2光子顕微鏡を用いたマウスの胸腺のその場イメージングで

要約

我々は、新生児キメラの世代だけでなく、2光子顕微鏡によるex vivoでのイメージングのための胸腺の解剖と準備のためのステップバイステップの手順を提示する。

要約

二光子顕微鏡（TPM）は、胸腺および文書胸腺細胞の開発にとって重要なイベントへの深い画像を可能にしています。胸腺細胞の群衆の中に個人の移行を追跡するには、我々は、胸腺細胞の1％未満が普遍的に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックであるドナーに由来している新生児キメラを生成する。これらの部分的な造血キメラを生成するには、新生児の受信者は、年齢の3-7日の間に骨髄を注入されています。 4-6週間後、マウスは屠殺され、胸腺は慎重に解剖され、イメージ化される組織のアーキテクチャを維持bissected。胸腺は、TPMによるex vivoでのイメージングの準備のためにカバースリップの上に接着される。撮像中に胸腺は95％酸素、5％の二酸化炭素で灌流して37に加温するフェノールレッド℃にすることなくDMEMで維持されますこのアプローチを使用して、我々は多様なT細胞のレパートリーの生成に必要なイベントを調べることができます。

プロトコル

養子免疫伝達

1:1の最終的なドナーとホスト間の比で、人生の最初の3-7日中にインスリン注射器の2-4倍を使用して骨髄の50 - 100ulで新生児を注入する。胸骨や胸郭の下注射部位のため、しかし、腸や胃上記の目的。十分ではない穿刺ダイアフラムに注意して腹膜を貫通する針を挿入します。それは、骨髄の一部が注入中に失われることは珍しくありません。もし皮膚が徐々に針を除去、その後、拡大してできるようにするように注入されているように子犬にあなたのグリップを緩めて、損失を減らすことができます。

胸腺の解剖

正中切開を行い、胸郭を明らかにするために、肌を切ったり、涙。胸骨にホールドし、腹膜と横隔膜カットスルー。胸腔を明らかにするために胸郭の側面をカット。胸腺は心臓の上部に位置しています。胸腺の構造を保つように、あなたが胸腺をばらばらにすると周囲の組織へのホールド。解剖時の乾燥からそれを維持するためにPBSで胸腺をすすいでください。ゆっくりと胸腺カプセルの表面に離れて余分な組織をいじめるし、2つの葉を二等分する。

イメージングのために組織を準備

正方形のカバースリップには接着剤胸腺に獣医組織接着剤を使用します。接着剤のマイクロリットルの割合を置くことpipettemanを使用してください。胸腺のおおよその長さと幅に接着剤を広げる。カバースリップに対する胸腺安定して所定の位置にドラッグします。

二光子イメージング

組織は、95％酸素、5％の二酸化炭素で灌流して37に加温するフェノールレッド℃にすることなくDMEMに浸漬され二光子励起は、スペクトラフィジックスマイタイレーザーは900nmのに合わせて調整し、CFP、GFP、YFPおよびテキサスレッド発光光はPMT検出器を使用して、515、495を使用して560ダイクロイックミラーを分離して収集された使用して達成された。

ディスカッション

胸腺における二光子イメージングには、リビング、無傷の器官の相互作用および胸腺内選択イベントの根底に移行で検討することを可能にしています。