エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

要約

このプロトコルは生体 外で 組み立てられ、electroporationによって渡されるCas9-sgRNAのribonucleoproteinの複合体を使用してマウス骨髄得られたマクロファージのゲノム編集のためのプロシージャを記述する。

要約

マウス由来の骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、組織マクロファージの複雑な生物学を研究するための重要なツールです。初代細胞として、不死化マクロファージ細胞株よりもin vivo でのマクロファージの生理機能を忠実にモデル化し、すでに定義された遺伝的変化を持つマウスに由来することができます。しかし、BMDMの遺伝子機能を破壊することは、依然として技術的に困難である。ここでは、遺伝子機能を破壊するフレームシフト変異をもたらす小さな挿入および欠失(インデル)の導入を可能にする、BMDMにおける効率的なCRISPR/Cas9ゲノム編集のプロトコルを提供します。プロトコルは単一ガイドRNA (sgRNA-Cas9)を総合し、electroporationによって渡すことができる浄化されたsgRNA-Cas9のribonucleoproteinの複合体(RNPs)を形作る方法を記述する。また、ルーチンのサンガーシーケンシングと無料で入手できるオンライン分析プログラムを使用して、編集効率を監視するための効率的な方法も提供します。プロトコルは1週間以内に実施でき、プラスミド構築は必要ありません。通常、85%から95%の編集効率が得られます。

概要

マクロファージは、組織の修復と免疫に重要な役割を果たす自然免疫細胞です^1,2。マウスRAW 264.7細胞やヒトTHP-1細胞などの不死化マクロファージ細胞株は、RNA干渉またはCRISPR/Cas9 ^3,4用のベクターを送達することによる、堅牢な増殖や遺伝子破壊の容易さなど、いくつかの有益な特性を持っています。しかし、発がん性形質転換はそれらの生理機能を劇的に変化させ、その結果、いくつかの経路の異常な活性化と他の経路の応答の抑制が生じます^5,6。初代骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、in vivoマクロファージの生理機能をより厳密に再現しているが、これらの初代免疫細胞におけるプラスミドトランスフェクションとウイルス形質導入の両方の効率が低いため、遺伝子操作は依然として困難である^7,8。したがって、遺伝子機能を破壊するためのより効率的な方法が必要です。

CRISPR/Cas....

プロトコル

1. sgRNAの設計

注:このステップでは、標的配列の選択とsgRNAの設計について説明します。最初の大きなコードエクソンにあるガイドを設計することは、翻訳されたタンパク質がオープンリーディングフレームの早い段階で破壊されるようにするのに役立ちます。また、同じエクソン内にあるターゲット配列を選択することで、編集効率の解析が効率化されます(ステップ6)。このプロトコルで提供されるゲノム編集の例では、 Src 遺伝子と Cblb遺伝子 の最初のエクソン、およびマウスゲノムの非コード Rosa26 遺伝子座を標的とするsgRNAを使用しました。

1. いくつかの無料のオンライン設計ツールの1つを使用して、標的とする20のヌクレオチドゲノム配列を同定します(表1)。Cas9活性は選択した特定のガイドによって異なり、高活性ガイドの 先験的 予測は不可能であるため、各遺伝子内で重複しない4〜5つのガイドを選択します。
   注:ターゲット遺伝子座の配列に対するガイドの適切な向きを確保することが重要です。設計ツールは通常、どの染色体鎖を標的とするかに関係なく、5'から3'の配向でガイド配列を提供します。鎖の配向を確認するには、標的ゲノム配列の3'のすぐそばに 化膿菌 Cas9(nGG)のプロトスペーサー隣接モチーフ(P....

ディスカッション

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いたゲノム編集は、BMDMの遺伝子機能を効果的に破壊することを可能にします。編集効率は、標的配列や遺伝子によって異なります。典型的には、4〜5個のsgRNAをスクリーニングして、活性の高いものを同定する。一部の遺伝子座は編集効率が低く、おそらくクロマチン構造が原因です。このような場合は、編集効率を高めるためにいくつかの変更を?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-MCSF Cell Line	Gift from Russell Vance	not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer	IDT	1075915
Ampure XP Reagent Beads	Beckman Coulter	A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)	Thermo Fisher	14040-133
DPBS -Ca/Mg	Thermo Fisher	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
Fetal Calf Serum (FCS)	Corning	35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer	Agilent	600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2040S
LoBind conical tubes 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
Neon Transfection System	Thermo Fisher	MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips	Thermo Fisher	MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA	Lonza	BE02017F
Proteinase K	Thermo Fisher	EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI	NEB	B6004S
Ribolock	Thermo Fisher	EO0384
RNA loading dye	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S. pyogenes Cas9-NLS	University of California Macro Lab	not applicable	Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation	IDT	1081059
SAP	NEB	M0371S