マルチウェルデバイスの固体培地上での単離 されたカエノラブディティスエレガンスの 長期培養とモニタリング

要約

ここには、微細加工されたマルチウェルデバイスの固体培地上で単離された個々の線虫を培養するための最適化されたプロトコルが提示されます。このアプローチにより、個々の動物を生涯を通じて監視して、活動、体のサイズと形状、運動の形状、生存など、老化と健康に関連するさまざまな表現型を確認できます。

要約

線虫 Caenorhabditis elegansは 、そのシンプルで安価な培養技術、迅速な繁殖サイクル(~3日)、短い寿命(~3週間)、および遺伝子操作と分子分析のための多数の利用可能なツールにより、老化研究で使用される最も一般的なモデルシステムの1つです。生存分析を含む C.エレガンスの老化研究を実施するための最も一般的なアプローチは、ペトリプレートの固体線虫増殖培地(NGM)上で数十〜数百匹の動物の集団を一緒に培養することです。このアプローチは動物の集団に関するデータを収集しますが、ほとんどのプロトコルは個々の動物を経時的に追跡しません。ここでは、WorMotelsと呼ばれる微細加工ポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイスで個々の動物を長期間培養するための最適化されたプロトコルを紹介します。各装置では、NGMを含む小さなウェルで最大240匹の動物を培養でき、各ウェルは硫酸銅を含む堀で分離され、動物が逃げるのを防ぎます。このホワイト ペーパーでは、元の WorMotel の説明に基づいて、各デバイスの成形、準備、および装着に関する詳細なプロトコルを提供し、一般的な技術的問題の説明とトラブルシューティングのアドバイスを提供します。このプロトコルには、少量のNGMの一貫した負荷、NGMと細菌性食品の両方の一貫した乾燥、薬理学的介入を提供するためのオプション、PDMSデバイスの再利用に関する指示と実際的な制限、および低湿度環境でも乾燥を最小限に抑えるためのヒントがあります。この技術により、ペトリプレートの固体培地での集団培養の標準的な技術と同様の環境で、刺激された活動、刺激されていない活動、体のサイズ、運動形状、健康寿命、生存など、さまざまな生理学的パラメーターの縦断的モニタリングが可能になります。この方法は、自動顕微鏡および分析ソフトウェアと組み合わせて使用 すると、ハイスループットデータ収集と互換性があります。最後に、この技術の限界、およびマイクロトレイを使用して単離された線虫を固体培地上で培養する最近開発された方法とのこのアプローチの比較について説明します。

概要

Caenorhabditis elegans は、その短い世代時間(約3日)、短い寿命(約3週間)、実験室での培養の容易さ、哺乳類との分子プロセスと経路の高度な進化的保存、および遺伝子操作技術の幅広い利用可能性のために、老化研究で一般的に使用されます。老化研究の文脈では、 C.エレガンスは 、生きている動物の晩年の表現型の分析のために、長寿データと高齢者集団の迅速な生成を可能にします。ワーム老化研究を実施するための典型的なアプローチは、6cmペトリプレート内の固体寒天線虫増殖培地(NGM)上で20〜70匹の動物のグループで維持されているワームの集団の寿命を手動で測定することを含む¹。年齢同期集団を使用すると、集団全体の個々の動物の寿命または断面表現型を測定できますが、この方法では、個々の動物の特性を経時的に監視することはできません。このアプローチも労働集約的であるため、テストできる母集団のサイズが制限されます。

個々のC.エレガンスの寿命を通して縦断的にモニタリングできる培養方法は限られており、それぞれに異なる長所と短所があります。WormFarm²、NemaLife³、および「挙動」チップ⁴、^とり....

プロトコル

1.原液および培地の調製

注意: マルチウェルデバイスの準備を開始する前に、次のストック溶液と培地を準備してください。

1. 線虫増殖培地(NGM)および低メルトNGM(lmNGM)用のストックソリューション:
   1. 1 M K 2 HPO 4の準備:1 Lボトルに174.18 gのK₂HPO₄を加え、滅菌脱イオン水で1 Lまで満たします。オートクレーブ(121°C、15psig)で30分間、室温(RT)で保存した。
   2. 1 M KP_i、pH 6.0を準備します:1 Lボトルに136.09 gのKH₂HPO₄ を加え、滅菌脱イオン水で1 Lまで満たします。1 M K₂HPO₄ で滴定してpH 6.0にします。オートクレーブ(121°C、15psig)で30分間、RTで保存します。
   3. 1 M CaCl 2の調製:73.5 gのCaCl₂を500 mLボトルに加え、500 mLまで滅菌脱イオン水で満たします。オートクレーブ(121°C、15psig)で30分間、RTで保存します。
   4. 1 M MgSO 4の準備:123.25 gのMgSO₄

結果

WorMotel培養システムを使用して、寿命、健康寿命、活動など、さまざまなデータを収集できます。発表された研究では、寿命と健康寿命^13,14、静止と睡眠22,23,24、および行動²⁵を研究するためにマルチウェルデバイスを利用しています。寿命は、手動で、または?.......

ディスカッション

WorMotelシステムは、何百もの孤立した C.エレガンスの 個別化されたデータを経時的に収集するための強力なツールです。発生停止、運動行動、および老化のアプリケーションにマルチウェルデバイスを使用した以前の研究に続いて、この作業の目標は、活動、健康、および寿命をより高いスループットの方法で長期間監視するためのマルチウェルデバイスの準備を最適化することでし?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 lb weight	CAP Barbell	RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)	Falken Design	ACRYLIC-CL-3-8/1224	Large sheet cut to smaller sizes
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Autoclavable squeeze bottle	Nalgene	2405-0500
Bacto agar	BD Difco	214030
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
Basin, 25 mL	VWR	89094-664	Disposable pipette basin
Cabinet style vacuum desiccator	SP Bel-Art	F42400-4001	Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.
CaCl2	Acros Organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	GoldBio	C-103-25
Centrifuge	Beckman	360902
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Compressed oxygen tank	Airgas	UN1072
CuSO4	Fisher Chemical	C493-500
Dry bead bath incubator	Fisher Scientific	11-718-2
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Floxuridine	Research Products International	F10705-1.0
Hybridization oven	Techne	731-0177	Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators	Shel Lab	2020	20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
KH2PO4	Fisher Chemical	P286-1
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Low melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
Microwave	Sharp	R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3	Rainin	17013800	The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl	Fisher Bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray	Thermo Scientific	264728	Clear polystyrene trays
Parafilm M	Fisher Scientific	13-374-10	Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM	VWR	25384-342
Petri plate, 60 mM	Fisher Scientific	FB0875713A
Plasma cleaner	Plasma Etch, Inc.	PE-50
PLATINUM vacuum pump	JB Industries	DV-142N
PolyJet 3D printer	Stratasys	Objet500 Connex3	PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator	Lab-Line	3526CC
smartSpatula	LevGo, Inc.	17211	Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)	M2 Polymer Technologies	Type S	Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base	The Dow Chemical Company	2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent	The Dow Chemical Company	2085925
Syringe filter (0.22 µm)	Nest Scientific USA Inc.	380111
Syringe, 10 mL	Fisher Scientific	14955453
TWEEN 20	Thermo Scientific	J20605-AP	Detergent
Vacuum pump oil	VWR	54996-082
VeroBlackPlus	Stratasys	RGD875	Rigid 3D printing filament
Weigh boat	Thermo Scientific	WB30304	Large enough for PDMS mixture volume