Marsdenia tenacissimaと霊芝との共発酵と発酵産物の抗肺癌効果

要約

ここでは、 Marsdenia tenacissima (Roxb.) を使用して、辛味のあるサポニンが豊富な生体内変化製品を生成するための体系的かつ包括的な共発酵システムを確立するためのプロトコルについて説明します。ワイトらArn。(MT)霊 芝の発酵培地として。これは、他の民族的薬物の開発のための方法論的参照として役立つでしょう。

要約

Marsdenia tenacissima (Roxb.)ワイトらArn。(MT)は、伝統的な中国およびダイの漢方薬として、抗炎症作用、抗菌作用、抗腫瘍作用があります。しかし、その主な活性物質のほとんどは、テナシゲニンAやテナシゲニンBなどのアグリコネスです。MTのバイオアベイラビリティは低く、その薬用有効成分の合成が難しいため、主に生体内変化によって研究されています。本研究では、霊 芝 (G. lucidum)の発酵培地としてMTを用いることにより、刺激性サポニンを豊富に含む生体内変化産物を作製することを目指しています。

3つの薬用真菌の予備スクリーニングを通じて、 G.lucidum および Ophiocordyceps sinensis (O.sinensis)は、MT用の培地で一般的に増殖できることがわかりました。したがって、2種類の真菌の発酵の有効性は、肺癌のマウスモデルを使用してスクリーニングされました。最後に、 G. lucidum とMTの共発酵をさらなる研究のために選択しました。ノンターゲットメタボロミクス分析は 、G. lucidum 共発酵とMTの製品に対して実施されました。発酵産物からMTの12種類の特異的サポニンを同定し、 発酵産物から単量体化合物であるテナシゲニンAを得た。

テナシゲニンの大部分は、テナシゲニンAおよびテナシゲニンBレベルを通じて、有意な上昇傾向を示しました。その結果、 G. lucidumによる発酵後、MTの有効性が向上することが示されました。さらに、MT中のC₂₁ ステロイド配糖体の生体内変換は、この発酵プロセスの中心的な反応でした。要約すると、この研究は、MTの体系的かつ包括的な共発酵システムと薬力学的評価方法を確立し、MTの有効活性物質の完全な利用を強化するだけでなく、他の民族薬の開発のための方法論的参照も提供しました。

概要

肺がんは、伝統的な中国医学の「肺炭水化物」のカテゴリーに属します。肺癰の病因は、患者の健康な「気」の弱点、陰と陽の不均衡、毒素、肺の停滞であり、肺の機能障害、血液閉塞、肺の体液喪失につながります。したがって、肺内の長期のうっ血と痰毒素は肺塊^{を形成します1}。したがって、気を強化し、病原性因子を排除することが肺がんの治療の基本原則です。陰と陽のバランスをとるために陰に栄養を与え、熱を取り除き、停滞を解毒して分散させ、気を補って陰に栄養を与え、痰をきれいにする方法は、肺の炭水化物の形成を治療および予防するために使用されます²。

Marsdenia tenacissima (MT) は、Wuguteng としても知られる Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.) 科に属する薬用植物です。熱を逃がして解毒する効果があり、咳や喘息を和らげる効果があり、抗腫瘍作用^{があります3}。小愛平注射は、MTの単一のハーブから作られた製剤であり、診療所で広く使用されており、優れた治療用抗癌効果^{を示しています4}。しかし、人口増加に伴い、MTの需要は急激に増加しています。そのため、野生のMT資源の供給が不十分であり、栽培された薬用材料の品質にばらつきがあります。ハーブ素材の品質が悪い、成分の含有量が不安定な、バイオアベイラビリティが低いなどの問題があり、MTの発展を深刻に脅かしています。これらの生理活性化合物の中で、MT由来のサポニンは高度に研究されています。MTから100以上のサポニンが同定されています。それらは2つの主要なタイプに分けることができます:(1)テナシソシドA-P、マルスデノシドA-M、テナシゲノシドA-L、およびテナシゲニンA-Dを含むMTのC₂₁ ステロイド配糖体。(2)オレアノール酸やウルソール酸などの五環式トリテルペン。多くの研究により、石油エーテル抽出物の抗がん活性は、MT由来の高極性分子よりも高いことが示されています。したがって、MT由来のサポニンの主要多糖類を、より高いバイオアベイラビリティと生物活性を持つMTの別のマイナーアグリコンに変換することは有利です⁵。

生体内変化は、生体触媒とも呼ばれ、生体システムにおける関連酵素を用いて、外因性基質の形質転換または構造修飾の生理学的および生化学的反応を指す⁶。従来の化学合成よりも経済的で、安全で、地域選択的で、立体選択的であり、従来の合成化学では調製が困難な生理活性化合物を生成することができます^7,8。したがって、伝統的な漢方薬と天然薬の開発は、伝統的な漢方薬の近代化と国際化を促進するために不可欠です。

MTの共発酵システムは、生体内変化を利用して確立されました。元の薬用材料は、微生物の酵素システムによって形質転換されました。一方では、MTの抽出物は、このモードで真菌の発酵培養物を生成するための基質として使用されました。同時に、菌類発酵は細菌の繁殖サイクルを短縮し、生産コストを削減し、生産効率を向上させました⁹。一方、菌類発酵による有効成分の沈殿量の増加は有益であり、化学成分を生成し、有効性を向上させます¹⁰。液体二元発酵技術の使用は、薬用材料の有効成分を保護し、有効性を改善し、薬物源を節約するのに役立ち、ハーブ材料の有効成分の構造修飾技術を提供することにより、より良い効果を生み出す可能性があります。伝統的な中国医学の近代化レベルを向上させることは非常に重要です。

本研究では、文献レビュー後の初期段階において、発酵微生物として G. lucidum、 O. sinensis、 およびInonotus obliquus (I. obliquus)を選抜し、菌株を事前にスクリーニングしました。次に、腫瘍マウスモデルを通じてスクリーニングした菌株の有効性を調べることにより、最終発酵株を決定しました。最後に、発酵産物の一次代謝物と二次代謝物をLC-MSで系統的に分析・評価し、発酵産物から単量体化合物であるテナシゲニンAを得ました。

プロトコル

本研究は、民通大学実験動物センター(No.ECMUC2019008AA)。この議定書は、みんず大学の実験動物倫理委員会によって承認されました。MTは雲南省昆明市から収集されました。

1. 試験の準備

1. MTを熱水(100°C;MT /水= 1/10、w / v)を30分間観察し、MT抽出残留物を試験材料として収集します。
2. 10%ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でLLCマウス肺がん細胞株を、5% CO₂ 下 37 °C の加湿雰囲気で維持します。
3. 6〜8週齢、体重19±2 gのC57BL/6Jマウスは、12時間/12時間の明暗サイクルで、餌と水が無制限にアクセスできる環境制御された部屋に保管してください。定期的に消毒してください。

2. 菌株の予備審査

1. 3種類の菌株をジャガイモデキストロース寒天培地(PDA)固形培地に無菌技術で接種し、28°Cの暗所で培養します。 皿が菌類で完全に覆われた後、4°Cで保存します。
2. PDA固体培地に保存された菌株を第1段振とうフラスコのシード溶液に接種し、120rpmで4〜5日間振とうしながら28°Cで培養します。第1段階の真菌液を、二次真菌液を含む振とうフラスコに1:20の体積比で、恒温シェーカーで4〜5日間接種します。
3. MTを水で100 mg / L(MT /水)に希釈し、溶液を寒天に加えて固体培地を形成します。MTのみを含む固体培養物に、3菌株それぞれの二次真菌液1mLを接種し、 G. lucidum-MT、 I. obliquus-MT、 O. sinensis-MT培養系に分けます。これらの培養システムは、暗闇で振とうせずに28°Cに置きます。
4. しばらくしてから、上記の3つの培養システムで菌株の増殖を観察し、MTでのみ増殖できる菌株を選択してさらにスクリーニングします。

3. ひずみ選択再スクリーニング

注:予備スクリーニング後、 G. lucidum と O. sinensis のみがMTを含む固体培地で正常に増殖することができました。さらに抗腫瘍効果が良好な系を選択するために、移植腫瘍マウスモデルで抗腫瘍効果を試験した。

1. G. lucidum 共発酵 (MGF) と MT と O. sinensis 共発酵 (MOF) を併用した MT-MT のみを含む液体培地に G. lucidum と O. sinensis を接種し、180 rpm で振とうしながら 28 °C で 10 日間発酵します。
2. 発酵後、菌糸体をガーゼでろ過し、乾燥させます。80%エタノールで抽出物3 x 12時間。
3. LLC腫瘍細胞担持C57BL/6Jマウスの発酵MTと未発酵MTの抗腫瘍活性を確認します。
   1. LLC細胞(マウスあたり0.2mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1.0×10⁶ 細胞)を雄のC57BL / 6Jマウスの右側に皮下注射します(対照群を除く)。
   2. モデルが正常に確立されたことを確認するには、腫瘍結節に触れて、そのサイズが ~5 mm であることを確認します。担腫瘍マウス(グループあたりn = 10)をモデルグループ、MGFグループ、MOFグループ、MTグループ、およびシスプラチングループ(ポジティブコントロール)にランダムにグループ化します。対照群(腫瘍細胞なし)とモデル群に生理食塩水を投与します。治療の14日後にマウスを犠牲にし、腫瘍組織を採取します。

4. 発酵生成物の化学組成分析

注:発酵の有効性を確認した後、 この研究ではG.lucidum を発酵株として選択しました。液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)¹¹によりMGFのメタボロミクス解析を行った。

1. MT、 G. lucidum、および G. lucidum 共発酵(MGF)を含むMT 10 mgを抽出し、500 μLのメタノール:H₂O(7:3)とG. lucidum共発酵(MGF)で抽出し、4°Cで1分間振とうし、30分間超音波処理し、1,200 gで20分間遠心分離 ×。上清を回収し、0.22 μm のポリフッ化ビニリデンメンブレンでろ過し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析セットアップ(LC-MS/MS)に注入します。
   注:超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)で分離した代謝物と品質管理(QC)サンプルライブラリーは、高分解能質量分析法によって構築されました( 材料の表を参照)。
2. 次のUPLC条件を使用してください:C18カラム(100 mm x 2.1 mm、8 μm)、超純水中の移動相A-0.1%(v/v)ギ酸、移動相B-アセトニトリル。グラジエント溶出プロファイルを0分5%Bに設定します。2分5%B;14分 98% B;17分 98% B;17.1分 5% B;0.3 mL/minの流速で20分間5%。
3. 高分解能質量分析により代謝物を検出・同定します。カラム温度を40°C、自動インジェクター温度を4°C、注入量を2 μLに設定します。エレクトロスプレーイオン源の電圧:+5,500/-4,500 V;カーテンガス、イオン源1、およびイオン源2の圧力:それぞれ35、60、および60psi。イオン源の温度:600°C;解重合電位:±100V。
4. MT、GL、および MGF 抽出物を等量混合して品質管理サンプル(QC)を調製し、3 つの反復をそれぞれ QC 1-3 と命名します。品質管理と分析のサンプルを同じ手順で処理および検出します。3つのサンプルごとにQCサンプルを挿入して、検出と分析の再現性を調査します。

5.発酵産物の抽出と分離

1. 発酵ブロスから得られた発酵抽出物を蒸留水に溶かし、よく攪拌します。
   注:ここでは、2 Lの発酵ブロスから40 kgの発酵抽出物が得られました。
2. セクション4から、マクロ多孔質吸着樹脂カラムを使用して10%、30%、50%、70%、および95%のエタノール画分を溶出し、画分を回収します。
   注:ここでは、10.72gの95%エタノール画分、34.72gの70%エタノール画分、61.57gの50%エタノール画分、および79.7gの30%エタノール画分が得られた。
3. フラクションの極性に基づいて、酢酸エチルを含むシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して70%エタノール画分を溶出します:メタノール溶出し、フラクションを収集します。
   注:ここでは、神父1-神父7が集められました。
4. Sephadex LH-20カラムクロマトグラフィーを実施して、フラクション(ここではFr.3およびFr.4)をさらに精製し、精製後に各フラクション1.0 gを使用して半分取液相分離を行います。
   注:半分取液体クロマトグラフィーおよびシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、95%エタノール画分を単離し精製した。
5. 顕微分光法と核磁気共鳴分光法を実施し、化合物の構造を600Mおよび700Mのデータベースの構造と比較し、化合物の平面構造を決定します。
   注:ここでは、ハイブリッド質量分析計を使用して混合物の分子量を決定しました。我々は、1つの化合物の構造を同定した( 補足図S1を参照)。

6. 統計分析

1. すべての発酵実験を6回繰り返します。スチューデントのt検定を使用して統計的有意性を評価します。すべてのデータを平均SD±表し、すべての実験を3回繰り返し、統計的有意性(*0.01 ≤ p ≤ 0.05、**0.001 ≤ p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001)を0.05<設定します。
2. SCIEX OSソフトウェアを使用して、主に質量誤差、保持時間、同位体一致、MS/MSライブラリ純度スコア、および計算分子式に基づいて代謝物を同定します。ライブラリ設定パラメーターとして、 質量誤差 < 5 ppm、同位体比の差 < 20、 ライブラリ スコア 50 を使用します>。

結果

菌株の予備審査結果
MTと共発酵できる菌類を探索するために、G. lucidum、I. obliquus、O. sinensisの3つの菌類を選択しました。まず、菌株を活性化しました:図1A-Cに示すように、G.lucidum、I.obliquus、およびO.sinensisをPDA培地に接種しました。 図1D-F

ディスカッション

株スクリーニング実験の結果、すべての薬用菌類がハーブ材料で正常に生存できるわけではないことがわかりました。追加の培地がない場合、薬用真菌の生存は、必要な炭素源と窒素源を合成するために、独自の酵素を介して薬用材料中の成分が分解されることにかかっています。G. lucidumおよびO. sinensisは、MTと共発酵させることができるG. lucidum...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20200923
Agar	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., USA	NO.20080107
Autoclave	BinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, China	LS-50LD
constant shaking incubator	Zhicheng Inc. All rights reserved., Shanghai, China	ZWY-100D
Ganoderma lucidum	BeNa Culture Collection, Beijing, China	31732
Inonotus obliquus	BeNa Culture Collection, Beijing, China	117822
LLC Mouse lung cancer cell	National Infrastructure of Cell Line Resource, Beijing, China	PUMC000673
Male C57BL/6J mice	Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beiijng, China	No.110011210107024684
Methanol	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20210723
Ophiocordyceps sinensis	BeNa Culture Collection, Beijing, China	118371
Poly tetra fluoroethylene	Jinteng Experiment Equipment Co., Ltd., Tianjing,China	No.997
QTRAP 5500 LC/MS	AB Sciex Pte. Ltd., USA	CV20231711
Rotary Evaporator	BUCHI Co., Ltd., Shanghai, China	R-300
Syringe	Zhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Jinagsu, China	V500111
Ultra-clean bench	BOXUN Medica Bioological Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	SW-CJ-LFD