膵臓癌細胞のミトコンドリアの微細構造変化を可視化する3次元技術

要約

このプロトコルは、ミトコンドリアクリステを再構築して、高精度、高解像度、および高スループットの3Dイメージングを実現する方法について説明します。

要約

未知の情報が豊富であるだけでなく、3次元(3D)の視点から洗練された細胞小器官の微細構造の動的特徴を理解することは、機構研究にとって重要です。電子顕微鏡(EM)は、優れたイメージング深度を提供し、高解像度の画像スタックの再構築を可能にして、ナノメートルスケールでも細胞小器官の微細構造形態を調査できます。したがって、3D再構築は、その比類のない利点のために重要性を増しています。走査型電子顕微鏡(SEM)は、連続したスライスの同じ関心領域から大きな構造を3Dで再構築できるハイスループット画像取得技術を提供します。したがって、細胞小器官の真の3D微細構造を復元するための大規模な3D再構成におけるSEMの適用はますます一般的になっています。このプロトコルでは、膵臓癌細胞のミトコンドリアクリステを研究するために、連続超薄切片と3D再構成技術の組み合わせを提案します。これらの技術がどのように実行されるかの詳細は、オスミウム-チオカルボヒドラジド-オスミウム(OTO)法、シリアル超薄切片イメージング、および視覚化表示を含む、このプロトコルで段階的に説明されています。

概要

ミトコンドリアは細胞内で最も重要な細胞小器官の1つです。それらは細胞の生体エネルギーと代謝の中心的なハブとして機能し^1,2、癌において重要な役割を果たします³。膵臓がん(PC)は、その急速な広がりと高い死亡率のために、治療が最も困難ながん^の1つです4。主にミトコンドリアの形態の変化によって引き起こされるミトコンドリア機能障害^3,5,6,7は、^PC8の根底にある疾患メカニズムに関連しています。ミトコンドリアも非常に動的であり、これはネットワーク接続とクリステ構造の頻繁かつ動的な変化に反映されています⁹。クリステ構造の再形成は、ミトコンドリア機能と細胞状態に直接影響を与える可能性があり^10,11、腫瘍細胞の成長、転移、および腫瘍微小環境の変化中に著しく変化します^12,13<....

プロトコル

1.材料の準備

1. 12 mLのDMEM培地(10%ウシ胎児血清および100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン)で2 x 10⁶ Panc02細胞を培養し、5%二酸化炭素および95%空気の雰囲気下で37°Cおよび95%湿度で48時間維持します。
2. Panc02細胞を回収し、28 x g で2分間遠心分離した後、上清を廃棄します。サンプルが適切なサイズ(1 x 10⁷ セル)であることを確認してください、そうしないと、次の固定および脱水手順がうまく機能しません。
3. 固定液として1 mLの2.5%グルタルアルデヒドを添加し、新鮮なPanc02細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに4°Cで一晩固定します。
   注意: サンプルは、次の各ステップ(ステップ1.3〜1.11)で1,006 x g で5分間遠心分離する必要があります。
4. 固定液を吸引し、サンプルを0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回すすぎ、次に室温で二重蒸留水(_ddH2O)でそれぞれ10分間2回すすぎます。
5. 1%四酸化オスミウム(OsO₄)と1.5%フェロシアン化カリウムを含む溶液50 μLを1:1の比率で4°Cで1時間加えます。その後、毎回0.1 M PBSで10分間2回すすぎ、さらにddH₂

ディスカッション

ここで紹介する方法は、連続した超薄膜切片から生成された2D断層画像の積層とセグメンテーションに電子顕微鏡と画像処理技術を適用することを含む3D再構成技術を適用するための有用なステップバイステップガイドです。このプロトコルは、高解像度レベルでの構造の強力な再現性とより高い精度の利点を持つオルガネラ微細構造の3D視覚化によって対処できる2D画像の限界を強調してい?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2