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要約

我々は、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)細胞の細胞を単離するための簡単で効率的な方法を説明する。この手順により、遺伝子発現解析を含む、単離されたRPEに関するフォローアップ分子生物学的研究が可能になります。

要約

このプロトコルは、遺伝子発現分析を含む分子生物学研究への応用の可能性のために、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)の細胞を単離することについて説明しています。眼の成長調節と近視の文脈では、RPEは網膜と脈絡膜や強膜などの眼の2つの壁の間に位置するため、成長調節シグナルの細胞リレーとしての役割を果たす可能性があります。RPEを単離するためのプロトコルは、ヒナとマウスの両方について開発されていますが、これらのプロトコルは、重要で広く使用されている哺乳類近視モデルとなっているモルモットに直接翻訳できないことが証明されています。この研究では、分子生物学的ツールを使用して特定の遺伝子の発現を調べ、サンプルに隣接組織からの汚染がないことを確認しました。このプロトコルの価値は、近視誘発性の光学的焦点ぼけにさらされた若い色素性モルモットからのRPEのRNA-Seq研究ですでに実証されています。眼の成長調節以外にも、このプロトコルは、RPEが関与している近視の失明の主な原因の1つである近視性黄斑症を含む網膜疾患の研究に他の潜在的な用途があります。この技術の主な利点は、比較的単純であり、一度完成すると、RNA分析を含む分子生物学研究に適した高品質のRPEサンプルが得られることです。

概要

RPEは、神経網膜と血管脈絡膜の間に位置する色素細胞のユニークな単層で構成されており、光伝達を含む正常な網膜機能の発生と維持においてよく認識されている役割を持っています1,2。最近では、RPEは眼の成長調節3、したがって近視4の発症において追加の重要な役割を割り当てられています。この割り当ては、網膜と脈絡膜の間に介在するRPEの重要な位置と、眼の成長、したがって屈折異常が局所的に調節されていることが広く受け入れられていることに基づいています5。RPEは、増殖調節信号の想定源である網膜を、中継信号の2つの標的である脈絡膜および強膜に連結する信号中継として重要な役割を果たすと考えられている6,7,8。

ほとんどの近視を特徴付ける軸長の増加は良性とは見なされず、網膜、脈絡膜、および/または強膜を含む病態生理学的変化は、過度の眼の伸長の避けられない、そして今ではよく認識されている結果を表しています7,9。これに関連して、RPEは、非有糸分裂組織であるため、個々の細胞の伸張および菲薄化によってのみ拡大する硝子体腔を収容することができるので、おそらく最も脆弱である。近視性黄斑変性症などの近視関連の病状におけるその役割はまだ完全には理解されていませんが、RPEは、網膜、RPE、および脈絡膜の文書化された異常に関連する失明の主な原因の1つである地図状萎縮を含む、他の多くの網膜疾患の病因に関与しています10,11、12.

隣接する眼組織からの汚染のないRPE細胞の単離に成功することで、さまざまな眼/網膜疾患の根底にあるメカニズムに関する新しい洞察を得るための多くの研究機会が開かれる可能性があります。しかし、RPEの分離は困難であることが証明されており、多くの発表された研究では、この理由から網膜/RPEまたはRPE/脈絡膜の組み合わせサンプルを利用しています13,14,15。分子生物学的研究に適した品質のRPEの単離の成功を含む研究は、ニワトリおよびマウスの眼に限定されてきた16,17。例えば、RPE単離とRNA安定化の同時進行(SRIRS)法は、Wangら18によって記載される。マウスでRPE細胞を単離することは、モルモットの目ではうまく機能しないようです。ここで説明するプロトコルは、著者の1人(M.F.)によって最初に木のじゃじゃ馬の目でプロトタイプ化されたアプローチの改良を表しており、若い色素性モルモットの目からRNAやその他の分子生物学的分析に適した高品質のRPEサンプルが得られることが証明されています19。

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プロトコル

この研究で使用されたすべての動物の世話と治療は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠していました。実験プロトコルは、カリフォルニア大学バークレー校の動物管理および使用委員会によって承認されました。

1.モルモットの目の除核

  1. 麻酔下で送達されたペントバルビタールナトリウム(酸素中の5%イソフルラン)の心臓内注射でモルモットを安楽死させる。
  2. 鉗子とはさみを使って目を除核し、すぐに滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を入れた10cmのペトリ皿に移して洗浄します。新鮮なPBS溶液に目を移します。
    注:ウェルあたり4 mLの溶液を含む6ウェルプレートをお勧めします。

2.眼後眼カップとRPE/脈絡膜/強膜複合体の分離

  1. 解剖顕微鏡の助けを借りて、18 Gの針を使用して、辺縁部の境界の約1.0 mm後方(つまり、角膜と強膜の間)にある強膜を最初に小さな切開を行います(図1A)。次に、はさみを使用して、角膜、虹彩、毛様体、水晶体などの前部を取り除きます。
  2. 次に、残りの後眼セグメントアイカップを使用して、網膜をRPE /脈絡膜/強膜複合体から剥離します。鉗子を使用して、最初にジンの小帯をつかみ、次に穏やかに引っ張ってから、断片化せずに網膜を徐々に剥がします(図1B)。
    注:網膜の断片化や不完全な網膜組織の分離を避けるために、網膜を直接把握してはなりません。この解剖ステップには顕微鏡の使用が不可欠です。

3. 脈絡膜からのRPEの分離

  1. 網膜が完全に除去されたら、RPE、脈絡膜、強膜を含む残りの後眼カップを組織保存試薬に5分間浸します( 材料の表を参照)。
    注:識別されたウェルを備えた12ウェルプレートを使用し、それぞれに2mLの組織保存試薬を充填します。
  2. アイカップを4 mLのPBSで満たされた別のウェルに10秒間移してから、2 mLのPBSで満たされた3番目のウェルに移動します。
  3. 最後のRPE分離ステップのために、PBSで満たされた1 mLシリンジに30 Gの針を取り付けます。シリンジをそっと押して、PBSのジェットストリームを作成します。まず、このストリームをRPEに向け、小さな裂け目または穴を開けてから、PBSのストリームを作成した開口部に向け、RPEをシートとして脈絡膜から切り離します(図1C)。
    注:RPEをシートとして切り離すと、最大のRPEサンプルが得られます。繰り返しになりますが、このステップには顕微鏡の使用が不可欠です。
  4. RPEを脈絡膜から剥離した後(図1D)、RPE組織を針のない1 mLシリンジに採取し、採取したサンプルを1.5 mLチューブに移します。
  5. 回収したRPEを入れた1.5 mLチューブを8,000 × g で1分間遠心分離し、RPEペレットを得ました(図2A)。
  6. PBS溶液を廃棄し、RNA分離キットに含まれている350 mLの溶解バッファーと交換します( 材料の表を参照)。ピペット20倍で混合し、サンプルの品質を維持します。長期保存および保存のために、サンプルを−80°Cの冷凍庫に移します。
    注:溶解バッファーは、RNA単離およびRNA/DNA/タンパク質同時単離前の細胞および組織溶解用のRNA分離キットの独自のコンポーネントです。ライセート中のRNAsesを不活性化するには、必ずβ-メルカプトエタノールを溶解バッファーに添加してください(溶解バッファー1 mLあたり10 μLのβ-メルカプトエタノール)。

4. RPE-RNA抽出

  1. RNA分離キット( 材料表を参照)を使用して、提供されている製造元の指示に従ってRPEサンプルからRNAを分離および収集します。電気泳動 で サンプルの品質を評価します。
    注:記載されたプロトコルは、高品質の製品(すなわち、8.0を超えるRNA完全性番号[RIN])を生み出しました。

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結果

上記のプロトコルを使用して収集されたRPEサンプルの分析では、1眼あたり240.2 ng±35.1 ngのよく保存されたRNA(RIN >8.0、図2B)が示されました(n = 8、NanoDrop、図2B)。 単離されたRPEサンプルの品質、特に脈絡膜および強膜汚染物質の不在をさらに評価するために、RPEサンプル19における後者の組織のそれぞれについての代表遺伝子の発現?...

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ディスカッション

本稿では、若く色素性モルモットの目からRPE遺伝子発現解析に適したRPEを単離する方法について説明します。このプロトコルのメリットは、比較的汚染のない高品質のRPEサンプルが得られ、RNA特異的分析にRNAが適切に保存され、しかも比較的シンプルで効率的であることです。ここで提供される例では、RPEサンプルは若い(2週齢)モルモットの目から収集されましたが、このプロトコルは、年?...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

謝辞

本研究は、日本学術振興会海外特別研究員(S.G.)、ロリス&デイビッド・リッチ博士研究員(S.G.)、国立衛生研究所眼科研究所(R01EY012392;C.F.W.)。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Syringe with Slip TipBd Vacutainer Labware Medical22-253-260
2-MercaptoethanolInvitrogen21985-023
6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterilepectrum Chemical Mfg. Corp970-95008
12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, SterileThomas Scientific LLC1198D72
Agilent 2100 Bioanalyzerautomated electrophoresis to check RNA quality
Balanced Salt SolutionsGibco10010031
Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cmFine Science Tools, Inc.11083-07
Dumont forceps no. 5ROBOZRS-5045
Hypodermic disposable needlesExelint International, Co.26419
Hypodermic disposable needlesExelint International, Co.26437
MiniSpin MicrocentrifugesEppendorf540108Max. Speed: 8,000 g
RNAlater Stabilization SolutionInvitrogenAM7020tissue storage reagent
RNeasy Mini kitsQiagen74104RNA isolation kit
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools, Inc.91500-09

参考文献

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
  3. Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358(2018).
  4. Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
  5. Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
  6. Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
  7. Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
  8. Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118(2021).
  9. Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
  10. Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).
  11. McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982(2009).
  12. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  13. Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
  14. Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
  15. He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
  16. Nickla, D. L., Wallman, J. The multifunctional choroid. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).
  17. Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
  18. Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
  19. Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25(2022).
  20. De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
  21. Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
  22. Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
  23. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).

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