マウス心不全モデルにおける心拍数依存性拡張期機能の評価のためのペーシング制御手順

要約

本プロトコルは、心不全のマウスモデルにおける拡張期機能の評価における貴重なツールとして役立つ経食道ペーシングによる圧力と体積の関係の取得について記述している。

要約

駆出率が保たれた心不全(HFpEF)は、拡張期機能障害と運動不耐症を特徴とする状態です。ヒトの拡張期機能障害の検出やHFpEFの診断には、運動ストレスによる血行動態検査やMRIが用いられますが、マウスモデルを用いた基礎研究では限界があります。この目的のために、マウスではトレッドミル運動テストが一般的に使用されていますが、その結果は体重、骨格筋力、および精神状態によって影響を受ける可能性があります。ここでは、心拍数(HR)依存的な拡張期パフォーマンスの変化を検出するための心房ペーシングプロトコルについて説明し、HFpEFのマウスモデルでその有用性を検証します。この方法では、麻酔、挿管、および心房ペーシングに付随する圧力-容積(PV)ループ分析を実行します。この研究では、コンダクタンスカテーテルを左心室頂端アプローチ で 挿入し、心房ペーシングカテーテルを食道に配置しました。ベースラインのPVループは、HRがイバブラジンで遅くなる前に収集されました。PVループは、心房ペーシング を介して 400bpmから700bpmの範囲のHR増分で収集および分析されました。このプロトコルを用いて、代謝誘発性HFpEFモデルにおけるHR依存性拡張期障害を明確に示しました。弛緩時定数(Tau)と拡張末期圧力-容積関係(EDPVR)は、対照マウスと比較してHRが増加するにつれて悪化しました。結論として、この心房ペーシング制御プロトコルは、HR依存性心機能障害の検出に役立ちます。この研究は、HFpEFマウスモデルにおける拡張期機能障害の根本的なメカニズムを研究する新しい方法を提供し、拡張期障害に対する新しい治療法の開発に役立つ可能性がある。

概要

心不全は世界中の入院と死亡の主な原因であり、駆出率が保たれた心不全(HFpEF)は心不全診断全体の約50%を占めています。HFpEFは拡張期機能障害と運動耐性障害を特徴とし、拡張期機能障害などの関連する血行動態異常は、運動ストレス血行動態検査またはMRIスキャンによって明確に検出できます^1,2。

しかし、実験モデルでは、HFpEFに関連する生理学的異常を評価するために利用可能なモダリティは限られています^3,4。トレッドミル運動テスト(TMT)は、運動ストレス心臓の血行動態を反映する可能性のあるランニング時間と距離を決定するために使用されます。ただし、この方法は、体重、骨格筋力、精神状態などの外部変数からの干渉を受けやすいです。

これらの制限を回避するために、心拍数(HR)に基づいて拡張期パフォーマンスの微妙だが重要な変化を検出する心房ペーシングプロトコルを考案し、HFpEF⁵のマウスモデルでその有用性を検証しました。交感神経やカテコールアミン反応、末梢血管拡張、内皮反応、心拍数など、いくつかの生理学的要因が運動関連の心機能に寄与しています⁶。しかし、これらのうち、心拍圧関係(ボウディッチ効果とも呼ばれる)は、心臓の生理学的特徴の重要な決定要因として知られています^7,8,9。

このプロトコルでは、ベースラインで従来の圧力-容積分析を実行して、収縮期および拡張期機能を評価することが含まれます 圧力発生速度(dp / dt)、収縮末期圧力-容積関係(ESPVR)、および拡張末期圧力-容積関係(EDPVR)などのパラメーター。ただし、これらのパラメータはHRの影響を受け、固有の心拍数の違いにより動物間で異なる可能性があることに注意してください。さらに、HRに対する麻酔の影響も考慮する必要があります。これに対処するために、心房ペーシングをイバブラジンと同時に投与することでHRを標準化し、心拍数の増加で心臓パラメータ測定を実施しました。注目すべきは、HR依存性心筋反応がHFpEFマウスと対照群マウスを区別したのに対し、ベースラインのPVループ測定(内因性心拍数^{を使用)では}有意差は認められなかったことです5。

このペーシングプロトコルは比較的複雑に見えるかもしれませんが、よく理解すれば成功率は90%を超えます。このプロトコルは、HFpEFマウスモデルにおける拡張期機能障害の根本的なメカニズムを研究し、この状態の新しい治療法の開発に役立つ有用な方法を提供します。

プロトコル

この動物実験計画書は、動物実験委員会で承認され、東京大学の動物実験等に関する規定に従ったものです。本研究では、8-12週齢の雄のC57/Bl6Jマウスを用いた。動物は市販の供給源から入手しました( 資料表を参照)。HFpEFのモデルは、前述のように、NG-ニトロ-L-アルギニンメチルエステルと組み合わせて高脂肪食を15週間投与することによって確立されました¹⁰。

1. カテーテルの準備と圧力/容量の校正

1. コンダクタンスカテーテルを生理食塩水に挿入し、PowerLab 8/35と圧力-体積ユニット(MPVSモジュール、 材料表を参照)で構成されるモジュールに取り付けます。
2. MPVSモジュール^3,11に所定の圧力(0mmHgおよび^100mmHg)および体積パラメータ(これらはMPVSモジュールによって異なる)を記録して、圧力と体積を電子的に較正する(製造元の指示も参照)。

2. カテーテル挿入のための動物の準備

1. 麻酔と換気
   1. 挿管の5〜10分前に、5 mg / kgのエトミデートと500 mg / kgのウレタンの腹腔内注射を投与します( 材料表を参照)。
      注:ウレタンは、動物実験では麻酔薬として有効ですが、ヒトに対して発がん性があると疑われています。したがって、ウレタンが実験目的の達成に必要であり、代替剤が十分でない場合は、取り扱いに注意する必要があります。準備中は、手袋やマスクの着用、ドラフトの使用など、適切な保護対策が義務付けられています。可能な代替として、ケタミン(80 mg / kg、ip)が採用される可能性があります。
   2. 2%イソフルランで飽和させた麻酔チャンバーにマウスを置き、麻酔導入時に38°C〜40°Cに維持された予め温めた加熱パッドに動物を移します。
   3. 手術部位を剃ります。次に、ベタジンとアルコールを交互に3回投与して手術部位を消毒します。
   4. 首を水平に切開(1〜2cm)し、気管の筋肉を切除し、気管を露出させます。外科用2-0シルク縫合糸を気管の下に通し、気管を持ち上げ、小さな切開(1〜2 mm)して開きます。
   5. 気管内に気管内チューブを挿入し、100%酸素と2%イソフルランの混合物を送達する人工呼吸器に接続します(後で0.5%から1%に減らします)。
2. 中心静脈(CV)カテーテルの挿入と輸液注入
   1. 胸鎖乳突筋^の下にある内頸静脈を見つけます3。
   2. 30 Gの針に取り付けられたPE-10シラスティックチューブ( 材料表を参照)で構成される中心静脈カテーテルを頸静脈に挿入します。
   3. 体重10%アルブミン/ NaClの5〜6μL / gのボーラス注入を3分間投与し、その後5〜10μL / minの一定の注入速度で投与します。.
      注:このステップは、麻酔によって引き起こされる末梢血管拡張に起因する低血圧を防ぐために重要です。内頸静脈は胸鎖乳突筋と頸動脈の間に位置し、動脈よりも色が濃く見えます。

3.左心室カテーテル法(開胸法)の外科的処置

1. 麻酔をかけたマウスの手術部位を剃ります。次に、ベタジンとアルコールを交互に3回投与して手術部位を消毒します。
2. つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。次に、剣状突起の下に水平切開(2〜3 cm)を行い、鈍いハサミを使用して皮膚を胸壁から分離します。
3. 電気焼灼を使用して胸壁の両側を横方向に切断します( 材料表を参照)。
4. 横隔膜を切開して心臓を露出させ、鉗子を使用して心膜を心臓からそっと取り除きます。
5. 左心室(LV)の頂点に27Gの針を挿入し、穿刺穴 から コンダクタンスカテーテルをLVに逆行性に挿入します。
6. 正方形の圧力-体積ループが得られるようにカテーテルの位置を調整します。
7. 下大静脈(IVC)閉塞時のPVループの形状を確認することで、負荷条件の変化が生じた際にカテーテルが乳頭筋に接触しないことを確認します。
   注意: 適切な心臓への曝露は、手順を容易にし、クリアな視界を得るのに役立ちます。

4.PVループデータを記録し、収縮末期圧力-容積関係(ESPVR)および拡張末期圧力-容積関係(EDPVR)を決定する

注:IVCオクルージョンによってプリロードを減らすことで、ESPVRとEDPVRの決定が可能になります。

1. 信号安定化後(カヌレーション後5〜10分)に、LabChartソフトウェア( 材料表を参照)、PowerLab、およびMPVSモジュールを使用して、ベースラインの圧力-体積(PV)ループを記録および分析します。
2. 鉗子でIVCを圧縮してIVC閉塞を実行し、IVC閉塞中に少なくとも20心臓サイクルのPVループを記録します。PVループの収縮期末点を通る線形回帰直線をフィッティングしてESPVRを決定し、LabChartソフトウェアを使用してPVループの拡張期末点を通る曲線線フィッティングしてEDPVRを決定します。
   注意: 肺の動きのアーチファクトを防ぐために、IVC閉塞中は人工呼吸器を停止してください。パンクロニウム(0.5-1 mg / kg)などの麻痺薬は、肺の動きが過剰である場合に役立つ可能性があり、安定した麻酔面が確認された後にのみ使用する必要があります。.

5.経食道ペーシング

1. 2-Fr四極電極カテーテルを食道に挿入し、カテーテルをパルス刺激装置に接続し( 材料表を参照)、心房捕捉閾値を決定します(通常、刺激振幅は3mA、パルス幅は1msです)。
2. 腹腔内に投与された20 mg / kgのイバブラジン( 材料表を参照)を使用して、HRを400ビート/分未満に減速します。.
3. 安定化後、400 拍/分から 700 拍/分までのさまざまなペーシング速度で、100 拍/分ずつ増分して、PV ループの 20 回の連続心臓サイクルを取得します。各ペーシングレートで5分以上のサイクルを取得します。

6.生理食塩水校正と大動脈流量校正

1. 人工呼吸器を不活性化し、CVカテーテルを介して5〜10μLの高張生理食塩水を静脈内投与します。.
2. 生理食塩水注入中の圧力と容量の変動を記録し、PowerLab ^3,11 を使用して Vp 値を計算します。
3. 生理食塩水の校正を繰り返して、精度と再現性を高めます。
4. 音量信号を乱さないように、マウスを左側に回します。
5. 脊椎に向かってTh3からTh5の間で外側開胸術を行い、鉗子で下行大動脈のごく一部を静かに解剖します。
6. 血管流量プローブ( 材料表を参照)を大動脈の上に置き、心拍出量を測定します。
   注:絶対体積を正確に計算するには、生理食塩水校正と大動脈流量校正の2種類の校正を使用する必要があります。過剰な塩負荷は収縮性の低下をもたらす可能性があるため、動物被験者への高張生理食塩水注入に関連する潜在的なリスクを認識することが重要です。.

7.安楽死

1. 研究後、子宮頸部脱臼 による 麻酔薬の過剰摂取下でマウスを安楽死させます。
   注:生命機能の完全な停止を確実にするために、麻酔下での放血とその後の心臓組織採取など、安楽死の二次的な方法が採用されています。

結果

ベースラインのPVループデータを図1と表1に示します。ベースライン時(ペーシングなし)では、対照マウスとHFpEFマウスの間で、緩和時定数(Tau)、最小圧力変化率(dP/dt min)、EDPVRなどの拡張期パラメータに有意差はありませんでした。しかし、HFpEFマウスは、図1に示すように、より高い血圧と動脈弾性(Ea)を示し、心室収縮期に典型的な山?...

ディスカッション

経食道ペーシングの適用による圧力と体積の関係を評価する方法論を提示します。運動不耐症はHFpEFの重要な特徴の1つですが、運動中のマウスの心機能を評価するための技術はありません。私たちのペーシングプロトコルは、安静状態では明らかではない拡張期機能障害を検出するための貴重なツールを提供します。

正確で一貫した品質のPVループを実現するには、次の...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture, sterlie	Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan	62-9965-57	Surgical Supplies
2-Fr tetrapolar electrode catheter	Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan	custom-made	Surgical Supplies
Albumin Bovine Serum	Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan	01859-47	Miscellaneous
C57/BI6J mouse	Jackson Laboratory		animals
Conductance catheter	Millar Instruments, Houston, TX	PVR 1035
Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit	ellman-Japan,Osaka, Japan	1-1861-21	Surgical Supplies
Etomidate	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	E0897	Anesthetic
Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator	Astro-Med, West Warwick, RI		Pacing equipment
Isoflurane	Viatris Inc., Tokyo, Japan	8803998	Anesthetic
Ivabradine	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	I0847	Miscellaneous
LabChart software	ADInstruments, Sydney, Australia	LabChart 7	Hemodynamic equipment
MPVS Ultra	Millar Instruments, Houston, TX	PL3516B49	Hemodynamic equipment
Pancronium bromide	Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO	15500-66-0	Anesthetic
PE10 polyethylene tube	Bio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan	62101010	Surgical Supplies
PowerLab 8/35	ADInstruments, Sydney, Australia	PL3508/P	Hemodynamic equipment
PVR 1035	Millar Instruments, Houston, TX	842-0002	Hemodynamic equipment
Urethane (Ethyl Carbamate)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	050-05821	Anesthetic
Vascular Flow Probe	Transonic, Ithaca, NY	MA1PRB	Surgical Supplies