スプレイグドーリーラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離と同定

要約

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットから脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を単離および同定するための方法論について説明しています。

要約

成体間葉系細胞は、ここ数十年で分子生物学と細胞生物学に革命をもたらしました。それらは、自己複製、遊走、および増殖のための優れた能力に加えて、異なる特殊な細胞型に分化することができます。脂肪組織は、間葉系細胞の最も侵襲性が低く、最もアクセスしやすい供給源の1つです。また、他の供給源と比較して高い収率、および優れた免疫調節特性を有することが報告されている。最近、異なる組織源および動物種から成体間葉系細胞を得るための異なる手順が公開されている。一部の著者の基準を評価した後、さまざまな目的に適用でき、簡単に再現できる方法論を標準化しました。腎周囲脂肪組織および精巣上体脂肪組織からの間質血管画分(SVF)のプールにより、最適な形態と機能を備えた初代培養を開発することができました。細胞は24時間プラスチック表面に接着して観察され、線維芽細胞様の形態を示し、延長およびコロニーを形成する傾向を示した。フローサイトメトリー(FC)および免疫蛍光(IF)技術を用いて、膜マーカーCD105、CD9、CD63、CD31、およびCD34の発現を評価しました。脂肪由来幹細胞(ASC)が脂肪生成系統に分化する能力も、因子(4 μMインスリン、0.5 mM 3-メチル-イソ-ブチル-キサンチン、および1 μMデキサメタゾン)のカクテルを使用して評価されました。48時間後、線維芽細胞様形態の漸進的な消失が観察され、12日目にオイルレッド染色陽性の脂肪滴の存在が確認された。要約すると、再生医療への応用に最適で機能的なASC培養物を得るための手順が提案されています。

概要

間葉系幹細胞(MSC)は、自己複製、増殖、遊走、および異なる細胞系譜への分化能力が高いため、再生医療に大きな影響を与えています^1,2。現在、さまざまな病気の治療と診断の可能性に焦点を当てた多くの研究が行われています。

間葉系細胞には、骨髄、骨格筋、羊水、毛包、胎盤、脂肪組織など、さまざまな供給源があります。それらは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウマなどのさまざまな種から得られます³。骨髄由来MSC(BMSC)は、再生医療における幹細胞の主要な供給源として、また胚性幹細胞の使用に代わるものとして長年使用されてきました⁴。しかしながら、脂肪由来MSC、または脂肪由来幹細胞(ASC)は、それらの収集および単離の容易さ、ならびに脂肪組織のグラム当たりに得られる細胞の収量のために大きな利点を有する重要な代替物である^5,6。ASCの収穫率は一般的にBMSC^よりも高いことが報告されています7。当初、ASCの修復/再生能力は、他の細胞系譜に分化する能力によるものであると提案されました^....

プロトコル

すべての実験手順は、実験動物ケア国際評価認定協会(Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999、メキシコ)の勧告に基づいて、動物ケアに関するメキシコのガイドラインに従って実施されました。プロトコルは、メキシカーノデルセグロ社会研究所の健康研究のための倫理委員会によってレビュー、承認、および登録されました(R-2021-785-092)。

1. 外科的切除によるラットからの脂肪組織の除去

1. 20 mLの滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水-抗生物質抗真菌薬(PBS-AA)溶液(1x PBS、ゲンタマイシン[20 μg/mL]、およびアムホテリシン[0.5 μg/mL])を含む2本のコニカルチューブを準備し、氷上で維持します。
2. 健康状態の良い2匹の成体のオスのスプレイグドーリーラット (R. ラットが生後3〜4か月で、体重が350〜450gであることを確認してください。
3. 20 mg / kgの塩酸キシラジンで鎮静し、5分後、120 mg / kgの塩酸ケタミンの麻酔薬を腹腔内に投与します。.乾燥を防ぐために眼科用軟膏で両目を滑らかにします。次に、ペダル反射の欠如による麻酔の深さを確認します。
4. 腹部と鼠径部をヨウ素溶液で剃って消毒します。無菌性を維持するために外科用ドレープを適用します。次に、胸骨から精巣領域まで正中縦切開を行い....

ディスカッション

間葉系幹細胞の発見から過去40年間、いくつかの研究者グループが、さまざまな組織や種から間葉系幹細胞を取得するための手順を説明してきました。ラットを動物モデルとして使用する利点の1つは、その容易な維持および迅速な発生、ならびに脂肪組織からのMSCの入手の容易さである。ASCを得るために、内臓脂肪、腎周囲脂肪、精巣上体脂肪、および皮下脂肪などの異なる組織源が記載さ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025