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要約

脳のセクレトームは、中枢神経系の発達と正常な機能において極めて重要な役割を果たします。この記事では、 ex vivo 脳スライス培養物から脳セクレトームを単離するための詳細なプロトコルを提供します。

要約

脳のセクレトームは、神経系の細胞外マトリックスのタンパク質分解性切断によって細胞表面から活発に分泌されたタンパク質または細胞表面から放出されたタンパク質で構成されています。これらのタンパク質には、成長因子受容体や膜貫通タンパク質などが含まれ、中枢神経系の発達と正常な機能における幅広い役割をカバーしています。脳脊髄液からセクレトームを抽出する現在の手順は複雑で時間がかかり、実験動物の脳からこれらのタンパク質を分離することは困難です。この研究では、マウスの脳スライス培養物から脳のセクレトームを単離するための新しいプロトコルを提示します。まず、脳を分離し、スライスし、 生体外で培養しました。その後、培地をろ過し、濃縮して数日後に遠心分離によりタンパク質を単離しました。最後に、単離されたタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を使用して分離し、続いてウェスタンブロットによる純度特性評価のためにプローブしました。 ex vivo 脳スライス培養物からの脳セクレトームのこの単離手順は、自閉症スペクトラム障害などのさまざまな神経発達疾患に対するセクレトームの影響を調査するために使用できます。

概要

神経系の細胞外マトリックスは、「セクレトーム」と呼ばれる、活発に分泌されるか、細胞表面から放出されるタンパク質で構成されています。脳のセクレトームには、成長因子受容体や膜貫通タンパク質1などのタンパク質が含まれており、これらは中枢神経系の発生と正常な機能に幅広い役割を果たしています。グリア細胞から分泌される多数のタンパク質、特にミクログリアやアストロサイトは、中枢神経系の神経炎症など、さまざまなグリアの状態を反映しています2。タンパク質セクレトームは、神経保護作用と神経毒性作用の両方を持つことが実証されています。例えば、シナプス接合部3の構造と機能を調節するシナプス後に存在する膜貫通タンパク質であるニューロリギンをコードする遺伝子は、自閉症スペクトラム障害の危険因子であることがわかっています。ニューロリギンは、膜貫通タンパク質のエクトドメインがセクレトーム4,5の形で膜からの切断によって細胞表面から放出されるエクトドメインシェディングと呼ばれるプロセスを経ます。

脳内のセクレトームの多くのタンパク質は、脳脊髄液で検出できます。したがって、この流体のプロテオミクス分析は、神経疾患の新しい生理学的および病理学的メカニズムとバイオマーカーを特定するのに役立ちます6,7。脳のセクレトームタンパク質の生理学的機能の多くは未だ不明であり、さらなる調査が必要です。これらの研究には、脳のセクレトームを抽出するための効果的な手順の確立が重要です。しかし、脳脊髄液からセクレトームを抽出する現在の手順は複雑で時間がかかり、実験動物の脳からこれらのタンパク質を単離することは困難である8。この記事では、マウスの脳スライスからセクレトームを単離するための新しいプロトコルを紹介します。

in vitroで培養された脳切片は、脳組織と同じ細胞種と三次元の細胞構造を含んでおり、シナプス回路、受容体分布、伝達物質伝達などの生理機能が健常で無傷で保存されています。このモデルは、脳スライスを適切な培養培地に入れて持続的な細胞の成長と生存を確保したときのマウスの神経細胞の成長と機能を模倣しています。本研究では、マウスの脳切片は神経分泌タンパク質9を分泌し続け、単離された脳を解剖し、無菌条件下でフィルターインサート上に置いた。フィルターインサートを、培地を含む6ウェルプレートに入れました。ニューロンおよびグリア細胞によって分泌されるタンパク質はインサートの膜を貫通できるが、細胞には浸透できないことを考えると、脳のセクレトームは条件付き培養培地から収集することができる。

この記事では、(i)脳スライスの単離、(ii)脳スライスの収集、(iii)条件付き培地からの脳スライス培養の収集、(iv)ウェスタンブロット分析、および(v)プロテオミクス分析(図1)の基本的な手順について説明します。

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プロトコル

このプロトコルは承認され、サザン科学技術大学動物管理および使用委員会(SUSTech-JY202112006)によって設定された動物管理ガイドラインに準拠しています。この研究では、成体の雄と雌のC57BL/6Jマウス(6-8週齢、22-30g)を使用しました。マウスを22〜25°Cで、12時間の光と12時間の暗闇の概日サイクルで飼育し、餌と水に 自由 にアクセスしました。プロトコルの手順は次のとおりです。

1.脳スライスの分離

  1. 手術器具を準備します:眼科用曲げピンセット、ビーカー(250mL、500mL)、濾紙、はさみ、カミソリ刃、片刃、ブラシペン。これらのツールを砕いた氷で満たされたフォームボックスに入れて冷まします。
  2. 95%O2 と5%CO2を含む混合ガスのバルブを開きます。ガス管のヘッドを超純水のビーカーに入れて清掃します。
  3. 225 mMスクロース、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、26 mM NaHCO3、11 mM D-グルコース、5 mM L-アスコルビン酸、3 mMピルビン酸ナトリウム、7 mM MgSO4、および0.5 mM CaCl2の成分を使用して氷冷解剖緩衝液を調製します。pHを7.3〜7.4に調整します。
  4. 122 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、26 mM NaHCO3、11 mM D-グルコース、7 mM MgSO4、および0.5 mM CaCl2の成分で培養溶液を調製します。pHを7.3〜7.4に調整し、10%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(P / S)をろ過して培養液に加えます。
  5. マウスを犠牲にする前に、培養液と解剖液を30分間酸素化します。かみそりの刃を壊してスライスの半分を取り、スライサーに取り付けます。スライサーのベースとツールホルダーを取り付けます。
  6. 子宮頸部脱臼によって、または麻酔薬に2%-3%イソフルオランを使用してマウスを犠牲にします。
    1. ハサミを使って首の頭蓋骨を切り落とします。頭蓋骨の中央の皮膚を切って、頭蓋骨全体を露出させます。
    2. 眼科用ハサミを使用して正中線に沿って頭蓋骨を切断し、湾曲した眼鉗子を使用して頭蓋骨を切断します。
    3. 最後に、湾曲した鉗子を使用して頭蓋骨の基部に到達し、基部神経を切断します。これで脳全体を取り外すことができます。
  7. 脳を氷冷解剖バッファーに迅速に入れます。鋭利で滅菌された片面刃を使用して、底部を含む脳の余分な部分を切り取ります。
  8. 適切な接着剤を使用して脳組織をタンクに貼り付けます。スライス溶液をタンクに注ぎ、脳組織が覆われていることを確認し、酸素化を続けます。
  9. ビブラトームのパラメータを調整して、組織を厚さ300μmの切片にスライスします。この研究で使用したスライサーの速度と周波数は、それぞれ0.3 mm/sと70 Hzでした。
  10. ブラシを使用して脳のスライスを選び、培養液と一緒に皿に入れます。次に、1.5 mLの培養溶液を含む6ウェルプレートの30 mm、0.4 μmの細孔径組織培養インサートに、スライスが互いに成長しない距離で、2〜4枚のスライスを各30 mm、0.4 μmの組織培養インサートに移します。
  11. 組織を37°C、5%CO2、湿度95%で14時間インキュベートします。

2.脳スライスコレクション

  1. カバーガラスから培地を吸引し、ブラシで脳スライスを1.5mLチューブに静かに移します。
  2. 1 mmol/Lのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含むハンクス平衡塩溶液(HBSS)を200〜400 μLチューブに加えます。激しく振動させ、混合してティッシュグラインダーを使用して均質な溶液を形成します。この研究で使用された周波数と時間は、それぞれ800Hzと60秒でした。
  3. 懸濁液を700 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 次に、上清を新しい1.5 mL遠心チューブに集めます。
  4. 上清に20-40 μLの20% Triton X-100を加え、ロッキングシェーカーで4°Cでサンプルを1時間回転させます。
  5. 懸濁液を13,000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、上清を回収します。ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキットを使用して、すべての脳スライスサンプルを2 μg/μLのタンパク質濃度に標準化します。
  6. 上清を5倍ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ローディングバッファー(10% SDS、10 mM ジチオスレイトール[DTT]、250 mM Tris-HCl [pH 6.8]、30% [v/v]グリセロール、0.05% [w/v]ブロモフェノールブルー色素)に混合し、サンプルを95°Cで5分間煮沸します。
  7. 調製したサンプルを-20°Cで凍結します。 その後、電気泳動法とウェスタンブロッティング法による検出が行われます。

3. 脳切片培養馴化培地(CM)の収集

  1. 14時間後に培地を吸引し、0.22μmフィルターを使用してCMをろ過します。
  2. 10 kDa限外ろ過遠心チューブを使用して、9,000 x g 、4°Cで50分間、調整培地を100 μLまで濃縮します。 BCAタンパク質アッセイキットを使用して、すべての培地サンプルをタンパク質濃度0.8 μg/μLに標準化します。
  3. コンディショニング培地を5x SDSローディングバッファーで溶出し、95°Cで5分間煮沸します。
  4. 調製したサンプルを-20°Cで凍結します。 その後、電気泳動法とウェスタンブロッティング法による検出が行われます。

4. ウェスタンブロット解析

  1. ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルを調製し、前述の10.ブレインスライスと培地サンプルをプレキャストSDS-PAGEゲルにロードします。最初に80 Vの定電圧で30分間サンプルを分離し、次に120 Vの定電圧で70分間サンプルを分離します。
  2. タンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに移し、トリス緩衝生理食塩水Tween 20(TBST;150 mM NaCl、20 mM Tris、0.1%Tween-20、pH 7.4)中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)で1時間ブロックします。
  3. TBSTに一次抗体を添加し、マウス抗sAPP-α(抗体希釈比1:5,000)、ウサギ抗クラスターリン(抗体希釈比1:5,000)、マウス抗MAP2(抗体希釈比1:5,000)、マウス抗GAPDH抗体(抗体希釈比1:5,000)、マウス抗アクチン(抗体希釈比1:5,000)を添加し、ロッカーで4°Cで一晩インキュベートします。
  4. メンブレンをTBSTで3回、それぞれ15分間洗浄します。
  5. TBSTバッファーに適切な二次抗体を添加します:m-IgGκ BP-HRP(1:5,000希釈)、マウス抗ウサギIgG-HRP(二次抗体希釈比1:5,000)。1〜2時間インキュベートします。
  6. TBSTを使用してメンブレンを3回、各15分間洗浄します。
  7. 適切なイメージングシステムを使用してメンブレンをスキャンし、イメージングします。

5. プロテオミクス解析

  1. この研究では、ステップ 3.1 に従って培地 (CM) を回収し、続いて 9,000 x g の 3 kDa 濃縮チューブを使用して、4 °C で 40 分間、最終容量の 80 μL まで濃縮します。 CMサンプルを氷上に保存し、質量分析を待ちます。
  2. サンプルのプロテオミクス検出および分析法は、以前の論文11、12、13で説明したプロトコルに従って実施します。

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結果

脳スライス中の細胞外タンパク質の分泌を定量化するために、BCAアッセイ実験を通じて、脳スライスサンプルとコンディショニング培地サンプルのタンパク質濃度を調べました。脳スライスサンプルとコンディショニング培地サンプルはすべて高タンパク質濃度でした(表 1 および図 2)。その結果、培地中には細胞外タ?...

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ディスカッション

脳のセクレトームとは、ニューロンまたはグリア細胞によって細胞外環境に放出される、神経分泌物または神経ペプチド産物として知られるシグナル伝達分子の集まりを指します。脳のセクレトームは、神経系の多くの生物学的および生理学的プロセスにおいて重要な機能を保持しています17,18。脳のセクレトームとその?...

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開示事項

著者は、利益相反はないと述べています。

謝辞

この研究は、深セン精神障害臨床研究センター(20210617155253001)、広東省高レベル臨床重点専門のための深セン基金(SZGSPO13)、深セン科学技術革新委員会(JCYJ20200109150700942)、広東省の主要地域研究開発プログラム(2019B030335001)、および深セン主要医療規律建設基金(SZXK042)の支援を受けました。高度な生体材料。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm Non-Sterile Millex Syringe Filters with PES MembraneMilliporeSLGPR33RB
1,4-Dithio-DL-threitol (DTT)Merck (Sigma Aldrich)DTT-RO
6-well platesCORNING3516
Actin antibodyCell Signaling Technology #3700
APP AntibodyCell Signaling Technology2452
BioRad Mini-Protean TGX precast gelsBioRad#1610185
Bovine serum albumin (BSA)Merck (Sigma Aldrich)10735094001
Bromophenol BlueMerck (Sigma Aldrich)B0126
Brush penDeli1.00008E+11
CaCl2Merck (Sigma Aldrich)C1016
CF3COOHMerck (Sigma Aldrich)302031
CH3CNMerck (Sigma Aldrich)34851
Clusterin antibodyCell Signaling Technology#42143
D-GlucoseMerck (Sigma Aldrich)G8270
Easy-nLC1200Thermo Fisher ScientificEasy-nLC1200
Filter paperROHUROHU-DLLZ00105
GAPDH antibodyCell Signaling Technology# 5174S
GlycerolMerck (Sigma Aldrich)G5516-100ML
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen (Gibco)14175095
Human/Rat NLGN2 AntibodyR&D SystemsAF5645
ICH2CONH2Merck (Sigma Aldrich)I6125
Immun-Blot PVDF membranesBIO-RAD#1620177
KClMerck (Sigma Aldrich)P3911
L-Ascorbic AcidMerck (Sigma Aldrich)A92902
Map2 antibodyCell Signaling Technology# 4542S
MgSO4Merck (Sigma Aldrich)M7506
m-IgGκ BP-HRPSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-516102
Millicell-CM 0.4 μmMilliporePIHP03050
Millipore AmiconUltra-0.5MLMilliporeUFC5010
mouse anti-rabbit IgG-HRPSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-2357
NaH2PO4Merck (Sigma Aldrich)S0751
NaHCO3Merck (Sigma Aldrich)S5761
NH4HCO3Merck (Sigma Aldrich)A6141
ParenzymeThermo Fisher ScientificR001100
Penicillin-Streptomycin Solution(P/S)Invitrogen (Gibco)15070063
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
QEactiveThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Rabbit Anti-Goat IgG (H&L)-HRP ConjugatedEasybioBE0103-100
Razor bladeBFYING EAGLEHX-L146-1H
Sodium chloride NaClMerck (Sigma Aldrich)S6150
Sodium dodecylsulfate (SDS)Merck (Sigma Aldrich)V900859
Sodium PyruvateMerck (Sigma Aldrich)P2256
SpeedVac SRF110 Refrigerated Vacuum Concentrator (German)Thermo Fisher ScientificSRF110P2-115
SucroseMerck (Sigma Aldrich)G8270
Tissue grinderSCIENTZSCIENTZ-48
Tris (Hydroxymethyl)Merck (Sigma Aldrich)TRIS-RO
TritonX-100Merck (Sigma Aldrich)T8787
Tween-20Merck (Sigma Aldrich)P1379
Vibratory slicerLeicaLeica VT 1000S

参考文献

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