ナノ粒子によって誘発されるDNA損傷および修復ダイナミクスを調べるためのDNAファイバーアッセイのデモンストレーション

要約

この方法論は、ナノ粒子の存在下でのDNA複製ダイナミクスの変動の分析に役立ちます。目的の材料の細胞毒性レベルに基づいて、さまざまな方法論を採用できます。さらに、DNAファイバー解析に役立つように画像解析の説明が提供される。

要約

ナノ材料への曝露は、細胞内の複製ストレスとゲノム不安定性を引き起こす可能性があります。不安定性の程度は、ナノ材料の化学的性質、サイズ、濃度、曝露時間、および曝露された細胞の種類によって異なります。内因性/外因性のエージェントがグローバル複製にどのように影響するかを解明するために、いくつかの確立された方法が使用されてきました。ただし、DNAファイバーアッセイなどのレプリコンレベルのアッセイは、これらの薬剤が複製の開始、終了、および複製フォークの進行にどのように影響するかを理解するために不可欠です。これを知ることで、ナノ材料が突然変異の固定とゲノム不安定性の可能性をどのように高めるかをよりよく理解することができます。RAW 264.7マクロファージをモデル細胞として使用し、酸化グラフェンナノ粒子曝露下での複製ダイナミクスを研究しました。ここでは、ヌクレオチド類似体によるパルス標識、細胞溶解、パルス標識DNAファイバーのスライドへの拡散、DNAファイバー内のヌクレオチドアナログの蛍光免疫染色、共焦点顕微鏡を使用したDNAファイバー内の複製中間体のイメージング、およびコンピューター支援スコアリングおよび分析(CASA)ソフトウェアを使用した複製中間体分析を含む、DNAファイバーアッセイの基本プロトコルを示します。

概要

各細胞周期において、DNA複製により正確なゲノム複製が保証されます¹。真核生物の染色体複製は、基本的に、複数の複製起点の発火のタイミング、発火した起点から出てくるフォークの速度、および隣接する起点からの2つの複製分岐が²を満たしたときの複製プロセスの終了の3つの要因に依存します。娘細胞への遺伝情報の忠実度の高い伝達と遺伝的完全性の維持には、正確なDNA複製が不可欠です。定期的な代謝から発生する、または人工または天然の環境材料に起因する薬剤は、絶えずゲノムを攻撃しています。これらの内因性および外因性の薬剤は、これらの薬剤によって引き起こされるDNA損傷に遭遇するために複製フォークを減速または停止させ、これらの困難に応じてフォークが一時的に減速または停止することは複製ストレス^{と呼ばれます}3。複製ストレスに応答して、細胞は、乱された複製フォークの安定性を維持し、^{それらが再開する}ことを可能にするいくつかの分子経路を発達させた4。遺伝的安定性、細胞生存、およびヒト疾患の観点から、これらの複製ストレス応答メカニズムは、健康なゲノムを維持し、細胞の生存を確保し、疾患形成の可能性を減らすための重要な要因として浮上しています⁵。

複製ストレスを生じさせること....

プロトコル

1. 抗体とバッファーの調製

1. 一次抗体溶液、5%BSAで1:300希釈でマウス抗BrdU、および5%BSAで1:500希釈でラット抗BrdUを調製します。
2. 二次抗体溶液、アレキサフル594ウサギ抗マウスを5%BSAで1:300希釈で、アレキサフルオロ488ニワトリ抗ラットを5%BSAで1:500希釈で調製します。
3. 三次抗体溶液、アレキサフル594ヤギ抗ウサギを5%BSAで1:1,000希釈で、アレキサフルオロ488ヤギ抗ニワトリを5%BSAで1:1,000希釈で調製します。
4. 2 mLの1M Tris(pH 7.4)、1 mLの0.5 M EDTA、および0.5 mLの10% SDSを含むddH₂O中の10 mLの溶解バッファーを調製します。

2. ファイバーアッセイの準備

1. 1日目:ファイバーアッセイのための細胞培養とナノ材料処理
   1. RAW 264.5マクロファージ細胞または目的の細胞をプレートし、細胞が実験当日に増殖の対数期にあるようにします。RAW細胞の場合は、各条件について5 x 10⁴細胞/ウェルを24ウェルプレートに追加します。細胞を5%CO₂および98%湿度の37°Cインキュベーター内で維持します。

結果

十分な画像(条件ごとに20〜100枚の画像)を取得した後、複製中間体を識別、測定、およびカウントする必要があります。プログラム³⁸を介して繊維を手動または自動で分析するかどうかにかかわらず、繊維がカウントまたはスコアリングされる(またはカウントまたは測定されない)ために繊維が持つ必要がある特性を明確に定義する必要があります³⁹。.......

ディスカッション

ここでは、DNAファイバーアッセイを通じてナノ粒子の存在下でのDNA複製ダイナミクスの変動の分析を支援する方法について説明します。標準アッセイに関与する主要な重要なステップは、プロトコルに記載されています(ステップ2.2.2およびステップ3.1.3)。スライド内の光誘発DNA切断を防ぎ、再現性を高めるために、頭上の光への露出が制限され、一定の気流のある領域を使用することを常に?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416