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要約

このプロトコルは、生細胞におけるStub1を介したペキソファジーをトリガーおよびモニタリングするための指示を提供します。

要約

哺乳類細胞は、Stub1を介したペキソファジーを介してペルオキシソームをターンオーバーすることができます。この経路は、ペルオキシソームの量と質の細胞制御を可能にする可能性があります。このプロセスの間に、ヒートショックタンパク質70とユビキチンE3リガーゼStub1がペルオキシソーム上に移動し、ペキソファジーを開始するためにひっくり返されます。Stub1リガーゼ活性により、標的ペルオキシソーム上にユビキチンやその他のオートファジー関連モジュールを蓄積することができます。ペルオキシソーム内腔内の活性酸素種(ROS)レベルを上昇させると、Stub1を介したペキソファジーが活性化される可能性があります。したがって、色素支援ROS生成を使用して、この経路をトリガーおよび監視することができます。本稿では、蛍光タンパク質と合成蛍光色素の2つのクラスの色素を使用して、哺乳類細胞培養内でペキソファジーを開始する手順について概説します。これらの色素支援ROS生成ベースのプロトコルは、世界中の細胞集団内のすべてのペルオキシソームを標的とするために使用できるだけでなく、単一細胞内の個々のペルオキシソームの操作を可能にすることもできます。また、生細胞顕微鏡を使用してStub1を介したペキソファジーを追跡する方法についても説明します。

概要

ペルオキシソームは、ほとんどの真核細胞に存在する単膜結合オルガネラです。ペルオキシソームは、超長鎖脂肪酸のベータ酸化、プリン異化作用、およびエーテルリン脂質と胆汁酸の合成を行うために不可欠な代謝コンパートメントです1。ペルオキシソーム由来アセチルCoAは、代謝における中枢シグナル伝達を制御することにより、脂質恒常性を制御します2。したがって、ペルオキシソーム機能の低下が、神経変性疾患、老化、癌、肥満、および糖尿病を含む様々な疾患において暗示されることは驚くべきことではない3、4、5。ペルオキシソーム操作の維持に不可欠なプロセスはペキソファジーです。ペキソファジーは、オートファジーによるペルオキシソームの選択的代謝回転のための異化プロセスです。細胞はペキソファジーを使用してペルオキシソームの量と質を制御し、それによって適切なペルオキシソーム機能を確保します。最近の研究では、PEX1ペルオキシソーム生合成因子1および6の突然変異によって引き起こされるペルオキシソーム喪失は、制御されていないペキソファジー6に起因することが実証されました。特に、すべてのペルオキシソーム生合成障害(PBD)患者の65%は、哺乳類細胞のPEX1、PEX6、およびPEX26で構成されるペルオキシソームAAA ATPase複合体に欠損を抱いています7。

ペキソファジーを開始および研究するために、いくつかの方法を使用できます。酵母では、供給された栄養素がペルオキシソーム依存性炭素源からペルオキシソーム非依存炭素源(細胞ペルオキシソーム数の低下)に切り替えられたときにペキソファジーがトリガーされます8。例えば、メタノール培地からグルコース培地およびエタノール培地へのメタノール増殖ピキア牧草細胞の転写は、それぞれミクロペキソファジーおよびマクロペキソファジーを誘導する8、9、10。マイクロペキソファジー隔離剤は、液胞をリモデリングしてカップ状の液胞隔離膜と、マイクロペキソファジー特異的膜装置(MIPA)と呼ばれる蓋状の構造を形成することにより、ペルオキシソームをクラスター化して分解します。マクロペキソファジーでは、個々のペルオキシソームはペキソファゴソームとして知られる二重膜構造に飲み込まれ、続いて液胞と融合して分解されます8,9,10。サッカロミセス・セレビシエのAtg36pやピキア・パストリスのAtg30pなどのペキソファジー受容体のリン酸化は、受容体がコアオートファジー機構を動員し、オートファゴソームへのペルオキシソーム標的化を促進するために重要です8,11。

哺乳類細胞では、ユビキチン化によってペキソファジーを誘導することができます。ペルオキシソーム膜タンパク質PMP34またはPEX3を細胞質側にユビキチンでタグ付けすると、ペキソファジー12が誘導されます。PEX3の過剰発現は、ペルオキシソームユビキチン化およびリソソームによるペルオキシソーム排除を誘導する13。さらに、PEX5とC末端EGFPとの融合は、モノユビキチン化PEX5の輸出を損ない、ペキソファジーをもたらす14。一方、ペキソファジーはH2O2処理によっても引き起こされる可能性があります。ペルオキシソームは活性酸素種(ROS)を産生する。具体的には、超長鎖脂肪酸(炭素数22>)のベータ酸化の初期段階を触媒するペルオキシソーム酵素Acox1は、アセチルCoAだけでなくペルオキシソームROSも生成します。H2O2処理下で上昇したROSレベルに応答して、哺乳動物細胞はペキソファジーを活性化してROS産生を低下させ、ストレスを緩和する。H 2 O2治療は、ペルオキシソームへの毛細血管拡張運動失調(ATM)変異の動員を促進することが報告されています。次に、ATMはPEX5をリン酸化して、ペキソファジー15によるペルオキシソーム代謝回転を促進します。

ペルオキシソームはROS発生中心であるため、ROS損傷を受けやすい。ROS誘発性ペルオキシソーム損傷は、細胞にペキソファジーを活性化させ、ペルオキシソーム品質管理経路(オートファジーによる損傷したペルオキシソームの除去)を開始します。ここでは、ROS誘発性ペルオキシソーム損傷のオンデマンドトリガーへのアプローチを概説します。このプロトコルは、細胞小器官16、17、18、19、20内での光活性化ROS産生を利用します(図1)。色素標識されたペルオキシソームが照射され、ペルオキシソーム内腔内でROS産生が起こり、ペルオキシソーム損傷を特異的に引き起こします。このプロトコルを使用して、ROSストレスペルオキシソームがユビキチン依存性分解経路を介して除去されることが示されている。ROSストレスペルオキシソームは、ユビキチンE3リガーゼStub1をリクルートして、ペキソファジー16による個々の除去のためにオートファゴソームに飲み込むことを可能にします。このプロトコルを使用して、タイムラプス顕微鏡によって同じ細胞内の損傷したペルオキシソームと健康なペルオキシソームの運命を比較することができます。この方法は、培養皿上のすべてのペルオキシソーム(すべての細胞内)を全体的に損傷するためにも使用でき、ペキソファジー経路の生化学的分析を可能にします。

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プロトコル

1. ペルオキシソーム内腔にジキラーレッドまたは自己標識タンパク質(SLP)を発現する細胞の調製

  1. ガラス底の細胞培養皿に目的の細胞を播種します。ここでの実験では、840 μLの培養液(10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM/F-12)または840 μLの培養液(10%ウシ血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM)中の6 x 104マウスNIH3T3細胞を、直径20 mmのガラスマイクロウェルを備えた35 mmの培養皿に播種します。
    注:播種する細胞の数は、他の仕様のガラス底皿を使用する場合、ガラスマイクロウェルの面積に応じて比例して調整する必要があります。
  2. 細胞を5%CO2/37°C下で24時間増殖させる。
  3. トランスフェクション試薬を使用して、細胞に目的のプラスミドをトランスフェクトします。
    1. PMP34-TagBFPを使用して、生細胞中のペルオキシソームを標識します。ペルオキシソーム内腔でのROS生成(+色素標識SLPリガンド)には、ペルオキシソーム標的ジキラーレッド-VKSKLまたはSLP-VKSKL(+色素標識SLPリガンド)のいずれかを使用します(光活性化ROS産生による)。このプロトコルでは、自己標識タンパク質HaloTag-VKSKL21を使用します。Stub1/Hsp70の転座、ユビキチン化タンパク質の蓄積、およびROSストレスペルオキシソーム上のオートファゴソームの形成をモニタリングするために、それぞれEGFP-Stub1、EGFP-Hsp70、EGFP-Ub、またはEGFP-LC3Bをトランスフェクトします。ペルオキシソーム内腔におけるROS生成を確認するために、diKillerRed-VKSKLをペルオキシソーム局在蛍光酸化還元プローブroGFP2-VKSKL22と同時トランスフェクトします。
    2. SHSY5Y細胞トランスフェクションでは、プラスミドを55 μLの無血清DMEM/F-12で希釈し、1 μLのトランスフェクション試薬を55 μLの無血清DMEM/F12で希釈します。希釈したDNAを希釈試薬と組み合わせます。穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートします。
    3. 抗生物質を含まないSHSY5Y用の培養液100 μL(10%ウシ胎児血清を含むDMEM/F-12)を予め播種した20 mmマイクロウェルに複合体を追加します。皿を前後にそっと振る。
    4. NIH3T3細胞トランスフェクションでは、プラスミドおよびトランスフェクション試薬の希釈に、無血清DMEM/F-12の代わりに還元血清培地を使用してください。SHSY5Yのプレーティング培養液を、抗生物質を含まないNIH3T3細胞の培養液(10%ウシ血清を含むDMEM)と交換します。
  4. トランスフェクションの2時間後、トランスフェクション試薬含有培地を除去し、1 mLの新鮮な培養培地を加えます。NIH3T3またはSHSY5Y細胞を37°Cおよび5%CO2 で24時間インキュベートします。
    注:他の細胞株は、Stub1を介したペキソファジー(HeLa細胞など)の研究にも使用できます。

2. 色素標識SLPリガンドによるペルオキシソームの染色(光活性化ROS産生用)

  1. トランスフェクション後24時間で培地を除去し、100 μLの200 nM HaloTag TMRリガンドまたは200 nM Janelia Fluor 646 HaloTagリガンドを20 mmガラスマイクロウェルに加えます。
    注:色素標識SLPリガンドは、各細胞株のそれぞれの培地で希釈する必要があります。Janelia Fluor 646標識リガンドを選択すると、青、緑、赤のチャンネルが解放され、ダウンストリームの蛍光イメージングが可能になります。
  2. 皿を37°C、5%CO2 インキュベーターに移します。1時間染色します。1時間後、染色培地を完全に除去し、新鮮な培養培地1 mLを加えます。

3. レーザー走査型共焦点顕微鏡によるペルオキシソームのROSストレス

  1. 目的の細胞を含むガラス底の皿を、ステージトップインキュベーターを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡上に置きます。
  2. ツールウィンドウをクリックし、接眼レンズを選択し、DIAボタン(図2A)をクリックして透過光をオンにします。顕微鏡の接眼レンズを通して皿を見て、フォーカスノブを回して細胞に焦点を合わせます。
  3. LSMを選択し、色素と検出器の選択ボタンをクリックします(図2B)。ポップアップウィンドウで目的の色素をダブルクリックして、細胞をイメージングするための適切なレーザーとフィルターの設定を選択します(図2C)。ライブパネルのLivex4をクリックして高速レーザースキャンを開始し、細胞の蛍光シグナルのスクリーニングを開始します(図2D)。
  4. ジョイスティックコントローラーを使用してステージを移動し、培地のdiKillerRed-VKSKL-またはSLP-VKSKL発現細胞を見つけて、ROSストレス(ペルオキシソーム上)を適用します。目的のセルの画像を取得します。
  5. ツールウィンドウをクリックし、LSM刺激を選択します(図2E)。楕円ボタンをクリックし、ライブ画像ウィンドウでマウスを使用して、ROSストレスが適用されるステップ3.4で取得した目的のペルオキシソームを含む直径15 μmの円形ROI(図2F)を描画します(例については図3を参照)。
  6. ROSストレスを適用するには、diKillerRed-PTS1またはTMR標識SLPリガンドを有する細胞には561 nmを使用し、ジャネリア蛍光646標識SLPリガンドで染色された細胞には640 nmを使用します。
  7. ROSストレスを適用するレーザー波長を選択します。目的のレーザーのパーセンテージと持続時間を入力します(図2G)。
  8. [取得]をクリックし、[刺激]ボタン(図2H)をクリックして、ROIを通して561/640nmの光でそれぞれ30秒間スキャンを開始します。これは、ここで使用する共焦点顕微鏡の561nmと640nmの両方で~5%のレーザー出力設定に相当します。この操作は、ペルオキシソームにおけるROS産生をもたらすであろう。
    注:さまざまなサイズのROIを選択できます。面積に応じて、各ROIの照明時間を比例的に調整する必要があります。
  9. レーザー照射を30秒後、ROI内のペルオキシソームはジキラーレッド-PTS1/TMR/ジャネリアフルーア646シグナルを失います。このシグナル損失により、細胞内の照らされたペルオキシソームと照らされていないペルオキシソーム(損傷したペルオキシソームと健康なペルオキシソーム)を区別することができます。

4. タイムラプスイメージングによる生細胞中のペキソファジーのモニタリング

  1. EGFPタグ付きStub1、Hsp70、Ub、p62、またはLC3Bの照明/ROSストレスペルオキシソームへの転座を、フレーム間の10分間隔を使用したタイムラプスイメージングにより追跡します(例については、 図3〜7を参照)。
    注:EGFP-Stub1またはEGFP-Hsp70シグナルは、照明の10〜20分後に現れ始め、照明後~40分まで損傷したすべてのペルオキシソームに留まります。EGFP-Ubシグナルは照明後30分で現れ、2-3時間持続します。 EGFP-p62転座は照明後60分で現れ、EGFP-LC3Bシグナルは照明後~3時間で見えるようになります。
  2. ImageJを使用して、損傷したペルオキシソーム(Stub1、Ub、p62、またはLC3Bから)上のEGFPシグナルを定量します。ImageJ を使用して 3 チャンネル画像 (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL) を定量化するには、次の手順を実行します。
    1. 画像を開き、 楕円 選択または フリーハンド選択 を適用して、すべての照射ペルオキシソームを含む領域を囲みます(PMP34-TagBFPシグナル陽性およびHaloTagリガンドシグナル漂白; 図8A)。
    2. 複製をクリックして、PMP34-TagBFPチャネルを選択します(図8A)。ドロップダウンメニューの画像>>閾値を調整してペルオキシソームをマークして閾値を設定します(図8B)。
    3. [分析] > [粒子の分析] を選択して、照射されたペルオキシソームの正確な領域を決定します。ImageJは、これらの関心領域(ROI)をROIマネージャに記録します(図8C)。
    4. 複製をクリックして、EGFP結合Ub、p62、またはLC3Bからの蛍光シグナルを分析するためのEGFPチャンネルを選択します(図8D)。ROIマネージャですべてのROIを選択します(図8E)。
    5. ROIマネージャーで 測定 を適用して、ペルオキシソーム上のEGFPシグナルを測定します(図8E)。結果テーブルで、各ROIの面積と積分密度(すべてのピクセル強度の合計)の値を見つけます(図8E)。
    6. 照射後の異なる時点での平均EGFP蛍光強度を得るには、積分EGFP強度を照射されたペルオキシソームの総面積(PMP34-TagBFPシグナル陽性およびHaloTagリガンドシグナル陰性領域)で割ります。ペルオキシソーム上の蓄積シグナルを得るには、ある時点での平均強度を時間= 0で平均強度で減算し、次に時間= 0での平均強度で正規化します。

5.培養皿上のすべてのペルオキシソーム(すべての細胞内)を世界的に損傷する

  1. ステップ1(ペルオキシソームを標的としたジキラーレッド[diKillerRed-VKSKL]またはSLP [SLP-VKSKL]を発現する細胞の調製)およびステップ2(SLPリガンドによるペルオキシソームの染色[光活性化ROS産生用])を実行します。
  2. TMR標識リガンド染色の1時間後、染色培地を除去し、30 mM 3-AT(3-アミノ-1,2,4-トリアゾール;カタラーゼ阻害剤)を含む培養液1 mLを追加します。
    注:カタラーゼはペルオキシソーム内腔に発現するROSスカベンジャーであるため、3-AT処理はペルオキシソームの光誘発酸化損傷を増強するのに役立ちます。
  3. 培養皿をLED(555-570 nm)の上に置きます。インキュベーター内で9時間、1.8 W / cm2 の出力密度ですべてのセルを照らします。
    注:インキュベーターの外でこの手順を実行するには、培養皿を37°Cの加熱プレートに置きます。3-AT含有培地に20 mM HEPESを添加し、ガス交換を最小限に抑えるために培養皿を透明フィルムで覆います。HEPESは、LED照明中にCO2 インキュベーター外の細胞培養における生理学的pHを維持する緩衝剤です。
  4. ペルオキシソーム上のEGFP-Ub、EGFP-p62、またはEGFP-LC3Bシグナルをイメージングすることにより、LED誘発損傷の成功を検証します。上記で概説した照明条件を用いて、HaloTag-VKSKLを安定発現するSHSY5Y細胞の82%がStub1を介したペキソファジーを示した。
  5. 下流の生化学的分析のために細胞を回収します。

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結果

ここに示すStub1を介したペキソファジー誘導スキームは、ペルオキシソーム内腔内での色素支援ROS生成を利用します。この操作には、最小限の光強度が必要です。したがって、蛍光タンパク質または色素を含むペルオキシソームは、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して照明することができます。焦点照明は、蛍光レポーターroGFP2-VKSKLによって示されるように、個々のペルオキシ?...

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ディスカッション

このプロトコルは、光でペルオキシソームROSレベルを上昇させることにより、細胞培養内でStub1を介したペキソファジーをトリガーする方法を詳述しています。このプロトコルは色素支援ROS生成に依存しているため、目的の細胞内でdiKillerRed-VKSKLまたは色素標識SLPリガンド染色の十分な発現を確保する必要があります。異なる細胞型または異なる遺伝的背景の細胞がわずかに異なる特性を有す...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

謝辞

この作業は、台湾の国家科学技術評議会からのMOST 111-2311-B-001-019-MY3研究助成金によって部分的にサポートされました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell MatTekP35G-1.5-20-C20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)Sigma AldrichA8056
bovine serumThermoFisher Scientific16170060
Cell culture incubatorNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicamade by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia SinicaHsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicagenerated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicagenerated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
fetal bovine serumThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligand PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Inverted Confocal Microscope OlympusFV3000RS405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific11668transfection reagent
NIH3T3 cellATCCCRL-1658adherent
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850reduced serum media
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicagenerated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cellATCCCRL-2266adherent

参考文献

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