C57BL/6Jマウスにおける中枢性臍帯症候群モデルの確立

要約

マウスの中枢索症候群(CCS)をシミュレートする本プロトコルは、解剖学的構造を過度に破壊することを回避し、実験動物への再現性を向上させ、操作の損傷を最小限に抑えました。この研究の戦略は、一貫した結果を生み出すことで損傷メカニズムの研究を可能にするという点で有利です。

要約

中枢性臍帯症候群(CCS)の動物モデルは、前臨床研究に大きく役立つ可能性があります。識別可能な解剖学的経路は、低侵襲の曝露アプローチを提供し、操作中の実験動物への余分な傷害を減らすことができ、実験中に一貫した安定した解剖学的形態を維持して、個人間の行動的および組織学的違いを最小限に抑え、実験の再現性を向上させることができます。この研究では、脊髄損傷同軸プラットフォーム(SCICP)と低侵襲技術との組み合わせを使用して、C6レベルの脊髄を露出しました。脊椎安定剤の助けを借りて、C57BL/6Jマウスの椎骨を固定し、SCICPで5 g/mm² および10 g/mm² の重りで脊髄を圧迫し、さまざまな程度のC6脊髄損傷を誘発しました。このモデルでは、これまでのCCSの記述と同様に、このモデルの病変が中心索周辺の灰白質に集中していることが明らかになり、CCSのさらなる研究が可能になりました。最後に、組織学的結果は読者の参考として提供されます。

概要

近年、脊髄損傷(SCI)の発生率が絶えず上昇しており、暴力性の低いタウマ¹による高齢者の負傷が増えています。これらの損傷は、頸椎が関与することが多く、不完全な神経機能障害につながる^{ことがよくあります2。}

21世紀において、CCSは不完全なSCIの最も一般的なタイプであり、全SCIの半分以上を占めている。 従来の不完全なSCIと比較して、CCSは下肢よりも上肢の障害が不釣り合いに多いという特徴^{がある3。}それは主に上肢の脱力感を特徴とし、感覚機能障害と膀胱機能障害は有意ではありません。CCSは、外傷後中央部出血と浮腫によって引き起こされると考えられています または、最近提案されたように、脊柱管狭窄症における脊髄の圧迫によるウォーラー変性によって引き起こされます。CCSの管理には、指針となる高レベルのエビデンスが欠けており、その病態生理学を包括的に理解する必要がある⁴。しかし、CCSのモデルは報告されていない。適切な動物モデルは、病態生理学の理解に不可欠であり、臨床および前臨床試験の研究基盤を提供することができます5,6,7,8,9,10。

本研究では、脊髄損傷同軸プラットフォーム(SCICP)と低侵襲手術計画を用いてマウスのCCSモデルを確立し、CCSのさらなる研究と理解を可能にします。このモデルは、組織学的、磁気共鳴画像法(MRI)、および免疫蛍光分析によって、研究プロセスの過程で有効であることが証明されています。

プロトコル

実験は、山東大学チールー医科大学の実験動物倫理福祉委員会によって承認されました(承認番号:22021)。これらは、米国国立衛生研究所(NIH Publications No. 85-23、1996年改訂)が発行した実験動物のケアと使用に関するガイドに従って実施されました。この研究で使用したすべてのマウスは、Jinan Pengyue Experimental Animal Company(中国済南)から購入した9〜10週齢の雌のC57BL / 6Jマウスでした。この研究に参加した合計9匹のマウスは、対照群、軽度群、重度群に均等に無作為に割り付けられました。受傷後7日、28日、70日後に、各群から1匹のマウスを屠殺した。

1.C6椎弓切除術と脊髄曝露

注:露光は顕微鏡下で行われました。出血は、次の2つの側面に注意を払うことで回避できます:(i)すべての血管を避ける必要があります。(ii)筋肉は、筋肉の起点と終端点で分離する必要があります。

1. 手術器具とSCICPを準備します。
   注:SCICPの構造は、以前の研究¹¹で報告されています。以前の研究との違いは、現在のプロトコルが圧迫によって脊髄損傷を達成することです。このプラットホームの2つの異なる重量(10.4 gと20.8 g)は^、それぞれ5 g/mm²と10 g/mm²の圧縮を生成できます(図1)。脊髄の露出と圧迫のステップを図2に示します。
2. ノーズコーンを用いた吸入によりマウスにイソフルランを投与する(誘導:3%-5%、維持:1.5%-2%)。
3. 麻酔が効いたら、マウスの首の後ろの正中線にある小さな膨らみ、つまり第2胸椎(T2)の棘突起を調べます。
4. この膨らみの周りの髪を剃ります。ヨードフォア溶液を3回交互に塗布し、続いて皮膚消毒剤75%エタノールを消毒します。
5. マウスを操作台にうつ伏せにします。目を保護するために眼軟膏を塗ります。
6. 胸の下に厚さ3〜4mmのパッドを敷き、アーチ型の頸椎カーブを可能にし、手術中に層間スペースと遮るもののない気道の露出を容易にします。術前鎮痛剤としてブプレノルフィンを注射します(0.05-0.1 mg / kg、SQ)。
7. 第2胸椎の棘突起を中心とする滅菌メスで1〜1.5cmの縦方向切開を行い、筋膜層を露出させます(図2A)。
8. T2より上の脂肪組織の一部を滅菌マイクロハサミで除去し、T2棘突起を見つけます。
9. 両側の僧帽筋と菱形筋を正中線に沿ってC5-T2からマイクロハサミで分離します(図2B)。
10. マイクロハサミでC5-T2椎骨の椎弓の筋肉を分離し、滅菌マイクロリトラクターで筋肉層を横に引っ込めます(図2C)。
11. 椎骨の表面にある多裂筋と頸椎の筋肉を切断します。
12. 棘突起の最高点に応じてT2を見つけます。T2から吻側端に向かって棘突起を連続的にプローブし、C6を見つけます(図3)。
13. 鉗子でC6椎弓を持ち上げ、椎弓を切り取ると、脊髄が露出します(図2D)。

2.頸髄圧迫損傷

1. C6-7椎間関節を椎体スタビライザーで固定し、ロックします(図2E)。
2. 無菌ウェイトチップを露出した脊髄に向け、チップの平らな底が脊髄の背側表面と平行に配置されていることを確認します(図2F)。
3. 袖を調整して、重りが脊髄を圧迫するようにします。体重が脊髄との相対位置を一定に保ったら、調整を停止します(図2G)。
   注意: 体重が脊髄に挫傷力を及ぼす場合に備えて、このプロセスを激しくしたり、速くしたりしないでください。
4. 5分間の圧迫の後、重りと脊椎スタビライザーを取り外します。
5. 圧迫後の脊髄の色の変化を顕微鏡で観察します(図2H)。
6. 滅菌PBSですすぎ、吸引を使用して操作部位を洗浄します。
7. ポリプロピレン非吸収性縫合糸(サイズ:6-0)を使用して、筋肉と皮膚を層状に縫合します。
8. 手術部位を消毒し、マウスが完全な意識を取り戻すまでマウスを温かいパッドの上に置き、マウスをマウスケージに戻します。
9. 鎮痛のためにブプレノルフィン(0.05-0.1 mg / kg、SQ)を8〜12時間ごとに3日間注射します。.

3.組織学的分析

1. 受傷後7日目、28日目、または70日目に1.25%トリブロモエタノール(0.02 mL / g体重)の腹腔内注射によりマウスを麻酔します。マウスに60 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と20 mLの4%パラホルムアルデヒドを経心的に注入します¹¹。
2. 病変中心から0.5cmの脊髄をマイクロハサミで両側から切除し、長さ1cmの切片を温存する。
3. 保存した脊髄切片を30%ショ糖に4°Cで48時間浸漬します。
4. OCTで組織を包埋し、クライオトームで組織を厚さ6μmにスライスし、スライドガラス上に切片を採取します。
5. ヘマトキシリンおよびエオシン染色
   1. 6 μmの切片を1x PBSで5分間3回すすぎ、残留OCTを除去します。
   2. 切片をヘマトキシリンに90秒間浸します。切片を流水で3分間洗浄します。
   3. 切片をエオシンに4分間浸します。95%アルコールに30秒間浸して、余分なエオシンを取り除きます。
   4. 最後に、スライドをアルコール(アルコール度数95%とアルコール度数100%の2回連続)で30秒間脱水し、スライドをキシレン浴に入れて2分間清澄にします。次に、カバーガラスと樹脂ゲルで切片を密封します。
6. プルシアンブルーの染色
   1. フェロシアン化カリウム(10%)と塩酸(10%)の等量混合物にスライドを20分間浸します。
   2. 蒸留水で3回すすぎ、Nuclear Fast Redで5分間対比染色します。
   3. 蒸留水で3回すすぎ、続いて95%アルコールで1回、100%アルコールで2回5分間すすぎます。
   4. キシレンで切片を3分間ずつ2回透明にした後、樹脂ゲル¹²で密封します。
7. 免疫蛍光染色
   1. スライドを以下の一次抗体と37°Cで1時間インキュベートします:神経損傷後にミクログリアでアップレギュレーションされたウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba-1)(1:500)。中枢神経系のアストロサイトに発現するマウス抗グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)(1:300)。ウサギ抗ニューロフィラメント-200(NF-200)(1:2000)は、ニューロフィラメントで発現しています。
   2. 二次抗体と室温(RT)で1時間インキュベートします:Alexa Fluor488ヤギ抗マウスおよびAlexa Fluor594ヤギ抗ウサギ(1:1,000)。
   3. 写真を撮り、さらに蛍光顕微鏡¹³で分析する。

4. 磁気共鳴画像法

1. ミニマスクを通して投与されたイソフルラン麻酔(1%-2%イソフルラン、20%-30%O₂)で、損傷後7日目にマウスを麻酔します。
2. 頸椎脊髄を矢状方向にスキャンします。MRIイメージングには、TR/TE = 2500/12 ms、視野(FOV)= 12 x 8 mm²、スライスの厚さ = 1 mm、励起回数(NEX) = 2 のマルチスライスおよびインターリーブ方式のスピンエコー(SE)シーケンスを設定します。
   注意: スキャン中はマウスの呼吸数を10〜15 / minに保ち、呼吸関連の画像アーティファクトを排除します¹⁴。

結果

矢状HE切片は、灰白質の損傷領域が重症群で広かったにもかかわらず、白質上の連続性が存在したことを示唆しています。さらに、重度群と軽度群の損傷灰白質領域の差は、プロトコルのグループ設定の合理性を裏付けています(図4)。

冠状HE切片は、病変が主に両群の灰白質に存在することを示している。重症群では、灰白質を取り巻く白質の構造が影響を受けやすいが、白質の輪郭は維持された(図5)。NF-200免疫蛍光法は、灰白質を取り巻く白質が重症群で影響を受けたにもかかわらず、白質は依然として比較的無傷であったことを示唆しています。これらの結果は、以前の研究⁴ (図6)で説明したCCSの特性と一致しています。

軽度群または重度群のいずれにおいても、損傷後7日目の矢状HE切片に赤血球は認められなかった。プルシアンブルー染色では、軽度のグループではヘモジデローシスは見られませんでしたが、重度のグループではヘモジデローシスが明らかになりました。これらの結果は、出血の誘発には比較的重度の損傷が必要である可能性があることを示しています(図7)。

免疫蛍光法により、軽度および重度の傷害においてGFAPおよびIba-1発現が上昇した領域が明らかになり、炎症反応および病変におけるグリア瘢痕の形成が示唆された。また、重症群は軽症群よりも病変面積が大きかった(図8)。

MRIは、脊髄を観察するための比較的低侵襲な方法です。結果は、軽度群と重度群の両方で、病変に低信号信号変化があり、信号輪郭が高いことを示唆しています。重症群では、低信号信号領域が有意に拡大しました(図9)。低信号信号は、この領域の網状赤血球溶解物からの沈殿物を示唆し、周囲の高信号信号は炎症反応を示唆しています。以前の研究では、いくつかの行動テストを実施しました。例えば、前肢の握力テストでは、有意差が明らかになっています¹⁵。

図1:SCICPのスリーブとウェイト。 先端の表面積は、C6椎弓切除術後に測定された脊髄の露出面積に基づいて1.3mmx1.6mmになるように設計されました。おもりはPTFEでコーティングされており、スリーブの内壁とおもりの間の摩擦を効果的に低減します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:脊髄の露出と圧迫。 (A)皮膚の縦方向切開。(B)T2棘突起から吻側で筋肉を分離する。(C)椎弓の上の筋肉を分離します。(d)C6椎弓切除術;(e)椎体を固定することと、(f)圧縮の位置を決定すること、(g)脊髄の圧迫;(H)脊髄圧迫後の脊髄上の白質に著しい損傷がない。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:マウスの頸椎骨格の解剖学的構造。 矢印で示した部位はT2棘突起です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:矢状HE染色切片。 (A)頸髄矢状切片。(B、C)重度群は軽度群よりも重度の損傷を受けたが、どちらも中心索周辺の灰白質に着目していた。7、28、および70dpiの画像は、異なる期間における同じ損傷群の損傷の発現に有意差はなく、上脊髄と下脊髄の白質の連続性が維持されていることを示唆しています。スケールバー:1 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:頸髄損傷冠状HE染色切片。 (A-C)損傷は、パネルBとCに見られるように、主に中心索を取り巻く灰白質に影響を及ぼします。重傷群は軽傷群よりも広範囲の損傷を受けており、白質に影響を与える可能性が高くなります。スケールバー:400 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:損傷後のNF-200冠状免疫蛍光法。 NF-200の反応は、白質の輪郭に有意差はありませんでした。スケールバー:400 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図7:プルシアンブルー染色。 (A-C)ヘモジデローシスは重度群では観察されたが、軽度群では観察されなかった。スケールバー:400 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図8:損傷後の矢状性GFAPおよびIba-1免疫蛍光。 (A-C)損傷の程度が増加すると、GFAPおよびIba-1応答の領域が増加します。スケールバー:1 mm。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図9:頸髄損傷後の矢状MRI(T2強調画像)。 損傷領域は、軽度および重度の傷害群で低信号信号として観察され、重傷群では低信号の領域が有意に広かった。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

多くの種類の脊髄損傷の中で、CCSは最も治療可能なタイプの損傷の1つです^3,4。実験室での研究モデルがなかったため、1950年代からのCCSの研究は、臨床研究と死体解剖調査に焦点を当てていました^3,16,17。本研究は、マウスのCCSモデルを確立するために互換性のあるツールと低侵襲手順を使用することを示しています。技術的な面では、このプラットフォームは操作性が高く、再現性に優れています。実験結果が妥当性を実証していることを考えると、以前の研究がCCS⁴で定義した標準に最も近いモデルを確立するための私たちの手法。

圧迫損傷の以前の研究では、主に動脈瘤クリップ、バルーン、および校正された鉗子が使用されてきました^9,10,18。さらに、ほとんどの損傷は胸部脊髄¹⁸のレベルで発生しました。C6レベルの脊髄は、CCSの特徴を調査するために、この研究では損傷セグメントとして選択されました。CCSモデルの生存率も、実験の一貫性を確保する上で不可欠な要素であることは注目に値します。本研究は、マウス頸髄に両側圧迫損傷を引き起こすことを報告しているが、高レベルの脊髄外傷、特に両側損傷は、重篤すぎると実験動物にとって致命的となる可能性がある。El-Bohyによると、C4/5脊髄は下行性球脊髄路と呼吸関連の運動ニューロンに影響を与える可能性が高く、実験動物を呼吸抑制と死に至らしめる18,19,20,21,22,23.、この研究では、C6頸椎脊髄の圧迫の程度が異なるマウスは、有意に異なる損傷特性を持っています。組織学的検査。Forgioneによって報告されたマウス頸髄クランプモデルには有意な行動学的および組織学的違いがありましたが、修正されたクランプで脊髄をクランプするには、椎弓根、関節突起、椎弓、さらには神経根の破壊が必要であり、これは頸椎構造の安定性に大きな影響を与えました²⁴。頸部損傷に関する別の研究では、横突起を^固定部位として使用したことが報告されています5。関節突起が損傷を免れたとしても、筋肉組織の過剰な破壊も同様に脊髄の安定性に影響を与える可能性があります。本研究では、頸椎の安定性を維持するために6^番目の頸椎層のみを切除し、隣接する関節は保存し、過度の筋肉損傷を回避しました。同時に、脊髄の上からの圧迫は神経根の損傷を防ぎます。

HEの結果から、各群のマウスの頸髄の損傷領域は、CCSの特徴である中心脊髄付近の灰白質が中心であり、群間で損傷範囲に有意差があることが示唆された。特に、私たちが展示した病理学的切片は、検体が損傷後数日で収集されたため、損傷の症状を軽減した可能性があります。免疫蛍光法(NF-200)では、脊髄の白質領域の神経路への損傷が少なく、CCSの損傷は主に中心索周辺に集中していることが確認されました。免疫蛍光法の結果は、病理学の以前の組織学的結果によって複合されました。以前の研究では、CCSは中心索付近に浮腫を引き起こし、血腫を引き起こし、最終的には外側皮質脊髄路の内側部分の機能障害につながることが示され^{ています3。}出血はCCSの典型的な構成要素として報告されているが、その後の画像検査や剖検ではめったに見られない¹⁷。この研究では、受傷後7日目のHEの結果は、すべてのグループで組織浮腫の兆候を示唆しました。しかし、損傷部位に赤血球の残存は認められなかった。したがって、プルシアンブルーを使用して損傷部位の出血を調べたところ、結果は、損傷後7日目に重傷群の損傷部位にヘモジデローシスが観察されたのに対し、軽度群では一致しませんでした。 MRI T2画像は、軽度および重度の傷害の両方で、受傷後7日目の損傷部位に低信号領域があることを示しました。 ここでは網状赤血球溶解物の沈着を示す。これらの結果は、以前に報告された所見との不一致が、おそらくMRI検査が組織学的検査¹⁴よりも潜在的に感度が高いことによるものであり、傷害の重症度に加えて、傷害領域の出血量にも影響する可能性があるという状況証拠を提供する。GFAPは、損傷部位でも広範囲に発現していました。同時に、Iba-1の発現は無傷の領域にも見られ、炎症反応の持続を示唆しており、病変の低信号領域の周りの高信号信号のリングが炎症反応の存在を示唆するMRIの結果と一致しています。最終的に、本研究の結果に基づいて、モデルにおける損傷領域は中心索の周りの灰白質に焦点を合わせており、これは以前に報告された説明と概ね一致しています¹³。残念ながら、すべての実験動物でMRIを繰り返し実施して、損傷部位が時間とともに動的に変化する様子を示したわけではありません。将来の研究者は、CCSのより良い調査のために、これを研究に含めることができます。また、灰白質を定義するNeuNなどのニューロンマーカーによる免疫標識を研究に含めることができます。

結論として、病理学およびMRIスキャンに関する所見の特徴は、^{以前の研究で}CCSについて記述されたものと非常によく似ています4。CCSをモデル化する現在のプロトコルは、CCSのさらなる研究と理解を可能にします。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% fixative solution	Solarbio	P1110	4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody	Abcam	ab8135	Dilution ratio (1:2000)
Eosin Staining Solution (water soluble)	Biosharp	BL727B
Ethanol	Fuyu Reagent
Fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X800
Frozen Slicer	Leica
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY	#3670	Dilution ratio (1:600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Dilution ratio (1:1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Dilution ratio (1:1000)
Hematoxylin Staining Solution	Biosharp	BL702A
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Microsurgery apparatus	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	All the surgey instruments are custom-made	Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	working solution
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
Phosphate buffered solution (PBS)	Solarbio	P1020	pH 7.2–7.4
Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin)	Solarbio	G1424
RWD Laboratory inhalation anesthetic station	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made(Feng's standard)	https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1
Surgery microscope	Zumax Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
Tris Buffered Saline+Tween (TBST)	Solarbio	T1082	Dilution ratio (1:19)
Xylene	Fuyu Reagent