JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

このプロトコルは、損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略を提供します。このプロトコルは、漢方薬(TCM)の最適なアプリケーションモードを最適化するためのリファレンスを提供します。

要約

脳虚血の治療における伝統的な漢方薬(TCM)の組み合わせの利点を考慮して、損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略を探索するために、製剤の組み合わせと成分の組み合わせの有効性とメカニズムの違いを研究しました。グルコースフリー培地と組み合わせた塩化コバルト(CoCl2)は、PC12細胞の酸化的損傷を誘発するために使用されました。次に、 レン ゲ(Ast)注射と エリジェロンブレビスカプス (Eri)注射の最適な組み合わせを選択し、PC12細胞に対する安全で効果的な濃度をスクリーニングした後、統一された設計方法に従って組み合わせました。さらに、スクリーニングされた成分の組み合わせは、2つのハーブに10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸を含みます。次に、MTT、アネキシンV-FITC/PI、免疫蛍光、およびウェスタンブロット分析を使用して、損傷したPC12細胞に対する製剤の組み合わせと成分の組み合わせの有効性とメカニズムを評価しました。結果は、細胞生存促進のための最適な調製の組み合わせが、濃度6:1.8(μM)のAst注射とEriカプセルであることを示しました。成分の組み合わせ(10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸)は、製剤の組み合わせよりも効果的でした。どちらの組み合わせも、アポトーシス速度、カスパーゼ-3の蛍光強度、および細胞内活性酸素種(ROS)レベルを著しく低下させました。一方、彼らはp-Akt/Akt、Bcl-2/Bax、およびNrf2の発現レベルをアップレギュレートしました。これらの効果は、コンポーネントの組み合わせでより明白でした。結論として、両方の組み合わせは、PC12細胞上のグルコースフリー培地と組み合わせたCoCl2 によって誘発される傷害を阻害し、したがって細胞の生存を促進することができる。ただし、調製の組み合わせに対する成分の組み合わせの効率は、酸化ストレスとアポトーシスに関連するPI3K / Akt / Nrf2シグナル伝達経路のより強力な制御による可能性があります。

概要

脳低灌流による慢性脳虚血は、中高年に多い疾患です1。長期潜血性疾患として、進行性または持続性の神経機能障害を引き起こす可能性があります。主な病理学的メカニズムには、細胞のアポトーシスおよび酸化的損傷が含まれ、進行性または持続性の神経学的機能障害を引き起こす。これは、アルツハイマー病、血管性認知症、およびその他の疾患の病理学的基盤であり、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼします。しかし、現代医学では慢性脳虚血を治療するための理想的な薬がまだ不足しています2。同時に、 レン ゲ(Ast)と エリジェロンブレビスカプス (Eri)の組み合わせは、伝統的な漢方薬(TCM)の臨床診療で広く使用されています4。併用戦略は、脳虚血後の神経機能の回復を促進する上で著しく改善されており、これは単一の薬剤よりも優れています。しかしながら、2つの薬剤の組み合わせでは投与比に大きな違いがある4。有効な成分と作用機序は明確に定義されておらず、これが臨床応用を制限する重要な問題です。

以前の研究では、ラットの脳虚血の治療におけるAst注射とEri注射の製剤の組み合わせの相乗効果が実証されています。p-Aktタンパク質の発現をアップレギュレートし、Bリンパ芽腫2(Bcl-2)ファミリータンパク質の一つであり、アポトーシスを促進する効果を有するBcl-2関連死プロモーター(BAD)タンパク質5,6の発現をダウンレギュレートすることができる。しかし、その相乗効果の物質的根拠とメカニズムは明らかではありません。また、CoCl2複合グルコースフリー培地を用いてPC12細胞の傷害モデルを確立し、AstとEriにおける最適な成分の組み合わせをスクリーニングし、定義した7。

この研究では、AstとEriの有効用量を損傷したPC12細胞モデルを使用してスクリーニングします。2つの薬剤の最適な組み合わせは、均質設計法と組み合わせたこのモデルを使用してスクリーニングされます。細胞モデルは、損傷したPC12細胞における調製の組み合わせと成分の組み合わせの効果とメカニズムの違いをさらに評価するために使用されます。この戦略は、損傷したPC12細胞に対する2種類の組み合わせの保護効果と調節メカニズムをPI3K / Akt / Nrf2シグナル経路を介して調査し、最良の組み合わせモードを決定することを目的としています。この調査は、TCMの最適なアプリケーションモードを最適化するためのリファレンスを提供します。

プロトコル

1. 試薬の調製

  1. 125 mLの滅菌培養フラスコに90 mLのDMEM高糖培地、10 mLのウシ胎児血清(FBS)、および1 mLのペニシリン-ストレプトマイシン溶液を加えて、完全培地を調製します。完全培地を混合し、密閉条件下で4°Cで保存する。
  2. 10 mLのDMEM無糖培地(完全に溶解)に0.02 gのCoCl2粉末(正確に秤量)を加えてCoCl2溶液を調製し、8.4 mMストック溶液を得た。溶液を0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、密封して、光から4°C離して保存します。
    注:CoCl2 は不安定であり、光から保護された密閉容器に保管する必要があります。CoCl2 溶液の有効期間は7日間です。
  3. トリス塩酸緩衝塩溶液(TBST)を調製します。
    1. 8 gの塩化ナトリウム、0.2 gの塩化カリウム、および3 gのトリス塩基を正確に計量します。それらを1Lビーカーに加え、次に1,000mLのRO水を加えて混合物を溶解します。
    2. pHを7.4に調整し、1 mLのTween 20を加え、十分に混合してTBST溶液を得ます。
      注:Tween 20は、抗原に対する抗体の非特異的結合を低減する界面活性剤として機能し、0.1%濃度で最適に機能します。
  4. MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物塩)溶液を調製し、20 mLのPBS溶液に0.1 gのMTT粉末を量り、5 mg/mLのストック溶液を得ました。溶液を0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、密封し、光から4°C離して保管し、スタンバイ状態にします。
    注意: MTTパウダーは不安定で湿気を吸収しやすいため、光を避けて密閉乾燥した場所に保管する必要があります。MTT ソリューションは 7 日後に有効期限が切れます。MTTは発がん作用があるため、皮膚に直接触れないようにしてください。
  5. カプセルシェルを取り出し、DMEM無糖培地10mLに内容物0.18gを正確に秤量してエリカプセル液を調製し、100μMストック溶液(スクテラリン濃度基準)を調製した。溶液を0.2 μmのバクテリアフィルターでろ過し、密封して、4°Cの密閉容器に保管します。
    注:スクテラリンはエリゲロンブレビスカプスの主な有効成分です。カプセル中のスクテラリンの濃度は、HPLC-UVによって2.56 mg / g、すなわち5.54 μmol / g8と決定されています。製剤の濃度は、スクテラリン濃度に基づいて計算される。これは、製剤および成分の薬理学的活性を評価するのに便利である。
  6. 15 mLの滅菌遠心チューブに5 mLの注射剤と5 mLの無糖DMEM培地を加えてAst注射の溶液を調製し、60 μMのストック溶液を調製しました(アストラガロシドAの濃度に基づく)。溶液を0.2 μmのバクテリアフィルターでろ過し、4°Cの密閉容器に保管します。
    注:注射量はそれぞれ10 mLであり、注射中のアストラガロシドAの濃度はHPLC-ELSDによって0.094 mg / mL(すなわち、120 μM)9と決定されています。準備はバイオセーフティキャビネットで実行し、全体を通して遮光方法で操作する必要があります。注射液と無糖培地の量は正確に測定し、よく混合する必要があります。
  7. 7.85 mgのアストラガロシドA標準物質を正確に秤量し、2 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に完全に溶解して5,000 μMのストック溶液を調製することにより、アストラガロシドA溶液を調製します。0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、4°Cで気密に保管します。
    注:アストラガロシドA粉末は無糖培地に不溶です。溶液を調製する際は、適量のDMSOで溶解し、実験の最終濃度を0.1%未満に保ち、細胞毒性がないことを確認してください。
  8. スクテラリン標準物質11.56mgを秤量し、5mLの無糖DMEM培地で完全に溶解してスクテラリン溶液を調製し、5,000μMストック溶液を調製します。0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、4°Cで気密に保管します。
  9. クロロゲン酸標準物質8.86mgを秤量してクロロゲン酸溶液を調製し、5mLの無糖DMEM培地で完全に溶解し、5,000μMの原液を調製した。0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、4°Cで気密に保管します。
    注:クロロゲン酸粉末は不安定で、水を吸収しやすいです。密封し、光から4°C離して保管する必要があります。計量中の暴露時間は最小限に抑える必要があります。

2. 細胞生存率アッセイ

  1. PC12細胞を入手し、10%FBS、100 U/mLのペニシリン、および100 μg/mLのストレプトマイシンを添加したDMEMで培養します。
    注:この研究では、細胞は中国科学院から入手しています。PC12細胞は、神経内分泌細胞の一般的な特徴を持つ接着細胞であり、神経生理学および神経薬理学において広く使用されている。
  2. 5%CO2 を添加したインキュベーター内で37°Cで細胞を培養し、2〜3日ごとに継代培養する。すべての実験で4〜8番目の通路で細胞を使用します。
  3. 細胞培養
    1. 対数増殖期(70%〜80%の細胞コンフルエンシー)のPC12細胞を1 mLのトリプシン(0.25%)で処理し、顕微鏡下で細胞を観察します。細胞が丸くなったら、3 mLの完全培地を加えてトリプシン消化を停止します。
    2. 細胞を滅菌済みの15 mL遠沈管に移し、840 x g で5分間遠心分離します。上清を捨て、完全な培地で再懸濁し、細胞懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移します。次に、フローサイトメーターを使用して細胞数をカウントします。
      1. フローサイトメトリーソフトウェアを起動し、カウント設定で対応する細胞溶液の希釈倍数を選択し、1.5 mLマイクロ遠心チューブから細胞サンプルをロードした後、 密度チャート をクリックします。
      2. X軸とY軸から離れるセル集団を丸で囲み、図の下のデータテーブルを右クリックして、[ X]、[Y]、[カウント]、および [腹筋カウント]を選択します。データテーブルの Abs カウントの下のデータは、セルカウント結果を示します。
    3. 細胞濃度を1 x 10 5 cells/mLに調整し、96ウェルプレートに100 μL/ウェルを接種し、インキュベーター内で37°C、5 %CO2 で24時間培養します。
  4. 正常PC12細胞上の2種類の薬剤の安全な濃度のスクリーニング
    1. ステップ2.1〜2.2に記載されているように細胞を培養します。上清を廃棄し、最終濃度の異なるAst注射液(4、8、12、16、20、24μM)とエリカプセル(0.625、1.25、2.5、5、10、20μM)で正常細胞を処理します。各グループの6つの複製ウェルを24時間処理します。
      注:薬物の最終濃度を達成するために薬物を培地に添加し(ステップ2.4.1で言及)、次に等量の培地を各ウェルに加えます。上清を吸引するときは、ウェルの底にある細胞に接触しないように、ピペットチップをウェル壁にそっと当てる必要があります。異なる溶液を追加するときは、ウェルの端に沿って穏やかかつ迅速に追加し、実験結果に影響を与えないようにピペットガンヘッドを交換するときは注意してください。
    2. 上清を捨て、120 μLのMTT溶液(1 mg/mL)を各ウェルに加え、細胞を37°Cで4時間インキュベートします。
    3. インキュベーション後、上清を再度廃棄し、各ウェルに150 μLのDMSOを加えます。渦発振器を使用して、プレートを240回/分(毎分水平振動数)の速度で10分間振とうします。
    4. マイクロプレートリーダーを使用して、490 nmにおける各サンプルの吸光度を測定します。細胞生存率(%)を計算し、これは治療群の吸光度/正常群(対照)の吸光度x100です。
      注: MTT ソリューションが有効期間内であることを確認します。色が(濃い緑色に)変わった場合は使用できません。細胞の吸光度をテストするときは、ブランクウェル(培養培地とMTT、細胞や薬物を含まない)を設定して、他の試薬の干渉を排除する必要があります。150 μLの容量のDMSOを各ウェルに加え、10分間振とうして、青紫色の結晶をよりよく溶解させます。結果の正確性を確保するために、吸光度をできるだけ早く検出する必要があります。
  5. 損傷したPC12細胞に対する2剤有効濃度のスクリーニング
    1. ステップ2.1〜2.2で述べたように細胞を24時間培養し、上清を廃棄してから、無糖培地と組み合わせたCoCl2 (0.4 mM)の20 μL/ウェルで細胞を処理します。
    2. 細胞を100 μL/ウェルのAst注射(最終濃度は2、6、8、10、および12 μM)または100 μLのEriカプセル(最終濃度は1、2、3、4、および5 μM)で37°Cでさらに24時間処理します。120 μL/ウェルの完全培地を対照群に加えます。
      注:CoCl2 は細胞内に低酸素状態を誘導します。
    3. MTT法によって各サンプルの吸光度を測定し、ステップ2.4.2および2.4.3で前述したように細胞生存率を計算します。
  6. 均質設計法に基づく2剤の最適組み合わせのスクリーニング
    注:レンゲ注射とブレビスカプスカプセルの有効濃度範囲を取得した後、統一設計法U 7(7 4)表を使用して、2つの薬物の6つの異なる組み合わせを取得しました。Ast注射:エリカプセル:1)2:2.6μM、2)4:5μM、3)6:1.8μM、4)8:4.2μM、5)10:1μM、6)12:3.4μM。
    1. 上記のステップ2.3.1で細胞を培養し、負傷したPC12細胞を上記のようにAst注射:エリカプセルの6つの割合濃度で処理します。
    2. 細胞を24時間処理し、ステップ2.4.2および2.4.3で前述したように細胞生存率を計算します。
  7. 損傷したPC12細胞に対する2つの最適な組み合わせの保護効果の評価
    注:最適な製剤の組み合わせ(Ast注射:6:1.8 μMのエリカプセル)と最適な成分の組み合わせ7 (10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸)を取得した後、損傷したPC12細胞に対する保護効果を確認するためにさらに評価が行われます。
    1. ステップ2.3.1で上記のように細胞を培養し、損傷したPC12細胞を上記の注で説明した2種類の薬物の組み合わせで処理します。
    2. 細胞を24時間処理し、ステップ2.4.2および2.4.3で前述したように細胞生存率を計算します。

3. アポトーシス率に関するアネキシンV-FITC/PIアッセイ

  1. PC12細胞を12ウェルプレートに1.3 x 105 細胞/ウェルの濃度で播種し、37°Cで24時間培養します。
  2. 細胞をグループ化します:コントロールグループ、モデルグループ、および薬物の2つの組み合わせ。対照群に1.2 mL/ウェルの完全培地を追加し、0.4 mM CoCl 2を含む培地を1.2 mL/ウェルをモデル群に追加し、0.4 mM CoCl 2を含む2つの組み合わせのそれぞれ1.2 mL/ウェルを追加します。細胞を37°Cでさらに24時間インキュベートします。
  3. 薬物処理後、細胞を250 μL/ウェルのトリプシンで処理し、細胞を15 mL遠沈管に移し、室温(RT)で840 xg で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを500 μLの結合バッファーに再懸濁します。
    1. 細胞を暗所で5 μLのアネキシンV-FITCと10 μLのヨウ化プロピジウム(PI)でRTで15分間インキュベートし、フローサイトメトリーでアポトーシスを確認します。各グループに3つの複製ウェルを設定します。
      注:EDTAはアネキシンVと競合してカルシウムイオンに結合し、PIに対するアネキシンの親和性に影響を与える金属イオンキレート剤であるため、この試験で使用されるトリプシンにはEDTAを含めることはできません。アポトーシスが起こると、もともと細胞膜の内側にあったホスホセリンが細胞表面に外側に向きを変え、アネキシンV-FITCは膜外側のホスホセリンに選択的に結合して緑色の蛍光を示します。
    2. スタートメニューの「自動補正」をクリックし、「チャンネルの選択」で「FITC」、「PE」、「PERCP」、および「APC」を選択し、「補正場所:高さ」を選択します。統計項目の中央値でOKをクリックします。ステップ2.3.2で説明したのと同じ細胞カウント方法で、細胞サンプルを収集し、密度マップをクリックして、有効な細胞集団を丸で囲みます。
    3. FITC蛍光をX軸パラメータとして、その他の蛍光パラメータをY軸パラメータとして使用して、密度マップを作成します。[スタート]メニューの[補正マトリックス]をクリックし、オーバーフローマトリックスの[係数]をクリックします。 アポトーシス率の分析のために密度マップ情報が表示されます。

4. カスパーゼ-3世代の免疫蛍光検出

  1. PC12細胞を8 x 104 細胞/カバーガラスの密度でカバーガラスに播種し、37°Cで24時間24ウェルプレートに入れます。上記のステップ3.2で説明したようにセルをグループ化します。グループごとに 3 つの複製カバースリップを設定します。
  2. 薬物処理後、カバーガラスをPBS(37°C)でそれぞれ5分間2回すすぎ、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、0.5%Triton X-100でRTで20分間透過処理します。
  3. 細胞を再度すすぎ、RTで1時間10%ヤギ血清でブロックします。
  4. 各カバーガラスを、1x TBST中で1:250の濃度で希釈した一次抗体カスパーゼ-3(アポトーシスの重要な実行タンパク質)200 μLで、4°Cで一晩インキュベートします。 1x TBST(各3分間で3回)で洗浄し、200 μLの二次抗体(1x TBSTで1:300希釈)とともに、暗所のRTで1時間インキュベートします。
    注:蛍光は簡単に消光できます。したがって、二次抗体のインキュベーション後、スライドは光から遠ざける必要があります。一次抗体と二次抗体は、光から4°C離して保存する必要があります。
  5. 300 μLのDAPI(0.5 μg/mL)をカバーガラス(核を検出するため)に10分間加え、細胞を1x TBSTでそれぞれ5分間3回洗浄します。
  6. 蛍光顕微鏡でカバーガラスを観察し、画像をキャプチャします10.イメージングソフトウェアを使用して蛍光強度の統計解析を実行します。
    注意: 使用するスライドとカバーガラスは、清潔で無菌である必要があります。染色するときは、染色液のpH、濃度、温度に注意し、蛍光消光を避けてください。蛍光顕微鏡は、水銀灯を予熱するために少なくとも15分前にオンにし、30分間オフにしてから再度オンにする必要があります。画像を取得する場合、結果の精度を確保するために、同じバッチの実験における同じ色素の露光パラメータは一貫している必要があります。

5. ROSレベルの免疫蛍光アッセイ

  1. ステップ4.1で説明したように細胞を培養および処理します。
  2. 薬物処理後、各カバーガラスをPBSで3分間3回洗浄し、400 μLのDCFH-DA(10 μM)とともに37°Cで20分間インキュベートします。
    注:DCFH-DAは酸化ストレスの普遍的な指標です。細胞膜透過性があり、蛍光がありません。細胞に入ると、エステラーゼによって加水分解されて2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン(DCFH)が生成され、その後急速に酸化されて強力な蛍光生成物が生成されます。
  3. 無血清DMEMで細胞を再度洗浄し(各2回、3分間)、蛍光消光剤を添加した後、直ちにカバーガラスを蛍光顕微鏡で観察します。イメージングソフトウェアにより相対蛍光強度を算出する。
    注意: DCFH-DAプローブをロードした後、セルに入らない残留プローブを必ず清掃してください。

6. Nrf2、p-Akt、Akt、Bcl-2、およびBaxのタンパク質発現のウェスタンブロット検出11,12

  1. PC12細胞を1 x 10 6細胞/ウェルの濃度で6 ウェルプレートに接種し、37°Cで24時間培養します。ステップ4.1で前述したように細胞をグループ化して処理し、各グループに3つの複製ウェルを設定します。
  2. 24時間の薬物処理後、細胞をPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、調製した溶解バッファー中で氷上で30分間インキュベートします。溶解後、細胞を16,000 x g および4°Cで20分間遠心分離し、上清を回収します。
  3. タンパク質濃度を検出し、ブラッドフォードアッセイの指示に従って調整します。サンプルを希釈し、100°Cで10分間変性させます。
    注:溶解バッファーは、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、およびRIPAライセートで構成されており、容量比は1:1:50です。対照群では200 μL/ウェルの溶解バッファーが必要で、他の群では100 μL/ウェルの溶解バッファーが必要です。一般に、コントロール、モデル、および2種類の組み合わせグループのタンパク質濃度は、それぞれ0.45 mg / mL、0.25 mg / mL、および0.32〜0.39 mg / mLです。ローディングバッファーで希釈した後のタンパク質濃度は、それぞれ0.36、0.2、および0.256-0.312 mg / mLです。
  4. 分子量の異なるタンパク質を検出するには、各レーンに25 μgのタンパク質をロードし、12% SDS-PAGE電気泳動を実行し、ゲルをPVDFメンブレンに移します。
    注:SDSゲルの調製中は、気泡や不溶性粒子なしで完全に混合する必要があります。そうしないと、不均一なバンドや不規則なバンドが発生する可能性があります。メンブレンを移すときは、PVDFメンブレンとゲルの間に気泡がないことを確認してください。そうしないと、ストリップに白い斑点が表示されます。さらに、このステップは低温で実行する必要があり、アイスバッグは30分ごとに交換する必要があります。
  5. メンブレンを5%脱脂乳でRTで1.5時間ブロックし、対応する一次抗体5 mL(Nrf2 1:1,000、Akt 1:2,000、p-Akt 1:2,000、Bcl-2 1:5,000、Bax 1:1,000)とともに4°Cで24時間インキュベートします。 βアクチン(1:5,000)抗体を内部コントロールとして使用します。
  6. メンブレンをTBSTで洗浄し(各10分間で3回)、5 mLの二次HPR標識抗体(1:5,000)とともにRTで2時間インキュベートします。
    注:抗体の希釈比は任意に変更してはならず、バンドの背景色が黒すぎないように、要件に厳密に従って膜を十分にTBSTで洗浄する必要があります。
  7. 最後に、メンブレンを再度TBSTで洗浄し、タンパク質バンド検出のために化学発光HRP基質で処理します(製造元の指示に従って)。化学発光イメージングシステムを使用して画像をキャプチャし、イメージングソフトウェアを使用してタンパク質のグレー値を定量し、β-アクチンを比較内部コントロールとして使用します。

結果

Ast注射とEriカプセルの最適な組み合わせのスクリーニングを図1に示す。正常PC12細胞に対するAst注射およびエリカプセルの細胞生存率を図1Aに示す。細胞生存率は、12 μMを超える濃度のAst注射(図1A)および5 μMを超える濃度のEriカプセル(図1A)で95%未満であり、最大非毒性濃度がそれぞれ12 μMおよび5 μMであ...

ディスカッション

現代の臨床診療では、脳虚血の治療に理想的な薬がまだ不足しています2。気を補い、血液循環法を活性化するという指導の下で、Ast、Eri、およびその他の製剤は、TCMの臨床診療で組み合わせて使用 され、優れた包括的な利点を達成しています13,14,15。多くの研究により、Astは血液脳関門の透過性を改善?...

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、四川省科学技術局の主要な研究開発プロジェクト(2020YFS0325)によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1300 series class II biosafety cabinetThermo Fisher Scientific Instruments Company1374
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromideGuangzhou saiguo biotech Company1334GR001MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0ACEA Biosciences, Inc-
AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc10176-2-AP
Analytical flow cytometryThermo Fisher Scientific Instruments Company62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC apoptosis detection kitBeyotime Biotechnology CompanyC1062L
Astragalus injectionHeilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical CompanyA03190612144Ast injection
Astragaloside AChongqing Gao Ren Biotechnology Company84687-43-4
BaxWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc60267-1-Ig
BCA protein quantification kitBeyotime Biotechnology CompanyP0012
Bcl-2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc26593-1-AP
Carbon dioxide incubatorsThermo Fisher Scientific Instruments Company0816-2014
Caspase-3Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc19677-1-AP
Chlorogenic acidChongqing Gao Ren Biotechnology Company327-97-9
Cobalt chloride hexahydrateMerck Biotechnology, Inc.7791-13-1CoCl2
Dimethyl sulfoxideGuangzhou saiguo biotech Company2020112701DMSO
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrateChengdu Kolon Chemical Company2020090101
DMEM high sugar mediumThermo scientific Hyclone2110050
DMEM sugar free mediumBeijing Solarbio life sciences Company2029548
ECL luminous fluidLianshuo Biological CompanyWBKLS0500
Electronic balanceHaozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, ChinaFA1204
Electrophoresis instrumentBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1658026
Erigeron breviscapus capsuleYunnan Biogu Pharmaceutical CompanyZ53021671Eri capsule
Fetal bovine serumFour Seasons Institute of Biological Engineering20210402FBS
Fluorescent microscopeOlympms CorporationIX71-F32PH
Gel imagerBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1708265
Goat anti-mouse secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001-1
Goat anti-rabbit secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001- 2
IBM SPSS Statistics version 26.0International Business Machines Corporation, USA-
ImageJ 1.8.0National Institutes of Health, USA-imaging software
Immunol fluorescence staining kitBeyotime Biotechnology CompanyP0196
KClChengdu Kolon Chemical Company2021070901
MarkerThermo Fisher Scientific Instruments Company26616
Microplate readerPerkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.HH35L2018296
Motic Inverted microscopeNanda Scientific Instruments Co.AE2000LED
NaClChengdu Kolon Chemical Company2014081301
Nonfat milkBeyotime Biotechnology CompanyP0216
Nrf2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc16396-1-AP
P-AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66444-1-Ig
PC12 cellsChinese Academy of SciencesCBP60430
Penicillin-Streptomycin solutionThermo scientific HycloneSV30010
Phosphatase protease inhibitor mixtureBeyotime Biotechnology CompanyP1045
Potassium dihydrogen phosphateChengdu Kolon Chemical Company2015082901
Reactive oxygen species assay kitBeyotime Biotechnology CompanyS0033S
RI-PA lysis solutionBeyotime Biotechnology CompanyP0013B
ScutellarinChongqing Gao Ren Biotechnology Company27740-01-8
SDS-PAGE sample loading buffer, 5xBeyotime Biotechnology CompanyP0015L
Sterile filter tips (0.22 µm)Merck Biotechnology, Inc.SLGP033RB
Tris-baseGuangzhou saiguo biotech Company1115GR500 TBS
TrypsinThermo scientific HycloneJ190013
Tween-20Chengdu Kolon Chemical Company2021051301
Vortex oscillatorOHAUS International Co., Ltd., Shanghai, ChinaVXMNAL
β-actinWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66009-1-Ig

参考文献

  1. Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
  2. Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
  3. Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
  4. Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
  5. Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
  6. Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
  7. Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
  8. . Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 (2020)
  9. . Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 (2020)
  10. Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
  11. Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
  12. Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
  13. Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
  14. Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
  15. Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
  16. Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
  17. Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
  18. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
  19. Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
  20. Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
  21. El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
  22. Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
  23. Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
  24. Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
  25. Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
  26. Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
  27. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
  28. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
  29. Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

189 PC12 PI3K Akt Nrf2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved