが開発されました。癌上皮オルガノイドは、癌の進化^17,18および転移時空間行動^19,20を特徴づけ、腫瘍の不均一性21を調査し、化学療法をテストするために利用されてきました²²。癌上皮オルガノイドはまた、進行中の臨床試験中に単離および収集され、抗癌剤および放射線療法に対する患者の反応を予測するためにex vivo^で8、²³、^24、25である。さらに、癌上皮オルガノイドを組み込んだ系を免疫細胞などの他の非癌細胞と組み合わせて、腫瘍微小環境のより包括的なモデルを形成して相互作用をリアルタイムで視覚化し、癌上皮細胞がナチュラルキラー細胞などの細胞傷害性エフェクター免疫細胞の基本的な性質をどのように変化させるかを明らかにし、潜在的な免疫療法および抗体薬物依存性細胞傷害活性を試験することができる^26、27,28。本稿では、継代やコラーゲンおよび基底細胞外マトリックス(ECM)への埋め込みを行わずに上皮オルガノイドを生成する方法を示します。さらに、単離されたオルガノイドの下流イメージングのための技術も共有されています。

プロトコル

この原稿で利用されているすべてのマウス組織は、テキサス大学サウスウェスタン医療センターの施設内動物管理使用委員会(IACUC)の規制およびガイドラインに従って倫理的に収集されています。同様に、すべての患者は、治験審査委員会(IRB)の監督下で組織提供の前に同意し、サンプルは匿名化されました。

注:このプロトコルは、初代組織からのオルガノイドの生成について説明しています。

1.材料の一晩の準備

1. 基底細胞外マトリックス(BECM)に包埋する場合は、BECMアリコートを4°Cで放置して解凍します。

2.コラゲナーゼおよびウシ血清アルブミン(BSA)コーティング溶液の調製

1. 2.64% BSA/PBSコーティング溶液(BSA溶液)の調製:50 mL/0.2 μmのフィルターフラスコを使用して、滅菌フィルター50 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と4.10 mLの30%BSA溶液。このBSAソリューションは、フィルタリングして再度使用することができます。
2. マウス乳腺組織用のコラゲナーゼ溶液を調製する:50 mL/0.2 μmフィルターフラスコを使用して、27 mLの基礎細胞培地、1.5 mLのウシ胎児血清(FBS)、30 μLの50 mg/mLゲンタマイシン、15 μLの10 mg/mLインスリン、600 μLの0.1 g/mLコラゲナーゼA、および600 μLの0.1 g/mLトリプシンを50 mL/0.2 μmのフィルターフラスコを使用して滅菌フィルターします。組織質量に応じて、マウスあたり10 mL〜30 mLのコラゲナーゼ溶液を割り当てます。
3. ヒト乳房組織用のコラゲナーゼ溶液を調製する:滅菌フィルター18 mLのRPMI-1640、200 μLの100xペニシリン-ストレプトマイシン溶液(ペン/ストレプトマイシン溶液)、200 μLの10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)バッファー、1 mLのFBS、および50 mL/0.2 μmフィルターフラスコを使用した400 μLの0.1 g/mLコラゲナーゼA。組織質量に応じて、組織サンプルあたり10 mLから20 mLの間で割り当てます。

3. メディアの準備

1. オルガノイド培地の調製:50 mL/0.2 μmフィルターフラスコを使用して、1%ペン/連鎖球菌および1%インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)を含む滅菌フィルター基底細胞培地。オルガノイド成長因子培地を作製するには、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を最終濃度2.5 nMまで添加します。
2. 乳腺上皮培地の調製:100 mLの乳腺上皮培地を作製するには、1 mLの100xグルタミンサプリメント、1 mLのペン/連鎖球菌、1 mLの10 mM HEPESバッファー(7.3 pH)、250 μLの30%BSAストック、1 μLの1 mg / mLコレラ毒素ストック、1 mLの50 μg / mLヒドロコルチゾンストックをPBSに含みます。 150 mL/0.2 μmのフィルターフラスコを使用して、50 μLの10 mg/mLヒトインスリン溶液、10 μLの50 μg/mLの上皮成長因子(EGF)ストック、および1%FBS。培地を4°Cで保存し、最大2週間使用します。
3. アムホテリシン洗浄の準備:2%ペン/連鎖球菌および2%アムホテリシンBを含む滅菌フィルターPBSを4°Cで保存します。

4.組織の収集と消化

1. マウス乳腺組織
   1. CO 2チャンバーに₂ 〜5分間入れてマウスを安楽死させ、その後頸部脱臼を続けます。腹側を上に向けて、マウスの手足を広げ、4本の19 G針を使用して、吸収パッドで覆われたボードに足でマウスを固定します。70%エタノールをスプレーして、毛皮を滑らかにし、皮膚を消毒します。ガーゼパッドまたはティッシュで糞便を拭き取ります。
   2. 肛門生殖器領域のすぐ上から始めて、腹膜を突き刺さないように注意しながら、外科用ハサミを使用して正中線から上向きに切ります。あごに到達したら、鎖骨と後ろ足の両方を横方向に切り込み、マウスの皮膚をボードにぴんと張って固定して乳脂肪パッドを露出させます。
   3. 後肢の近くにある鼠径リンパ節を特定することにより、野生型マウスの鼠径乳腺脂肪パッドを見つけます。野生型マウスの胸部乳腺パッドを、前肢の下のより厚い血管新生組織として見つけます。
   4. 鉗子を使用して乳脂肪パッドを持ち上げます。下にある筋肉を集めることは避けてください。鋭利な鈍いはさみの鈍い端を使用して、乳房脂肪パッドの下に皮膚から離れたポケットを作成します。乳腺脂肪パッドを一枚に切り取ります。
   5. 乳脂肪パッドを取り除いたら、PBSですすいでから滅菌組織培養皿に入れます。組織培養フードに素早く移します。
      注:乳腺腫瘍の場合は、PBSで濡らした綿棒を使用して、腫瘍を皮膚からそっと転がします。暗い変色は壊死を示し、健康なオルガノイドを生成しないため、暗い部分や柔らかい部分は避けてください。
   6. 乳腺腫瘍を#10または#11メスで細かく刻み、ペースト状の粘稠度に達するまで組織を緩めます。メスを使用して、ミンチ組織を10〜30 mLのコラゲナーゼ溶液を含むコニカルチューブに移します。すべての組織を確実に収集するために、1 mLのコラゲナーゼ溶液を組織培養プレートにピペットで移し、円錐形チューブに戻します。
      注:より大きなオルガノイドを生成するには、機械的消化を最小限に抑え、目に見える小さな組織片をそのまま残す必要があります。あるいは、組織は、生存率の損失を最小限に抑えて、後のオルガノイド調製のために凍結保存することができる。これを行うには、PBSまたは基底細胞培地+ 1%FBSの溶液で組織を洗浄し、次に粗くミンチして表面積を増やします(組織を1つまたは2つの固体片に保ちます)。組織を凍結バイアルに移し、凍結培地(90%FBS + 10%ジメチルスルホキシド(DMSO))で上部を移動します。液体窒素での保管に移る前に、制御された速度の凍結容器でバイアルを一晩凍結します。
   7. コニカルチューブを37°Cのベンチトップ振とうインキュベーターに180 RPMで入れ、組織が糸状になり、コラゲナーゼ溶液が白濁するまで入れます。例えば、腫瘍からの大きな組織塊(約500〜800mg)は30〜60分かかる。野生型の乳脂肪パッドからのより小さな組織塊(約100〜300 mg)は約20〜30分かかります。不明な場合は、5分間隔で確認してください。
   8. インキュベーション後、コニカルチューブを室温(RT)で550 x g で10分間遠心分離します。
   9. 円錐管から上清を注意深く吸引する。
      注:今後は、すべてのピペットチップ、血清学的ピペット、およびコニカルチューブをBSA溶液でプレコートして、プラスチックへの付着によるオルガノイドの損失を防ぎます。
   10. 8 mLの基礎細胞培地と80 μLのDNase溶液[2 U/μL]をチューブに加えます。1〜3分間静かに反転させます。
   11. 12 mLの基礎細胞培地をチューブに加え、ピペッティングで慎重に混合するか、チューブを15回ゆっくりと回転させて混合します。
   12. RTで550 x g で10分間遠心分離します。
   13. 上清を吸引し、次いでペレットを12mLの基礎細胞培地に再懸濁する。
   14. 最も重い組織片を底に落ち着かせます。血清学的ピペットで上清を収集し、15 mLコニカルチューブに移します。この懸濁液には、上皮オルガノイドと間質/免疫細胞が含まれています。
2. 人間の乳房組織
   1. ヒト乳房組織サンプルをオルガノイド用に処理するか、収集から24時間以内に保管します。サンプルを1%100倍抗生物質抗真菌剤を含むCO₂非依存培地に4°Cで保存します。
   2. 組織を組織培養プレートに移します。プレートを傾けて余分な保存培地を吸引し、5 mLのアムホテリシンB洗浄液で組織を洗い流します。アムホテリシンBウォッシュをすぐに取り外します。
   3. 組織サンプルを#10または#11メスで細かく刻み、ペースト状の粘稠度に達するまで組織をほぐします。メスを使用して、ミンチ組織を10〜30 mLのコラゲナーゼ溶液を含むコニカルチューブに移します。すべての組織を確実に収集するために、1 mLのコラゲナーゼ溶液を組織培養プレートにピペットで移し、コニカルチューブに戻します。
      注:より大きなオルガノイドを生成するには、機械的消化を最小限に抑え、目に見える小さな組織片をそのまま残す必要があります。このプロトコルの開始組織量は100〜250 mgの範囲でした。.あるいは、組織は、上記のように90%FBS+10%DMSO中でステップ4.2.2後の生存率の損失を最小限に抑えて、後のオルガノイド調製のために凍結保存することができる。
   4. コニカルチューブを37°Cのベンチトップ振とうインキュベーターに180 RPMで入れ、組織が小さくなりコラゲナーゼが濁るまで入れます。5分間隔で組織を確認してください。ヒトサンプルのコラゲナーゼ解離には約5〜20分かかります。
   5. インキュベーション後、円錐管をRTで550 x g で10分間回転させます。
   6. 円錐管から上清を注意深く吸引する。
      注:今後は、プラスチックへの付着によるオルガノイドの損失を避けるために、すべてのピペットチップ、血清学的ピペット、およびコニカルチューブをBSA溶液でプレコーティングします。
   7. 4 mLの基礎細胞培地と40 μLのDNase溶液[2 U/μL]を円錐管に加えます。3分間穏やかに反転させます。
   8. 6 mLの基底細胞培地をチューブに加え、ピペッティングで慎重に混合するか、円錐チューブを15回静かに回転させて混合します。
   9. RTで550 x g で10分間遠心分離します。
   10. 上清を吸引し、次いでペレットを10mLの基礎細胞培地に再懸濁する。
   11. 最も重い組織片を底に落ち着かせます。上清を集め、15 mLのコニカルチューブに移します。この懸濁液には、上皮オルガノイドと間質/免疫細胞が含まれています。

5.差動遠心分離

1. RTで550 x g に3〜4秒間パルスし、上清を吸引し、ペレットを10 mLの基底細胞培地に再懸濁します。この手順をさらに3回繰り返します(合計4回のスピン)。
2. 各遠心分離の後、ペレットがますます不透明になることを確認してください。この残りのペレットは上皮オルガノイドになります。

6.小さなオルガノイドの収集

1. 上清を新鮮なBSAコーティングチューブに集め、次にRTで550 x gで3秒間パルスして、小さなオルガノイドをペレット化します。

7. BECMへのオルガノイドの埋め込み

1. ウェルあたりのBECM量に対するオルガノイド密度に従って、オルガノイドの適切な懸濁液を微量遠心チューブに分注します(表1)。例えば、96ウェルプレートの1ウェルで20μLのBECMに対して50〜100個のオルガノイドを使用します。
   注:オルガノイド密度は、次の式を使用してカウントできます:((オルガノイドの平均数)/ 50 μL)x希釈係数。
2. 氷上ですべての手順を実行します。解凍したBECMを組織培養フード内の氷上に置きます。フードを準備しながら、すべてのピペットチップを氷の上に置いて冷まします。
3. 微量遠心チューブをRTで300 x g で10分間遠心分離し、チューブから上清を廃棄します。オルガノイドペレットの入ったチューブを氷に移し、各微量遠心チューブに適切な量のBECMを加えます(表1)。
   注意: BECMは粘性があるため、ピペットチップの損失を考慮して、BECMの追加ボリューム(ドームボリュームの約10%〜20%追加)を追加します。
4. 気泡が発生しないように注意しながら、ゆっくりと上下にピペットでオルガノイドをBECMに再懸濁します。
5. BECMで懸濁したオルガノイドをゆっくりと慎重にめっき表面にピペットで移します。ピペッティングしながら、ゆっくりとピペットを上げてドームを作ります。湿度を維持するために、空のウェルをすべてPBSで満たします。
6. プレートを37°Cのインキュベーターに1時間入れてBECMを固化させた後、適切な量の培地で覆います(表1)。

8. コラーゲンへのオルガノイドの埋め込み

1. 氷上ですべての手順を実行します。15 mLのコニカルチューブに375 μLの10x DMEM、100 μLの1 N水酸化ナトリウム(NaOH)、および3 mLのラットテールコラーゲンI溶液を順番に組み合わせて、コラーゲン溶液を調製します。泡を作らないように注意しながらピペットミックス。必要に応じて、少量(1〜3 μL刻み)のNaOHまたは10x DMEMを使用して、溶液を7.2〜7.4のpHに滴定します。
2. ウェルの底を完全に覆うのに必要な最小限の量のコラーゲンでウェルの底をコーティングします。1つのアプローチは、少量のコラーゲンを配置し、プレートを左右に揺り動かしてコーティングすることです。コラーゲンの下敷きを37°Cで30分-2時間設定します。
3. ウェルあたりのコラーゲン量に対するオルガノイド密度に従って、オルガノイドの適切な懸濁液をマイクロ遠心チューブに分注します(表1)。37°Cのインキュベーターに入れます。
4. コラーゲン溶液を4°Cで保存し、10分ごとに顕微鏡下で繊維形成をチェックして重合をモニターします。コラーゲンは30分から2時間の間に適切な重合に達します。
   注:適切な重合は、マトリックス全体に分岐する繊維の存在によって決定できます。視野内にいくつかの繊維が観察されたら、すぐに手順8.5に進みます。
5. 微量遠心チューブを300 x g でRTで10分間遠心分離し、チューブから上清を廃棄します。オルガノイドペレットを氷に移し、適切な量のコラーゲンを各微量遠心チューブに加えます(表1)。
   注意: コラーゲンは粘性があるため、ピペットチップの損失を考慮して、コラーゲンの追加容量(ドームボリュームの約10%〜20%追加)を追加します。
6. オルガノイドをコラーゲンに再懸濁させるためにゆっくりと上下にピペットで、泡が出ないように注意します。
7. コラーゲン懸濁オルガノイドをゆっくりと慎重にめっき表面にピペットで移します。ピペッティングしながら、ゆっくりとピペットを上げてドームを作ります。湿度を維持するために、空のウェルをすべてPBSで満たします。
8. プレートを37°Cのインキュベーターに1時間入れてコラーゲンを固化させた後、適切な量の培地で覆います(表1)。
9. 注:オルガノイドは、3Dマトリックス中で最大7日間生存率を維持します。イメージングを解析に使用している場合は、手順 9 と 10 に進みます。

9. 埋め込みオルガノイドの固定

1. ピペットを使用して、ECMドームと接触することなくウェルからすべての培地を除去します。
2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)/ PBS溶液で5分間固定します。
3. ゆっくりと動くシェーカーに置いた後、PBSをウェルに塗布して2〜3回洗浄します。洗浄後、新鮮なPBSをドームに塗布し、プレートを4°Cで保管します。

10. 包埋オルガノイドの免疫蛍光染色

1. 免疫蛍光染色用溶液の調製
   1. 透過処理バッファー:10%Triton X-100を含むPBS溶液を調製します。
   2. ブロッキングバッファー:10%FBSおよび0.2%トリトンX-100を含むPBS溶液を調製します。
   3. 抗体希釈バッファー:2% FBS および 0.2% Triton X-100 を含む PBS 溶液を調製します。
2. 透過処理とブロッキング
   1. ECMドームを覆うのに十分な透過処理バッファーをピペットで入れる。ゆっくりと動くシェーカーでRTで1時間インキュベートします。
   2. ピペットで透過処理バッファーを除去し、同量のブロッキングバッファーを3時間適用します。
3. 一次抗体インキュベーション
   1. ブロッキングバッファーをピペットで除去し、一次抗体を含む抗体希釈バッファーをメーカー指定の濃度で塗布します。ゆっくりと動くシェーカーでサンプルを4°Cで12〜16時間インキュベートします。
   2. 一次抗体溶液を取り出し、ゆっくりと動くシェーカーでRTでPBSでサンプルを10分間3回洗浄します。
4. 二次抗体インキュベーションと核染色
   1. 残りのPBS洗浄液を吸引し、二次抗体を含む抗体希釈バッファーをメーカー指定の濃度で塗布します。さらに、DAPIまたはヘキスト(核を標識するため)またはファロイジン(アクチンを標識するため)を1:250の比率でバッファーに追加します。ゆっくりと動くシェーカーでRTで2〜4時間インキュベートします。
   2. 二次抗体溶液を取り出し、シェーカーのRTでPBSでサンプルを10分間3回洗浄します。イメージングするまでサンプルを4°CでPBSに保存します。

結果

図1に掲載されている画像は、ヒトおよびマウス組織からの野生型および腫瘍性乳腺上皮オルガノイドの例を示しています。図1Aの漫画のワークフローでは、差動遠心分離によって上皮オルガノイドを単離する方法の一目でわかる図が示されており、明視野画像に示すように、異なる種の一次組織をほぼ同じ方法で処理しながら上皮組織を生成でき?...

ディスカッション

腫瘍オルガノイドを生成するための様々な方法が文献に記載されている。このプロトコルは、継代なしで腫瘍から直接腫瘍オルガノイドを生成する方法を強調しています。この方法を使用すると、腫瘍オルガノイドは、手順を開始してから数時間以内に生産可能であり、文献³¹で報告されている70%と比較して、ほぼ100%の生存可能なオルガノイドを生成します。比較すると、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mM HEPES Buffer	Gibco	15630080
100x Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-096
100x Glutamax	Life Technologies	35050-061	Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Life Technologies	51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Sigma	P4333
10x DMEM	Sigma	D2429
50 mL/0.2 µm filter flask	Fisher	#564-0020
Amphotericin B	Life Technologies	15290-018
bFGF	Sigma	F0291
BSA Solution (32%)	Sigma	#A9576
Cholera Toxin	Sigma	C8052
CO2-Independent Medium	Gibco	18045-088
Collagenase A	Sigma	C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Sigma	D4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma	D6546	Common basal medium
D-MEM/F12	Life Technologies	#10565-018	Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma	#D8662	PBS
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F0926
Gentamicin	Life Technologies	#15750-060
Human epidermal growth factor (EGF)	Sigma	E9644
Hydrocortisone	Sigma	H0396
Insulin	Sigma	#I9278
Matrigel	Corning	#354230	Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N)	Sigma	S2770
Rat Tail Collagen I	Corning	354236
RPMI-1640 media	Fisher	SH3002701
Trypsin	Life Technologies	27250-018